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.2007年7月30日；178(3):477-88.
doi:10.1083/jcb.200704094。 Epub 2007年7月23日。

laforin磷酸酶跨越进化边界，将碳水化合物代谢与神经疾病联系起来

马修·S·绅士 1, Robert H Dowen第三, 卡罗琳·A·沃比, 西玛·马图, 约瑟夫·埃克尔, 杰克·E·狄克逊
附属公司

laforin磷酸酶跨越进化边界，将碳水化合物代谢与神经疾病联系起来

马修·S·绅士等。 J细胞生物学. .

摘要

拉福拉病（LD）是一种进行性肌阵挛性癫痫，导致严重的神经变性，继而死亡。LD的一个特征是称为Lafora小体（LBs）的不溶性多糖的积累。LD是由编码laforin磷酸酶的基因突变引起的，据报道，laforin仅存在于脊椎动物中。我们利用生物信息学筛选鉴定了五个原生动物中的拉福林同源基因。这些原生生物从一种祖先红藻进化而来，合成了一种成分与LBs极为相似的不溶性碳水化合物。此外，我们还表明，缺乏laforin的植物王国拥有一种具有laforin样性质的蛋白质，称为淀粉过剩4（SEX4）。拟南芥SEX4基因突变导致淀粉过剩表型，使人联想到LD。我们证明，智人laforin补充了sex4表型，并提出laforin和sex4是功能等价物。最后，我们发现laforins和SEX4使一种复杂的碳水化合物脱磷酸化，并形成唯一具有这种活性的磷酸酶家族。这些结果为LD的病因提供了分子解释。

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数字

图1。
图1。
拉福林直系亲属。（A） 脊椎动物和原生物拉福林直系动物的排列。以红色突出显示的残留物是CBM20家族定义的高度保守的CBM20残留物（Wang等人，2002），以红色方框显示的残渣是不变的CBM2O残留物，以蓝色方框显示的残余物是DSP催化位点的一部分。框在深灰色中的残基是相同的，框在浅灰色中的残基是保守的取代。星号标记与碳水化合物结合所必需的残基（Wang等人，2002年）。表S2中列出了接入号码（可从以下网址获得http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200704094/DC1). （B） 确定拉福林同源物的策略弓形虫（C）与原生生物相比，全长Hs-laforin和这两个域的相似性和一致性百分比。（D） 与其他脊椎动物相比，全长Hs-laforin及其两个结构域的相似性和一致性百分比。
图2。
图2。
拉福林同源物的生化特性。（A） VHR、Hs-laforin、Hs-laborin–C/S、Cm-laforin和Cm-laforin–C/S在各自最佳pH值下对p-NPP的比活性，野生型。（B） 使用VHR、Hs-laforin、Hs-la forin–C/S、Cm-laforin和Cm-la forin-C/S在其各自的最佳pH值下对支链淀粉进行孔雀石绿测定，测量磷酸盐释放。（A和B）误差条显示平均值±标准偏差。（C）重组组氨酸标记蛋白与5 mg/ml支链淀粉孵育，支链淀粉通过超速离心造粒，通过Western分析显示颗粒（P）和上清液（S）中的蛋白质。VHR（甚高频），智人VHR；Hs，Hs-laforin；Cm，Cm-laforin。突变残基在图1A中用星号标记。（D）非分裂示意图C.梅罗莱细胞，定义叶绿体、线粒体、细胞核和佛罗里达淀粉的位置。细胞固定，与免疫前血清（左）或α-Cm-laforin抗体（右）孵育，并用FITC-结合的α-兔二级抗体进行探测。叶绿体通过自身荧光显示。（E）C.梅罗莱细胞切片，用α-Cm-laforin和α-兔10 nM金结合二级抗体进行探测，并在6000倍放大镜下观察。箭头表示叶绿体，星号表示线粒体的末端，箭头表示佛罗里达淀粉颗粒中的三个。棒材（D），3μm；（E） 500纳米。
图3。
图3。
拉福林的进化谱系。（A） 由色脉假说假设的初级内共生（Cavalier-Smith，1999）。蓝藻（CB）被线粒体原生物吞噬（Cavalier-Smith，1982；Bhattacharya和Medlin，1998）。MT，线粒体。经过一代又一代的时间，基因转移发生在吞噬的蓝藻和原生生物之间，蓝藻被还原成由两层膜结合的质体，含质体的原生生物辐射到植物王国的创始成员体内（Cavalier-Smith，2004）。（B） 由色脉假说假设的次生内共生（Cavalier-Smith，1999）。一种红藻（RA）被线粒体原生生物吞没（Gillott和Gibbs，1980）。随着世代的推移，基因从红藻细胞核和质体转移到原生生物的细胞核，红藻被还原为由三层或四层膜结合的质体，新的原生生物辐射到Chromista王国和肺泡中，它们统称为铬肺泡（Cavalier-Smith，1999）。该数字扩展了Weber等人（2006年）的工作。（C） 拉福林同源物的保护。如材料和方法中所述，生成了小亚单位核糖体RNA序列的系统发育，表S3列出了登录号（可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200704094/DC1). 含有拉福林的生物体被用黄色装箱。绿藻后裔的生物为绿色，海绿藻后裔为蓝色，红藻后裔为红色。羽状叶以灰色为背景。
图4。
图4。
SEX4的保存和生化特性。（A） SEX4的领域地形。cTP，叶绿体靶向肽；双特异性磷酸酶；GBD，糖原结合域。（B） Hs-laforin的DSP校准(Hs公司-DSP）和SEX4的DSP(在-DSP）。蓝色盒子中的残留物是DSP催化位点的一部分，深灰色盒子中的残余物是相同的，浅灰色盒子中是保守的替代物。（C） 家族四个创始成员的AMPKβ-GBD（前四名，用括号标记；Polekhina等人，2003年）和SEX4同源基因的AMPK-β-GDB的对齐。橙色盒装残留物是多种AMPKβ-GBD蛋白中高度保守的氨基酸（Polekhina等人，2003）。深灰色装箱的残留物是相同的，浅灰色装箱的是保守替换。星号标记碳水化合物结合所需的残留物（Polekhina等人，2003年，2005年）。表S5中列出了接入号码（可从以下网址获得http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200704094/DC1). （D） 与SEX4同源序列相比，全长At-SEX4的相似性和一致性百分比，Hs-laforin的DSP与每个SEX4正交序列的DSP，以及Hs-laforin的CBM20与糖原结合域（GBD）以及Hs-AMPKβ1的GBD与每个SEX4同源基因的糖原结合域的相似性百分比。（E） VHR、Hs-laforin、Hs-la forin–C/S、Δ52-SEX4和Δ52S-SEX4-C/S在其各自最佳pH下对p-NPP的比活性。（F）通过孔雀石绿试验测量的磷酸盐释放，该试验使用VHR、Hs-laforin、Hs-laforin–C/S，Δ52_SEX4和△52-SEX4-C/S，在其各自最优pH下对支链淀粉进行测定。（E和F）误差线表示平均值±标准偏差。（G）At-SEX4与支链淀粉结合。重组组氨酸标记蛋白与5 mg/ml支链淀粉孵育，支链淀粉通过超速离心造粒，通过Western分析显示颗粒（P）和上清液（S）中的蛋白质。Δ52-SEX4，SEX4的氨基末端截断；C198S，Δ52-SEX4-C198S；N333K，Δ52-SEX4-N333K；K307Q，Δ52-SEX4-K307Q。
图5。
图5。
Hs-laforin的功能相当于性别4.（A）性别4-3破坏和基因表达。At3g51280位点的示意图，外显子由深灰色方框表示，T-DNA插入被描绘为黑色箭头，SEX4蛋白示意图。小箭头表示用于确认不存在SEX4型成绩单性别4-3植物。RT-PCR结果来自野生型和性别4-3从示意图中分离出mRNA。第1通道，引物集1；车道2，底漆组2；车道3，5′引物来自1，3′引物从2。箭头指示阳性控件的大小UBC5公司（B）转基因的蛋白质表达。用于Western分析的组织样本取自两个独立的T2如图所示，用空载体或HA表位标记的转基因植物转化。在每条通道中装载30 mg全组织裂解物。（C） 淀粉过剩表型的补充。相同两个独立T中的一个叶2如图4B所示的植物用热乙醇脱色并用碘染色。野生型（WT）叶片淀粉含量少，不着色；相反，性别4-3叶子含有大量淀粉，被深染。类似地，补充表型的转基因不会染色，而那些不补充表型的则染色较深。（D）补充的定量。从野生型叶片中定量淀粉，性别4-3、和性别4-3转基因植物。每个样本是重复样本的平均值±标准误差。对于性别4-3转基因植物，六个独立的T2使用与图4（B和C）中所用植物同基因的植物来定量叶片中的淀粉量。FW，新鲜重量。
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