Image correlation spectroscopy of multiphoton images correlates with collagen mechanical properties

doi:10.1529/biophysj.107.120006

.2008年3月15日；94(6):2361-73.

doi:10.1529/biophysj.107.120006。 Epub 2007年12月7日。

多光子图像的图像相关光谱与胶原蛋白力学性能相关

克里斯托弗·劳布¹, 杰·恩鲁, 维诺德·苏雷什, 塔蒂亚娜·克拉西瓦, 托尔·林德莫, 恩里科·格拉顿, 布鲁斯·特隆伯格, 史蒂文·乔治

附属公司

PMID： 18065452
预防性维修识别码： PMC2257909型
内政部： 10.1529/生物物理.107.120006

多光子图像的图像相关光谱与胶原蛋白力学性能相关

克里斯托弗·劳布等。生物物理学J. 2008.

.2008年3月15日；94(6):2361-73.

doi:10.1529/biophysj.107.120006。 Epub 2007年12月7日。

作者

克里斯托弗·劳布¹, 杰·恩鲁, 维诺德·苏雷什, 塔蒂亚娜·克拉西瓦, 托尔·林德莫, 恩里科·格拉顿, 布鲁斯·特隆伯格, 史蒂文·乔治

附属

¹美国加利福尼亚州欧文市加利福尼亚大学生物医学工程系，邮编92697。

PMID： 18065452
预防性维修识别码： PMC2257909型
内政部： 10.1529/生物物理.107.120006

摘要

多光子显微镜（MPM）有望作为一种非侵入性成像技术，通过成像二次谐波（SHG）和双光子荧光来表征工程结缔组织和真实结缔组织中的胶原结构，从而表征其力学性能。通过控制聚合pH值来控制胶原蛋白凝胶的微观结构，我们使用标准方法和MPM、扫描电子和暗场显微镜图像上的图像相关光谱（ICS）来量化孔隙和纤维尺寸。后两种技术用于确认MPM图像的显微结构测量。当聚合pH值从5.5增加到8.5时，平均纤维直径从3.7+/-0.7微米减小到1.6+/-0.3微米，平均孔径从81.7+/-3.7微米（2）减小到7.8+/-0.4微米（2，而剪切模量的组成部分储能模量G’和损耗模量G’’分别增加了约33倍和约16倍。使用ICS测量的特征长度标度W（ICS）与SHG图像中的平均纤维直径有很好的相关性（R（2）=0.95）。半柔性网络理论预测了胶原蛋白凝胶储存模量（G'）随网孔尺寸和纤维直径的缩放关系，这是使用ICS从SHG图像中估计的。我们得出结论，MPM和ICS是一种有效的组合，可以以无创、客观和系统的方式评估胶原蛋白水凝胶的体积力学性能，并且可能对特定的体内应用有用。

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数字

图1
(一)SHG代表(左列,蓝色)和TPF(*中间立柱*,绿色)在pH 5.5、6.5、7.5和8.5下聚合的胶原蛋白水凝胶的图像。图像为512×512像素和230×230像素μ米。n个=每种情况下使用12张图像进行微观结构量化和统计。条形代表50μ米(b条)pH相关的纤维直径频率分布由n个分别为pH 5.5、6.5、7.5和8.5条件下的358、605、564和492个纤维直径测量值。(*c（c）*)平均孔径(d日)孔隙面积分数，以及(*e（电子）*)从噪声阈值、反向SHG或合并（SHG+TPF）图像中量化每个聚合条件下的孔密度。符号（*和#）表示聚合pH值组之间的统计显著性。

图2
(一)典型的SEM图像显示了20000倍放大率下的胶原蛋白网络和纤维特征(左列;酒吧代表2μm）和100000倍放大倍数(*右立柱*;酒吧代表500 nm）。n个=9、9、9和6 20000×图像用于显微结构量化和统计。(b条)pH相关的纤维直径频率分布由n个分别=pH 5.5、6.5、7.5和8.5条件下的477、513、629和905纤维直径测量值。(*c（c）*)根据噪声阈值化的倒置SEM图像，对每个聚合条件下的平均孔径、孔面积分数和孔密度进行量化。符号（*、#和§）表示聚合pH值组之间的统计显著性。

图3
(一)使用ImageJ的线图特征，从pH 5.5（•）、6.5（△）、7.5（+）和8.5聚合的均质胶原水凝胶的暗场图像中量化分离胶原纤维的长度和直径(▪). 图中的每个点表示一根光纤的长度和直径。n个在每个聚合条件下测得=108根纤维。线表示与每个聚合条件的数据的线性最佳拟合。(b条)在每个pH值条件下，从暗场图像测量的平均纤维长宽比。误差线表示标准偏差。符号（*）表示pH条件之间的统计显著性。

图4
(一)共定位SHG和TPF像素的百分比，从n个=相对于总SHG和TPF信号包含像素，每个聚合条件下有12个成对、减去噪声的SHG和TSF图像。(b条)代表性阈值TPF图像的遮罩，显示圆形度为0-0.1的粒子轮廓。(*c（c）*)代表性阈值TPF图像的掩模，显示圆形度为0.5–1的颗粒轮廓。(d日)将前两个掩模分别应用于经过降噪处理的TPF图像或其SHG对应图像后，圆形度为0–0.1的椭圆粒子内的平均信号(*上海通用汽车*_{e（电子）},*TPF公司*_{e（电子）})除以0.5–1圆形颗粒内的平均信号(*上海通用汽车*_c（c）,*TPF公司*_c（c）). 误差线表示标准偏差。(*e（电子）*)以任意单位估计胶原纤维轴相对于激光传播方向的各种倾斜角度，δ：图中显示了倾斜10°和63°的光纤。

公式图像 — 图4
(一)共定位SHG和TPF像素的百分比，从n个=相对于总SHG和TPF信号包含像素，每个聚合条件下有12个成对、减去噪声的SHG和TSF图像。(b条)代表性阈值TPF图像的遮罩，显示圆形度为0-0.1的粒子轮廓。(*c（c）*)代表性阈值TPF图像的掩模，显示圆形度为0.5–1的颗粒轮廓。(d日)将前两个掩模分别应用于经过降噪处理的TPF图像或其SHG对应图像后，圆形度为0–0.1的椭圆粒子内的平均信号(*上海通用汽车*_{e（电子）},*TPF公司*_{e（电子）})除以0.5–1圆形颗粒内的平均信号(*上海通用汽车*_c（c）,*TPF公司*_c（c）). 误差线表示标准偏差。(*e（电子）*)以任意单位估计胶原纤维轴相对于激光传播方向的各种倾斜角度，δ：图中显示了倾斜10°和63°的光纤。

图5
克'和克胶原蛋白水凝胶的“，通过平行板流变仪测量，随聚合pH值变化。克'（•）和克在5%菌株和10 s条件下收集〃（aw）⁻¹振动剪切频率n个=48个水凝胶，在pH 5.5–9.0下聚合。线表示数据的线性最佳拟合克'和for克″. 符号*表示最佳拟合斜率之间存在显著差异；符号#和§表示每个斜率与零的斜率有显著差异。

图6
一幅512×512 SHG图像(一,*未经加工的*)未处理(b条,惠普)高通量过滤(*c（c）*,*有限合伙人*)低通滤波(d日,*NS公司*)减噪，以及(*e（电子）*,*Th（第个）*)用ICS分析阈值(*f–j*)绘制的ACF、高斯拟合和残差χ²残差上方报告的拟合值。(k个)*W公司*_{内部控制系统}从每个高斯拟合中。

图7
(一)使用ICS分析SEM图像*W公司*_{内部控制系统}与手工测量的纤维直径的几何平均值相比，d日_扫描电镜.x个轴误差条表示1σ几何平均值周围的下限和上限。(b条)阈值（Th）、减噪（NS）和未处理（RAW）SHG图像通过ICS和手动测量进行分析；d日_{上海通用汽车}表示SHG图像中手动测量的纤维直径的算术平均值。(*c（c）*)*W公司*_{内部控制系统}作为四个pH值下聚合胶原蛋白的SHG图像阈值的函数进行计算。(d日)阈值、反向SEM和(*e（电子）*)利用ICS对SHG图像进行分析*P（P）*_{内部控制系统}与颗粒分析的平均孔径相比，*P（P）*_PA公司.

图8
存储模量的缩放关系，克'，是使用流变仪数据和ICS、颗粒分析或手工测量SHG图像中网孔尺寸和纤维直径的估计值计算得出的。最佳坡度和对²数值如图所示。

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