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.2007年11月6日；104(45):17692-7.
doi:10.1073/pnas.0707045104。 Epub 2007年10月25日。

Gata2、Fli1和Scl在早期造血发育期间形成一个递归连接的基因调节回路

约翰·皮曼达 1, 凯特琳·奥特斯巴赫, 凯西·克内泽维奇, 莎拉·金斯顿, 陈婉怡, 尼古拉·威尔逊, 约塞特·雷内·兰德里, 安德鲁·德伍德, 安贾·科尔布·科科辛斯基, 安东尼·格林, 大卫·坦纳希尔, 乔治·拉科德, 瓦莱丽·库斯科夫, 伯托尔·戈特根斯
附属公司

Gata2、Fli1和Scl在早期造血发育期间形成一个递归连接的基因调节回路

约翰·皮曼达等。 美国国家科学院程序. .

摘要

脊椎动物身体计划的保存被归因于基因调控网络（GRN）的进化稳定性。我们描述了由Gata2、Fli1和Scl/Tal1及其增强子Gata2-3、Fli1+12和Scl+19组成的调节电路，该调节电路在小鼠胚胎造血规范期间运行。我们发现Fli1+12增强子，像Gata2-3和Scl+19增强子一样，以造血干细胞（HSC）为靶点，并依赖Ets、Gata和E-Box基序的组合。我们发现Gata2-3增强子也使用类似的基序簇，Gata2、Fli1和Scl在胚胎第11.5天HSC起源的背主动脉和它们繁殖的胎肝中表达。这些组织和ES细胞衍生的血管母细胞等效物中的三种HSC增强子都与这些转录因子（TF）结合并形成一个完全连接的三元组，该三元组构成了之前未描述的哺乳动物发育中的网络基序和在哺乳动物干细胞规范期间操作的GRN内核的示例。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
这个FLI1公司+12种造血增强剂以造血干细胞为靶点。(A类)FLI1公司+12增强子将报告基因活性导向血液和血管。（i） 人体示意图FLI1公司轨迹。对应于FLI1公司+用12个区域构建转基因小鼠。（ii–vii）E7.5–E12.5 X-镀锌全安装WT和L5760SV公司/lacZ公司/FLI1公司+12个胚胎。（ii）无染色的E7.5 WT胚胎。（iii）E7.5转基因胚胎在胚胎外造血区域内染色。（iv）E9.5转基因胚胎，心脏室（盒装）和卵黄血管染色（箭头所示）。（v） E11.5转基因胚胎显示FL（箭头）和血管内染色。（vi）E12.5转基因胚胎，卵黄血管染色（箭头所示）。（vii）vi中方框区域的放大视图，显示FL染色（箭头）。（viii–xiii）E11.5的石蜡切片SV公司/lacZ公司/FLI1公司+12胚胎。（viii）DA的矢状切面显示内皮染色。（ix）DA高倍视图，显示造血簇染色（箭头）。（x） FL切片显示造血细胞染色。（xi）通过卵黄囊的x（xii）截面的高倍视图，显示血管壁上有染色。（xiii）心脏切片显示心内膜染色。(B类)流式细胞术检测FDG处理的非转基因和转基因E12.5 FLSV公司/lacZ公司/FLI1公司+12（L5760）×WT十字架。CD150型+/CD48型−/CD41型−细胞在转基因靶向人群中富集。YS，卵黄囊。
图2。
图2。
中的保守Ets和Gata TF结合位点FLI1公司+造血细胞中的活性需要12种增强剂。(A类)的核苷酸序列比对FLI1公司+12个增强子，分别用红色、蓝色和粉红色标记保守的Gata、Ets和E-box位点。核苷酸编号来自翻译起始点。mm，鼠标；hs，人体；医学博士，负鼠。(B类) (左侧)报告人构建的人类WT和突变基因组片段对应于FLI1公司+12增强子。保守的Ets、Gata和E-box位点表示为圆圈（部分保守的虚线边缘），分别编号为E1-8、G1-2和EB；它们在突变处被划掉。(赖特)在416B细胞中对每个构建体进行稳定转染分析的结果。荧光素酶活性是pGL2启动子载体（SV）活性的倍增-卢克)独自一人。(C类)F小结0用多种方法产生的转基因胚胎SV公司/lacZ公司/突变体FLI1公司+12个构造。还显示了具有代表性的X-Gal染色全山E11.5胚胎。（+）到（++++）表示从周/罕见到强X-Gal染色。
图3。
图3。
保守的Ets-TF结合位点大门2-3造血细胞的活性需要增强子。(A类)鼠标示意图加塔2与保守的Gata、Ets和E-box位点进行的位点和核苷酸序列比对分别标记为红色、蓝色和粉红色。−3126/−2631米大门2-3区域包括3.1-kb的5H区域（−3097/−2762）Gata2-EHRD公司(9). 核苷酸编号来自小鼠is外显子。mm，鼠标；hs，人体；医学博士，负鼠。(B类) (左侧)报告者构建人类WT并突变大门2-3基因组片段。保守的Ets位点和E-box分别用编号为E1–E7和EB的圆圈表示；它们在突变处被划掉。(赖特)在416B细胞中对每个构建体进行稳定转染分析的结果。萤光素酶活性以pGL2启动子载体活性的倍数增加（SV-卢克)独自一人。
图4。
图4。
这个大门2-3增强子以出血性主动脉内皮为靶点，需要Ets位点体内活动。(A类)转基因lacZ公司报告者使用WT增强器构建(大门2-3)或具有突变Ets位点（mEts）的增强子大门2-3). E10.5和E11.5 F总数中DA（AGM区域）或中脑染色的胚胎数量0每个构建体产生的转基因胚胎并列在一起。(B类)代表F0用X-Gal染色的胚胎lacZ公司表达式。（i）大门2-3/SV公司/lacZ公司E10.5整体安装，显示DA染色（装箱）。（ii）i中方框区域的放大视图，显示报告者沿DA腹侧表面的集中（箭头）。（iii）与（ii）中区域相对应的组织切片，显示出明显的内皮染色（箭头）。（iv）mEtsGata2-3型/SV公司/lacZ公司E11.5在DA区域显示非特异性染色的完整胚胎（装箱）。（v） iv.（vi）中与v中区域相对应的截面中方框区域的放大视图显示没有内皮染色。(C类)X-Gal染色F的头部放大侧视图0胚胎B类.（i）大门2-3/SV公司/lacZ公司全山胚胎突出lacZ公司表达于后连合（方框箭头）和顶盖神经元进入中脑（箭头）。（ii）mEts大门2-3/SV公司/lacZ公司全山胚胎丧失我acZ染色。上颌部异位染色仅见于六个F中的一个0突变的转基因胚胎。（iii）Scl公司-第七届E3/lacZ公司整个胚胎显示出类似于大门2-3/SV公司/lacZ公司转基因。D、 间脑；ME，中脑；PC，后连合；T、 端脑。
图5。
图5。
Gata2、Fli1和Scl绑定大门2-3,飞行1+12和Scl公司+19体内. (A类)（i和ii）现场Scl表达的杂交。（i） 在AGM水平下通过E11.5胚胎的横向冷冻切片显示在FL、DA（方框）和神经组织中的表达（箭头）。（ii）显示内皮细胞和血簇中表达的方框区域放大图（箭头所示）。（iii和iv）现场Gata2表达的杂交。（iii）通过E11.5胚胎AGM区域的横向冷冻切片，显示Gata2在FL和DA中的表达（装箱）。神经组织中也可见显著的Gata2表达（箭头所示）。（iv）iii中方框区域的放大图，显示Gata2在内皮细胞和血簇中的表达（箭头所示）。（v和vi）现场Fli1表达的杂交。（v） 通过E11.5胚胎AGM区域的横向冷冻切片显示Fli1在FL中表达。（vi）通过AGM区域进行的横向石蜡切片显示内皮和血簇中表达（箭头）。(B类)（i–iii）E11.5胚胎的血祖细胞（416B）和内皮细胞（MS1）系以及原代造血组织（腹主动脉和FL）的ChIP测定。浓缩水平标准化为用对照兔抗体获得的浓缩水平，并绘制为在对照区测量的浓缩水平的倍增(Scl公司+21). (C类)期间Gata2、Fli1和Scl基因表达的变化在体外GFP-Bry ES细胞向EBs的分化。(D类)定量ChIP分析在体外分化的未分类GFP-Bry EBs，其中约49%的细胞为GFP+法兰1+第3天（DP）(SI图7). (E类)造血TF的完全连接三联体。Gata2/Fli1/Scl三联体与假定的引发剂。直接结合相互作用用实线表示。
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