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.2007年3月；21(3):777-89.
doi:10.1096/fj.06-7054com。 Epub 2006年12月28日。

HIV感染脑中内皮素-1的分子编程：Tat在内皮素-1上调中的作用及其他汀类药物的抑制作用

Ashok Chauhan公司 1, 斯文·哈恩, 苏珊·加特纳, 卡洛斯·帕尔多, 森蒂希尔·库马尔·内特桑, 贾斯汀·麦克阿瑟, 阿维德拉·纳特
附属公司

HIV感染脑中内皮素-1的分子程序设计：Tat在ET-1上调中的作用及他汀类药物的抑制作用

Ashok Chauhan公司等。 美国财务会计准则委员会J. 2007年3月.

摘要

人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）感染可导致严重的神经问题，包括行为异常、运动功能障碍和痴呆。HIV可以持续感染星形胶质细胞，在此期间会产生病毒辅助蛋白，这些蛋白不会受到当前抗逆转录病毒治疗的影响。这些蛋白质对星形胶质细胞功能的影响尚不清楚。星形胶质细胞是大脑中的主要细胞；因此，星形胶质细胞功能的破坏可能会影响HIV感染的神经病变。为了进一步探讨这些影响，我们在星形胶质细胞中组成性表达HIV-Tat蛋白。由于Tat蛋白的核存在会导致宿主基因表达的改变，我们进一步分析了Tat对宿主基因转录物的影响。经逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）证实，内皮素-1（ET-1）是一种显著升高的转录物，随后在Tat-expressing和HIV感染的星形胶质细胞中被细胞外释放。ET-1在HIV脑炎患者基底节和额叶脑组织中的反应性星形胶质细胞和神经元中也有显著表达。HIV-Tat通过ET-1启动子中的NF-kappaB（NF-kabpaB）反应位点在转录水平上调节ET-1。有趣的是，辛伐他汀（10μM）下调HIV-Tat诱导的ET-1，并抑制星形胶质细胞中NF-kappaB的激活。我们的研究结果表明，ET-1可能在介导HIV痴呆的神经病变中起关键作用，他汀类药物可能对这些患者具有治疗潜力。

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数字

图1
图1
星形胶质细胞中的Tat表达。A）用Tat构建物转染原代胎儿星形胶质细胞（PFA），并用Tat单克隆抗体进行免疫染色。一)WT-Tat呈核表达；(b条)突变体Tat（48–56）在整个细胞中表达。c）PFA转染空白对照载体。d–f）用DAPI显示细胞核染色，并与(a–c).g）稳定转染SVGA细胞并进行Tat免疫染色。WT-Tat在细胞核中表达；(小时)用空载体转染的细胞中没有Tat的免疫染色（对照）。我,j）DAPI核染色，对应于(克)和(小时).B）瞬时转染Tat 101-GFP或突变Tat（48-56）-GFP的SVGA细胞，并使用核磷蛋白单克隆抗体进行核仁免疫染色。a）细胞核中Tat-GFP（绿色）表达(b条)与中的字段相同(一)Tat-GFP（绿色）和核磷蛋白（红色）显示Tat和核仁的共定位(c（c）)DAPI核染色对应于(一和b条); (d日)突变体Tat（48-56）-GFP在整个细胞中表现出扩散表达（绿色）(e（电子）)与…相同(d日)显示突变的Tat-GFP（绿色）和核仁（红色），失去了Tat的核仁分布(（f）)DAPI核染色对应于(d日和e（电子）); (克)转染载体DNA的对照细胞(小时)与…相同(克)核仁染色；(我)DAPI核染色(克)和(小时).
图2
图2
表达Tat的星形胶质细胞中ET-1 mRNA上调。A）稳定转染Tat（SVGA-Tat）或对照DNA载体细胞（SVGA-neo）的SVGA细胞瞬时转染HIV-LTR-GFP。GFP在LTR反式激活中的表达见于SVGA-Tat细胞（生物活性），但在SVGA-neo细胞中没有表达(P（P）<0.003,n个=5). 这些细胞系用于微阵列研究和ET-1的后续研究。B）SVGA-Tat或SVGA-neo细胞中ET-1的半定量RT-PCR分析显示ET-1 mRNA水平增加：上层带lane，2倍稀释的ET-1；较低波段车道、GAPDH信号（管家基因）对应于ET-1车道中的相同稀释。BC是一种未添加cDNA模板的RT-PCR对照。
图3
图3
HIV-Tat诱导星形细胞产生ET-1和IL-6。A）HIV感染和Tat表达星形胶质细胞中ET-1的表达。a）感染VSV假型HIV（NL4-3株）的原代星形胶质细胞显示p24抗原免疫染色（HIV生产性感染的标志物）；(b条)HIV感染星形胶质细胞中ET-1的表达；(c（c）)未感染星形胶质细胞中ET-1的表达；(d日)同型抗体对照；(e（电子）)感染假型HIV的SVGA细胞显示p24抗原免疫染色；(（f）)HIV感染的SVGA细胞显示ET-1免疫染色。g）对模拟感染的SVGA细胞进行ET-1和(小时)同型抗体对照。i）SVGA细胞中Tat的稳定表达(j个)SVGA-Tat细胞显示ET-1表达类似于HIV感染的SVGA；(k个)对照SVGA-neo细胞中ET-1的表达；和(我)同型抗体对照。B）在表达低水平Tat、高水平Tat的SVGA细胞、HIV感染SVGA细胞或对照SVGA-neo细胞的72 h培养上清中测定ET-1水平（ELISA）。Tat表达或HIV感染显示ET-1的产生比基础ET-1水平显著增加（数据表示平均值±sem，P（P）<0.004,n个=4). (C类)HIV感染或表达Tat的星形胶质细胞产生IL-6。HIV感染者产生大量IL-6(P（P）<0.004）或Tat表达(P（P）<0.002）星形胶质细胞与对照SVGA-neo细胞相比，n个= 2.
图4
图4
ET-1在HIV脑炎（HIVE）中的表达。A）HIVE患者额叶可见明显的神经元（大箭头）和内皮细胞染色（小箭头）。这种模式也见于HIV（−）患者。B）HIVE患者血管周围浸润处可见胶质细胞染色（箭头所示）。插入物显示一些胶质细胞有核染色。C）HIVE患者额叶白质中显著的胶质细胞染色（箭头）。D）HIV（−）患者额叶白质中仅有内皮细胞染色。高功率放大：(E类)HIV感染脑组织中ET-1大量表达的星形胶质细胞。F）星形胶质细胞细胞核染色显示HIV阴性脑组织中ET-1的表达。G）HIV感染脑组织神经元胞浆ET-1的表达；和(H（H）)HIV阴性脑组织神经元中ET-1的表达。
图5
图5
ET-1启动子结构的克隆及其对Tat、IL-6和IL-8的反应。A）显示了ET-1启动子结构480、640的示意图，以及包含480、680和额外1.4kb序列的ET-promotor，这些序列包含NF-κB结合共有位点（ET-NF-κB）。用Tat表达载体联合转染SVGA细胞或用IL-6或IL-8处理稳定的SVGA-ET640或SVGA-ET-NF-κB细胞时，对启动子结构进行监测。在72小时的观察中，只有ET-NF-κB结构对Tat有反应，但对IL-6和IL-8没有反应。B）HIV前病毒DNA或Tat表达载体对ET-1启动子的诱导及其对Tat-siRNA的特异性抑制。在荧光仪中用绿色荧光测定ET-1启动程序的诱导。SVGA细胞与ET-NF-κB-GFP启动子构建物以及HIV-1前病毒DNA或Tat或突变Tat（dTat）表达载体单独或与Tat-siRNA联合共转染（数据表示平均荧光±sem，P（P）<0.0002,n个=3).
图6
图6
ET-1、IL-6和IL-8对星形胶质细胞中HIV-LTR启动子（转录）的影响。用高浓度（200 ng/ml）ET-1或IL-6或IL-8处理稳定的SVGA-LTR-GFP报告细胞，Tat作为阳性对照（48 h）。A）ET-1、IL-6和IL-8对HIV-LTRGFP星形细胞的影响。B）ET-1对潜在HIV感染报告单核细胞（p89-GFP）的影响。用ET-1处理p89-GFP单核细胞48小时，以TNF-α为阳性对照，未处理细胞为阴性对照。
图7
图7
通过定量ET-1 ELISA（72小时）测定，他汀类药物稳定地抑制星形胶质细胞表达的Tat中ET-1的生成。A）MTT法测定辛伐他汀的毒性。辛伐他汀在10和25µM浓度下对混合原代神经元和胶质细胞培养24小时的毒性最小。B）辛伐他汀（10µM）显著抑制Tat表达细胞中ET-1的生成（数据表示平均值±sem，P（P）<0.02时，n个=2).C）洛伐他汀（10µM）降低了表达Tat的星形细胞中ET-1的水平，但差异无统计学意义(P（P）<0.17,n个=2).D）HIV或Tat诱导ET-1启动子及其辛伐他汀抑制。SVGA细胞与ET-NF-κB-GFP启动子构建物和Tat或HIV前病毒DNA（NL4-3）质粒共转染，然后在转染后4 h添加10µM辛伐他汀。通过UV显微镜（72 h）筛选细胞的绿色荧光。a）ET-NF-κB启动子和Tat质粒转染SVGA细胞；(b条)与中的相同(一)但用10µM辛伐他汀治疗(c（c）)ET-NF-κB启动子和HIV前病毒DNA质粒共转染SVGA细胞；(d日)与中的相同处理(c（c）)加用辛伐他汀；(e（电子）)ET-NF-κB启动子和空对照载体（pCDNA）共转染SVGA细胞；和(（f）)与中的相同(e（电子）)加用辛伐他汀；(e（电子）)和(（f）)作为阴性对照(一)和(c（c）).E）辛伐他汀通过异源（非ET-1启动子）对星形胶质细胞组成性Tat表达的影响（72小时）。使用CMV启动子进行辛伐他汀特异性的对照实验。SVGA-Tat细胞，其中Tat和GFP在CMV启动子的控制下转录成单个mRNA，但由于两个基因之间存在IRES序列，因此编码两种不同的蛋白质，辛伐他汀不抑制SVGA-Tat细胞。但观察到Tat或GFP siRNA对Tat或GFP的特异性抑制。
图8
图8
辛伐他汀抑制Tat介导的NF-κB活化。A）稳定表达Tat的星形胶质细胞显示NF-κB活化（核转位）。B）DAPI核染色对应于(A类).C）辛伐他汀（预处理）Tat表达的SVGA细胞抑制NF-κB活化；(D类)DAPI核染色对应于(C类); (E类)对照SVGA细胞NF-κB胞质（非活性）染色；(F类)DAPI核染色对应于(E类); (G公司)对照组SVGA细胞在辛伐他汀的作用下表现出胞质NF-κB；(H（H）)DAPI核染色对应于(G公司); (我)同种型Ab对照；(J型)DAPI核染色对应于(我); (K（K）)同种抗体对照；(L（左）)DAPI核染色对应于(K（K）).
图9
图9
示意图显示了他汀类药物对ET-1的调节及其抑制作用。HIV感染或HIV蛋白（Tat）启动炎症反应，从而激活不同的基因，从而产生ET-1、IL-6和IL-8。他汀类药物通过NF-κB抑制ET-1。他汀类药物可能限制炎症反应，从而阻止NF-κB的激活。
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