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.2007年6月；27(12):4228-37.
doi:10.1128/MCB.00074-07。 Epub 2007年4月16日。

线粒体和细胞核DNA编码亚基组装成复合物I的图谱分析

迈克尔·拉扎鲁 1, 马修·麦肯齐, 阿基拉·奥塔克, 大卫·R·托本, 迈克尔·T·瑞恩
附属公司

线粒体和细胞核DNA编码亚基组装成复合物I的图谱分析

迈克尔·拉扎鲁等。 分子细胞生物学. 2007年6月.

摘要

呼吸链复合体I由至少45个亚单位组成，这些亚单位在线粒体内膜聚集在一起。人类复合体I的缺陷导致能量产生障碍，也与帕金森病和细胞凋亡信号改变有关。这种复合物的组装尚不清楚，并且由于其巨大的尺寸和由两个基因组调控而变得复杂，其中七个亚基由线粒体DNA（mtDNA）编码，其余亚基由核基因编码。在这里，我们分析了许多线粒体DNA和核基因编码亚基组装成复合物I。我们发现，线粒体DNA编码亚基首先组装成中间复合物，需要大量的追踪时间才能整合到全酶中。相反，一组新导入的核基因编码亚基与先前存在的复合物I亚基结合，形成中间产物和/或完全组装的全酶。其中一个中间复合物代表与伴侣B17.2L相关的一个亚组分。通过使用分离的患者线粒体，我们表明该亚组分是复合物I组装中的一个生产性中间物，因为缺失亚基的导入恢复了复合物I的组装。我们的研究指出，复合物I的生物发生机制涉及两个互补过程，（I）合成mtDNA编码的亚基以进行种子从头组装，（ii）将先前存在的亚基与新输入的亚基交换以维持复合物I内环境稳定。亚单位交换也可以作为一种有效的机制，防止氧化损伤亚单位的积累，否则会损害线粒体氧化磷酸化，并可能导致疾病。

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数字

图1。
图1。
线粒体编码的亚单位组装成中间亚复合物。mtDNA编码的亚单位在野生型淋巴母细胞中进行脉冲期标记，然后进行线粒体分离。（A） 线粒体DNA编码亚单位在SDS-PAGE上的标记图谱。（B） Triton X-100中溶解线粒体的BN-PAGE分析。mtDNA编码的亚单位在不进行（左侧）或随后（右侧）CAP预处理的情况下进行标记。字母a和b表示可能的组装中间体区域。CI，复合物I；CIII公司2，复合物III同二聚体；CIV，复合物IV；SC、CI/CII2超复杂。（C） 追踪0、1、3和24小时后从放射性标记的淋巴母细胞分离的线粒体的二维PAGE分析。对于第一维BN-PAGE，线粒体在1%Triton X-100中溶解，如图B所示，但线粒体蛋白质/洗涤剂比率较高。区域a和b包括包含亚单位ND1、ND2、ND3和ND6的复合物I中间亚复合物。CO1（1）亚单位，细胞色素b条（2） 、CO3（3）、CO2（4）、ATP6（5）和ATP8（6）。CIV公司我，复合IV中间体。
图2。
图2。
将NDUFV3导入并组装到现有的综合体I中。35在存在或不存在膜电位（Δψ）的情况下，用从成纤维细胞分离的线粒体培养NDUFV3的S标记前体（前NDUF3）不同时间米). 样品经PK或不经PK处理后，进行SDS-PAGE（A）或溶解在含有DDM的缓冲液中，然后进行BN-PAGE（B）。荧光成像仪分析检测放射性标记蛋白。CI，复合物I；CIII公司2，复合物III同二聚体；CIII公司2/CIV，复合物III/复合物IV超复合物；CI/CIII公司2，复合物I/复合物III2超复杂。如图B右侧所示，络合物I（CI）及其超络合物与二聚络合物III（CI/CII）的迁移2)用复合物I亚基NDUFA9（α-CI）和复合物III核心1亚基（α-CII）抗体进行Western blot分析鉴定。（C）35将S-标记的NDUFV3与对照成纤维细胞分离的线粒体孵育5至45分钟，这些成纤维细胞经CAP预处理（第4至6道）或不经CAP处理（第1至3道）24小时。所有样品在溶解于含有DDM的缓冲液中之前，用外部添加的PK处理，然后进行BN-PAGE、Western转移、，和磷成像仪分析（顶部）。在获得放射性标记信号后，复合物I（CI）和CI/CII2用复合物I亚单位NDUFA9（α-CI）抗体进行Western blot分析鉴定超复合物。使用抗70-kDa亚单位抗体（α-CII）检测复合物II（CII）作为负荷对照（底部）。
图3。
图3。
复杂I亚单位的导入和组装。35在存在或不存在膜电位（Δψ）的情况下，将S标记的复合物I亚单位与分离的成纤维细胞线粒体单独孵育60分钟米). （A） 样品在含有DDM的缓冲液中溶解，并进行BN-PAGE和磷成像仪分析。复合体I中每个亚单位的大致位置以示意图的形式显示在每对车道的上方。复合物I（CI）、复合物III（CIII2)，及其超复数形式（CI/CII2)用复合物I亚基NDUFA9（α-CI）和复合物III核心I亚基（α-CII；23至24道）的抗体通过Western blot分析鉴定。（B） 导入放射性标记复合物I亚单位的SDS-PAGE分析。亚基的前体（p）和成熟（m）形式已确定。在存在或不存在Δψ的情况下，将样品导入线粒体（mit.）米以及用或不用外部添加的PK处理。还显示了裂解物样品（占添加的蛋白质/进口的20%）（通道4）。
图4。
图4。
组装因子B17.2L与患者和控制线粒体中的复杂I亚组分有关。（a）来自控制细胞（1区）和缺乏亚单位NDUFS6（患者B，2区）或NDUFS4（患者a，3区）的患者细胞的线粒体在含有DDM的缓冲液中溶解，并在用复合I抗体（抗NDUFA9）进行Western blot分析之前进行BN-PAGE。（B）35S标记的B17.2L与从对照或患者细胞分离的线粒体在存在或不存在Δψ的情况下孵育增加的时间米。每个样品的一半在分成两半之前用外部PK处理，并进行BN-PAGE（仅蛋白酶处理样品）或（C）SDS-PAGE和磷光成像。如面板B的车道1所示，35将S-标记的NDUFV3导入对照线粒体，以说明复合物I.CI/CIII的完全组装形式2，复合物I/复合物III2超复合体；CI公司我/CIII公司2，复合物I中间/复合物III2超复合体；CI公司我，复合物I中间体；CI，复杂I。
图5：。
图5：。
将NDUFS4导入患者线粒体可恢复复合物I组装。将来自对照组或NDUFS4缺乏患者A细胞的线粒体与35S标记的NDUFV3（作为对照）或35如BN-PAGE分析前所示，S标记NDUFS4 5至45分钟。（A） 复合物I的Western blot分析（用NDUFA9抗体探测）和进口和组装的（B）PhosphorImager分析。图示为描述复杂I形的示意模型。CI/CIII公司2，复合物I/复合物III2超复合体；CI公司我/CIII公司2，复合物I中间/复合物III2超复合体；CI公司我，复合物I中间体；CI，复合体I。星号表示非特异性复合体。
图6。
图6。
将NDUFS6导入患者线粒体可恢复复合物I组装。将来自对照组或NDUFS6缺陷患者B细胞的线粒体与35S标记的NDUFV3（作为对照）或35如BN-PAGE分析前所示，S标记NDUFS6 5至45分钟。（A） 复合物I的Western blot分析（用NDUFA9抗体探测）和进口和组装的（B）PhosphorImager分析。图示为描述复杂I形的示意模型。CI/CIII公司2，复合体I/复合体III2超复合体；CI公司我/CIII公司2，复合物I中间/复合物III2超复合体；CI公司我，复合物I中间体；CI，复合物I。星号表示非特异性复合物。
图7。
图7。
将复合物I亚单位导入并组装到缺乏NDUFS4的患者线粒体中。35将S标记的复合物I亚单位与患者A成纤维细胞分离的线粒体单独孵育60分钟。（A） 样品在溶解在含有DDM的缓冲液中之前，用或不用外部添加的PK进行处理，并进行BN-PAGE和磷成像仪分析。每个子单元的大致位置在每对车道的上方以示意图的形式表示。～800-kDa复合物I中间体（CI）的迁移我)，复合体III（CIII2)，及其超复数形式（CI我/CIII公司2)用复合物I亚基NDUFA9（α-CI，9和23道）和复合物III核心I亚基（α-CII，10和24道）的抗体进行Western blot分析。（B） SDS-PAGE分析选择的放射性标记复合物I亚单位导入患者a线粒体。鉴定了蛋白质的前体（p）和成熟（m）形式。在存在或不存在Δψ的情况下，将样品导入线粒体（mit.）米并用或不用外部添加的PK进行处理。还显示了裂解物样品（占添加蛋白质/进口的20%）（通道4）。
图8。
图8。
将复合物I亚单位导入并组装到缺乏NDUFS6的患者线粒体中。35将S标记的复合物I亚单位与患者B成纤维细胞分离的线粒体单独孵育60分钟。（A） 样品在溶解在含有DDM的缓冲液中之前，用或不用外部添加的PK进行处理，并进行BN-PAGE和磷成像仪分析。每个子单元的大致位置在每对车道的上方以示意图的形式表示。～800-kDa复合物I中间体（CI）的迁移我)，复合体III（CIII2)，及其超复数形式（CI我/CIII公司2)用复合物I亚基NDUFA9（α-CI，9和23道）和复合物III核心I亚基（α-CII，10和24道）的抗体进行Western blot分析鉴定。（B） SDS-PAGE分析选择的放射性标记复合物I亚单位导入患者B线粒体。确定了蛋白质的前体（p）和成熟（m）形式。在存在或不存在Δψ的情况下，将样品导入线粒体（mit.）米并用或不用外部添加的PK进行处理。还显示了裂解物样品（占添加蛋白质/进口的20%）（通道4）。
图9：。
图9：。
描述复合物I组装的模型。通过合成线粒体编码（ND）亚单位来播种中间复合物，然后招募其他核基因编码亚单位，从而实现从头组装。在与其他ND亚单位结合之前，ND1在一个单独的较小复合体中被发现。在没有NDUFS4或NDUFS6的情况下，存在含有组装因子B17.2L的中间体。将其并入复合物中可驱动完整的组装并释放B17.2L。复合物I内稳态也可通过新导入的亚基与先前存在的亚基的竞争而发生，以组装成复合物I。复合物Ⅰ中间产物可能存在于包括复合物Ⅲ的超复合物中。
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