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.2008年6月；29(17):2597-607.
doi:10.1016/j.biomaterials.2008.02.005。 Epub 2008年3月14日。

基质硬度和RhoA对三维生物合成水凝胶系统中平滑肌细胞表型可塑性的影响

雪莉·R·佩顿 1, 彼得·D·金, Cyrus M Ghajar公司, Dror Seliktar公司, 安德鲁·普特南
附属公司

基质硬度和RhoA对三维生物合成水凝胶系统中平滑肌细胞表型可塑性的影响

雪莉·R·佩顿等。 生物材料. 2008年6月.

摘要

使用二维培养的研究表明，细胞外基质（ECM）的机械特性影响细胞迁移、扩散、增殖和分化；然而，三维细胞力学传感仍处于探索之中。为了研究这一主题，采用了一种基于聚乙二醇结合纤维蛋白原的独特生物材料系统来研究平滑肌细胞（SMC）的表型可塑性，作为三维ECM力学的功能。在448和5804 Pa之间调节压缩模量，适度调节SMC细胞骨架的三维组装，长时间培养后，硬基质中的扩散细胞的F-actin捆绑程度稍高。然而，在所有三维条件下，vinculin的表达在质量上都很低，并且没有组装成典型的二维培养中常见的典型局灶性粘连。鉴于RhoA介导的细胞骨架收缩性是机械感觉中的一个关键节点，我们通过诱导SMCs表达组成性活性RhoA来上调收缩性。在这些细胞中，F-actin捆绑和总vinculin表达增加，并且开始出现局部粘连样结构，这与RhoA在培养在二维底物上的细胞中的作用机制一致。此外，SMC在3D中的增殖并不明显依赖于基体刚度，并且通过RhoA的本构激活而减少，与ECM的机械性能无关。相反，收缩标记的表达随着组成性RhoA的激活而整体增加，并且仅依赖于RhoA活性增强的细胞中的三维基质刚度。这些数据综合起来表明，ECM力学和RhoA活性对三维SMC表型的协同作用与二维SMC表型不同，并突出了研究可调三维环境中细胞-基质相互作用的力学作用的重要性。

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数字

图1
图1。PEG-纤维蛋白原交联密度调节微环境并保持SMC活性
A.）显示了PEG-纤维蛋白原水凝胶及其合成的示意图。1.）完全异源三聚纤维蛋白原蛋白包含纤溶酶敏感序列（黑色箭头）和二硫键（绿色箭头）。2.）PEG-纤维蛋白原凝胶的合成涉及将异源三聚体分解为其代表性的α、β和γ链（显示了一个代表性链）。然后通过Michael型加成反应将这些链聚乙二醇化，在纤维蛋白原单体中的二芳基聚乙二醇和半胱氨酸残基之间形成硫醇键。3.）在存在光引发剂的情况下暴露于紫外线后，PEGDA上剩余未反应的丙烯酸酯端基被诱导一起反应，或与额外的外源PEGDA反应（本研究中高达2%重量），形成交联水凝胶网络。B.）列出了所有实验中使用的PEG-纤维蛋白原水凝胶的纤维蛋白原和丙烯酸PEG的平均浓度。纤维蛋白原浓度使用Pierce BCA蛋白质分析法测定，PEGDA浓度通过冷冻干燥和称重已知体积的产品测定。C.）通过增加外源交联PEGDA的量，PEG-纤维蛋白原水凝胶的压缩模量从448 Pa增加到5804 Pa（按重量计）。通过使用MTS Synergie 100连续五次压缩每个样品，并从应力-应变曲线的线性区域提取值（总应变的0-4%），确定压缩模量。*表示相对于0%条件的统计显著性（P<0.005）。D.）显示了在蔡司Ultra 55 SEM上拍摄的固定、速冻、冻干和碳沉积脱细胞PEG-纤维蛋白原水凝胶的典型扫描电子显微照片。图A和图B是448帕的凝胶，图C和图D是5408帕的胶体。图像顶行中的比例尺为10µm。最下面一行中的比例尺为1µm。E.）随后使用Molecular Probes的LIVE/DEAD Viability试剂盒对在PEG-纤维蛋白原水凝胶中培养1、7或14天的SMC进行染色。数据表示每个条件和时间点的几个图像的量化。PEG-纤维蛋白原水凝胶的数据之间没有统计差异。PEG-RGDS构建物的活性分析（改编自[10]），并作为对照平行进行。
图2
图2。三维SMC中基质刚度对细胞骨架组装的影响较小
在不同硬度的PEG-纤维蛋白原水凝胶中培养的SMC被固定，并染色以检测维酮（红色）和F-肌动蛋白（绿色）。A.）SMC在培养1天后没有完全扩散，也没有显示F-actin捆绑的迹象。B）7天后，SMC完全扩散，并显示出一些F-actin捆绑。高倍图像（顶行）显示，在培养14天后，较硬基质中的F-actin捆绑质量较高。然而，在所有时间点和刚度条件下，明显缺乏典型的点状局灶性粘附结构，如通常在二维底物上看到的那样，用vinculin染色表示。顶行的比例尺=10µm，底行=50µm。
图3
图3。RhoA调节SMC三维细胞骨架组装
表达组成活性V14-RhoA的SMCs在不同硬度的PEG-纤维蛋白原构建物中培养7天，然后染色F-actin（A，红色）和vinculin（B，红色）。共表达的GFP在A和B中均显示为绿色。白色箭头表示在表达V14-RhoA的SMC中富含长春花蛋白的局灶性粘附样结构的证据。C.）表达V14-RhoA和野生型SMC的第7天细胞裂解液中的小细胞蛋白的代表性Western blot（从左到右，C=448 Pa，非转导对照，然后是从左到右侧压缩模量增加的V14-RhonA样品）。Western blot定量，*表示与第7天448 Pa条件相关的统计显著性（N=6个单独的实验；误差条表示SEM）。
图4
图4。ECM刚度与三维活性RhoA结合对SMC增殖的影响
SMC在不同硬度（448 Pa=红色，1008=绿色，2306=蓝色，5408=黑色）的PEG-纤维蛋白原水凝胶中培养，并通过Hoechst染料量化其DNA含量。含有野生型SMC（实线）或表达V14-RhoA的SMC（虚线）的结构在播种后1、3、5、7、10和14天进行分析。数据表示每个实验的平均值±SEM，N=2凝胶，每个条件下N≥4个单独实验。*表示在相同刚度条件下相对于第1天计数的统计显著性。#表示野生型和V14-RhoA细胞在任何给定条件下的统计显著性（P≤0.05）。
图5
图5。当RhoA活性高时，三维SMC分化标记的表达随着ECM刚度的增加而增加
SMC在不同硬度的PEG-纤维蛋白原水凝胶中培养7或14天，然后通过Western blotting和免疫荧光染色分析其分化状态。对SMC分化特异性的两种标记物，α-肌动蛋白（A）和钙调蛋白（B）的定量蛋白质印迹分析显示，它们的表达受周围3D基质硬度的调节，但仅与组成型活性RhoA结合。显示的定量值与第7天448 Pa的表达有关，无V14-RhoA转导。*表示448 Pa非传递条件下的统计显著性。C）在3-D PEG-纤维蛋白原培养7天后，固定野生型和V14-RhoA SMC，免疫荧光染色α-actin和calponin，并用共焦显微镜观察。在顶行中，α-actin=绿色，calponin=红色（野生型SMCs）；中间一行，α-actin=红色（V14-RhoA SMCs）；底行，calponin=红色（V14-RhoA SMC）。比例尺=10µm。
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