BAG3 deficiency results in fulminant myopathy and early lethality

doi:10.2353/ajpath.2006.060250

.2006年9月；169(3):761-73.

doi:10.2353/ajpath.2006.060250。

BAG3缺乏导致暴发性肌病和早期死亡

Sachiko Homma公司¹, 岩崎雅弘, G黛安·谢尔顿, 伊娃·恩格瓦尔, 约翰·C·里德, 高山信一

附属公司

PMID： 16936253
预防性维修识别码：项目经理1698816
内政部： 10.2353/ajpath.2006.060250

BAG3缺乏导致暴发性肌病和早期死亡

侯间Sachiko等人。美国病理学杂志. 2006年9月.

.2006年9月；169(3):761-73.

doi:10.2353/ajpath.2006.060250。

作者

Sachiko Homma公司¹, 岩崎雅弘, G黛安·谢尔顿, 伊娃·恩格瓦尔, 约翰·C·里德, 高山信一

附属

¹美国加利福尼亚州拉霍拉市伯纳姆医学研究所。

PMID： 16936253
预防性维修识别码：项目经理1698816
内政部： 10.2353/ajpath.2006.060250

摘要

Bcl-2-associated athanogene 3（BAG3）是一个保守的细胞保护蛋白家族的成员，与Hsp70家族分子伴侣结合并调节其功能。这里，我们发现BAG3在横纹肌中显著表达，并与Z盘共定位。bag3基因纯合性断裂的小鼠发育正常，但出生后病情恶化，1至2周龄时生长明显受阻，4周龄时死亡。BAG3缺陷动物发生暴发性肌病，其特征是具有凋亡特征的非炎症性肌原纤维变性。在培养的C2C12成肌细胞中，bag3表达的下调增加了诱导分化时的细胞凋亡，表明bag3对维持肌管存活的需要，并证实了bag3在肌肉中的细胞自主作用。我们的结论是，虽然肌肉发育不需要BAG3，但这种协同伴侣似乎对维持成熟骨骼肌至关重要。

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数字

图1
*袋子3*在肌肉中高度表达。答：分析*袋子3*mRNA。人类*袋子3*肌肉、心脏、肾脏、肺、肝脏和胎盘中检测到约2.8kb的成熟转录物和约4.5kb转录物的前mRNA(顶部). 将印迹与β-肌动蛋白cDNA探针杂交作为对照(底部)检测在大多数组织中以类似水平存在的～2.4-kbβ-actin转录物，以及检测～2.0-kbα-actin mRNA(_*)在心脏和骨骼肌中，仅在肌肉组织中大量表达。**B类：**使用来自4周龄雄性小鼠的裂解物进行免疫印迹分析，总蛋白标准化（20μg/lane）。在组织中检测到与BAG3相对应的～80-kd带。使用抗凝集素抗体验证样本完整性(底部).抄送：分析袋3−/−小鼠。**顶部，**基因组DNA的Southern blot分析使用10μgPvu公司野生型（+/+）、杂合型（+/-）和纯合型（−/−）突变小鼠的II消化尾DNA。**中部，**PCR分析也使用扩增小鼠完整外显子3区域的引物进行*袋子3*基因或插入病毒载体的Neo基因。**底部，**肌肉组织免疫印迹分析（25μg/lane）在野生型（+/+）和杂合型（+/-）小鼠中检测到80-kd小鼠BAG3蛋白，但在纯合型（−/−）小鼠中未检测到。低分子量物种可能是BAG3的部分降解产物。**医生：**免疫印迹分析用于袋3−/−和*袋子3*+/+使用组织裂解物的小鼠总蛋白含量（20μg/lane）正常化。用BAG3、BAG1、HSC70和肌动蛋白特异性抗体检测印迹。数据代表三个或更多实验（另请参见补充图S1）。

图2
BAG3缺陷小鼠的比较。答：女性杂合子（+/-）(顶部)和纯合子*袋子3*-空（−/−）(底部)图中显示的室友年龄为22天。在麻醉状态下拍摄照片以控制小鼠的活动。**B类：**图中显示了一只22日龄BAG3缺陷小鼠的特写镜头，显示了肢体肌肉萎缩和肋骨扩张。**抄送：**生长曲线比较如下袋3+/+,*袋子3*+/−，和袋3−/−小鼠。每天从出生时开始测量野生型（+/+）的体重(n个= 46; 方形），杂合(n个= 95; +/−) （三角形）和同Gyzous（−/−）(n个= 36; 圆圈）*袋子3*老鼠。（+/+）和（+/-）小鼠之间未检测到差异。数据表示平均重量。标准偏差<15%。

图3
BAG3缺乏小鼠肌肉的组织学分析。答：BAG3缺陷小鼠和正常小鼠肌病组织学特征的比较*中密度纤维板*老鼠。对来自股四头肌的新鲜冷冻切片（8μm）进行评估*袋子3*-null（−/−）、野生型小鼠（原始放大倍数，×400），以及*中密度纤维板*老鼠。H&E染色(顶部)肌肉的*袋子3*−/−小鼠肌纤维大小变化，有大量萎缩纤维和固缩核。肉质中存在点画和嗜碱性物质聚集的多焦点区域。改良Gomori三色染色(**中间的**)显示苍白的肌纤维*中密度纤维板*肌肉，表明坏死，而*袋子3*−/−肌肉保持正常的深色染色。细胞色素*c（c）*氧化酶(底部)反应显示肌纤维内线粒体完整袋3−/−小鼠(箭头)与线粒体染色减少相比*中密度纤维板*老鼠。比例尺=50μm。**B类：**肌肉变性发病的异质性。在第13天，肌肉退化的程度因解剖位置而异。膈肌（1）、股中间肌（2）和比目鱼肌（4）的退化程度较高，但股外侧肌（3）、胫骨前肌（6）和趾长伸肌（5）的退化幅度最小。比例尺=50μm。**抄送：**BAG3缺乏小鼠的肌肉炎症和再生很小。肌肉部分来自*袋子3*−/−鼠标和*中密度纤维板*用CD45抗体对营养不良小鼠进行染色(顶部)和发展型MHC（MHCd）(底部)间接免疫荧光法。在肌肉纤维中只观察到少数阳性染色细胞*袋子3*−/−小鼠，表明炎症细胞浸润和再生不足，而*中密度纤维板*肌肉显示出广泛的炎症和再生。使用磷灰石-罗丹明（红色）对肌纤维进行可视化（另请参见补充图S2至S4）。比例尺=50μm。

图4
BAG3缺乏小鼠肌肉的凋亡变性。答：从第22天开始制备比目鱼肌和心脏组织切片*袋子3*−/− (一,**c（c）**、和**e（电子）**)以及*袋子3*+/− (b条,d日、和**（f）**)小鼠（原始放大倍数，×400）。组织切片采用TUNEL法染色。细胞核用甲基绿轻微复染。许多肌纤维的比目鱼肌中有棕色TUNEL阳性细胞核*袋子3*−/−鼠标(一)，而在*袋子3*+/−小鼠(b条). 中庭TUNEL染色切片(**c（c）**和d日)和心室(**e（电子）**和**（f）**)显示TUNEL阳性细胞在袋3−/−与相比*袋子3+/*−小鼠，尤其是在心房。**B类：**TUNEL数据的量化。在14天的肌肉（比目鱼肌）、心房和心室组织切片中计算TUNEL阳性细胞核的百分比*袋子3*−/−（黑色条）和*袋子3*+/+（白色条）老鼠。数据表示平均值±SEM(n个= 4).C类和**医生：**从14天开始准备股四头肌组织切片*袋子3*−/−小鼠，然后用抗层粘连蛋白抗体染色以检测基底膜(C类)或用抗α肌多糖抗体检测肌膜(D类). 共焦激光扫描显微镜在原始放大倍数×630下进行。TUNEL（红色）染色显示凋亡细胞核位于基底层或肌膜下。比例尺=5μm。

图5
肌肉中的Z盘改变、退化肌原纤维和凋亡细胞核*袋子3*−/−小鼠。肌肉通过透射电子显微镜进行分析。答：隔膜来自*袋子3*E18.5、P4和P14的−/−小鼠（原始放大倍数，×11000）。E18.5隔膜无异常。出生后第4天，观察到Z盘流和肌原纤维紊乱，但未出现凋亡。到第14天，出现肌肉变性，出现大量固缩核。数据代表了每个年龄段评估的两只小鼠。**B类：**细胞核缩小表现为细胞核DNA分解为凋亡小体(**暗箭头**)随着细胞核显示出明显的染色质凝聚和边缘(**轻箭头**)，与14天内的早期凋亡变化一致*袋子3*−/−鼠标（原始放大倍率，×6875）。**抄送：**14天时，肌原纤维紊乱的焦点显示为粗细纤丝碎片、Z盘残留物、髓样结构和膜物质堆积，线粒体完整但明显破碎（小）（原始放大倍数，×6875）。14天大的比目鱼肌也有类似的发现（未显示）。更多EM图像请参见补充图S5。

图6
BAG3与肌组织中的结蛋白和α-肌动蛋白共定位。BAG3用Z盘蛋白定位（原始放大倍数，×600出油）。用野生型小鼠趾长伸肌的纵切面，用抗BAG3多克隆（绿色）和抗结蛋白（红色）或抗α-肌动蛋白（红）单克隆抗体进行免疫荧光分析。BAG3型(顶部)、结蛋白或α-肌动蛋白(**中间的**)和合并的图像(底部). 对照免疫染色数据见补充图S6。

图7
shRNA-介导的BAG3蛋白敲除增加凋亡并减少分化C2C12细胞的积累。答：BAG3的Western blot分析表明shRNA处理的C2C12细胞中蛋白质表达的特异性降低。感染24小时后，对20μg蛋白质样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后使用抗BAG3进行Western blot分析(顶部)和抗β-肌动蛋白(底部)抗体（参见补充图S7）。**B类：**用BAG3 shRNA处理分化C2C12细胞培养物时，细胞凋亡增加。将80%至90%汇合处的C2C12转换为2%马血清以诱导分化。DAPI染色计数不同时间凋亡细胞核的百分比（平均值±SD；n个=3）在高功率场上。星号表示具有统计意义的数据(*P（P）*≤ 0.05).抄送： *袋子3*击倒降低分化肌管的丰度。在分化3天和5天时测量结蛋白阳性细胞中多核细胞的百分比（平均值±SD；n个=3）（实心条，shRNA；阴影条，对照）。学生的t吨-测试用于确定统计显著性(*P（P）*< 0.05).医生： *袋子3*敲除减少分化C2C12细胞的积累。转移至低血清后7天，用2.5%戊二醛固定细胞，并用MHC（快速型）和DAPI免疫染色进行分析****P（P）*= <0.05; ***P（P）*= <0.01; **P（P）*= <0.001.

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