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.2006年8月1日；103(31):11724-9.
doi:10.1073/pnas.0604946103。 Epub 2006年7月24日。

肺泡II型细胞中溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶的鉴定和特性

陈雪妮 1, 布莱恩·凯悦, 迈克尔·穆森斯基（Michael L Mucenski）, 罗伯特·梅森, 约翰·M·香农
附属机构

肺泡II型细胞中溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶的鉴定和特性

陈雪妮等人。 美国国家科学院程序. .

摘要

肺表面活性物质是肺泡II型细胞产生和分泌的脂质和蛋白质的复合物，在气液界面提供低表面张力。最负责提供肺部低表面张力的磷脂是二棕榈酰磷脂酰胆碱。二棕榈酰磷脂酰胆碱大部分是通过磷脂酰胆碱（PC）重塑合成的，溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶（lysoPC）被认为在其合成中起着关键作用。然而，这种酰基转移酶尚未被鉴定。我们克隆了编码溶血磷脂酰转移酶（LPCAT）的全长大鼠和小鼠cDNA。LPCAT编码一个约59kDa的535-aa蛋白，该蛋白包含一个跨膜结构域和一个假定的酰基转移酶结构域。当转染COS-7细胞和HEK293细胞时，LPCAT显著提高了溶酶体PC酰基转移酶活性。LPCAT优先选择lysoPC作为底物，而不是lysoPA、lysoPI、lysoPS、lysoPE或lysoPG，并且优先选择棕榈酰CoA而不是油酰CoA作为酰基供体。这种LPCAT优先在肺部表达，特别是肺泡II型细胞。胎肺和大鼠II型细胞中的表达与表面活性蛋白的表达相关。胎肺组织中LPCAT的表达对地塞米松和FGF敏感。KGF是培养的成人II型细胞中LPCAT表达的有力刺激物。我们假设LPCAT在调节表面活性剂磷脂生物合成中起着关键作用，并建议了解LPCAT的调节将为表面活性剂脂质生物合成提供重要的见解。

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利益冲突声明

利益冲突声明：未声明任何冲突。

数字

图1。
图1。
LPCAT蛋白序列。LPCAT的结构有一个跨膜结构域，一个甘油脂质酰基转移酶活性结构域，以及两个潜在钙结合位点的EF手（EFH）结构域。强调了甘油脂质酰基转移酶活性的结构域，以及临界H（X）4D签名下划线。
图2。
图2。
溶菌酶PC酰基转移酶活性。(A类)大鼠LPCAT在哺乳动物细胞中的表达。转染48小时后，用抗V5抗体处理细胞进行Western blot。车道1，野生型COS-7细胞；通道2，空载体转染COS细胞；通道3，转染LPCAT的COS-7细胞；车道4，野生型HEK293电池；泳道5，用空载体转染的HEK293细胞；通道6，HEK293细胞转染LPCAT。(B类)重组LPCAT在不同溶血磷脂底物的HEK293细胞中表达的酰基转移酶活性。酰基转移酶检测通过培养20μM[1进行-14C] 棕榈酰辅酶A与每种溶血磷脂（150μM）在20μg来自野生型细胞（293-W）、转染对照载体（293-C）或LPCAT（293-LPCAT）的细胞匀浆的存在下混合。所有酶活性数据均来自至少三个独立实验，显示为平均值±SE.*，存在显著差异(P（P）<0.001）。(C类)与C（对照，空载体）相比，棕榈酰辅酶A对HEK293细胞中表达的重组（R）LPCAT的溶菌酶PC酰基转移酶活性的偏好高于油酰基辅酶A。通过培养150μM溶血磷脂与20μM溶酶体进行酶活性测定[14C] 酰基辅酶A作用0、5、10和15分钟。数据来自至少三个独立实验，显示为平均值±SE。
图3。
图3。
LPCAT在发育期和成人肺中的表达。在第E13.5天、第E15.5天和第E18.5天从小鼠胚胎以及成年小鼠胚胎中获取肺部。E13.5日整座ISH(A类)显示LPCAT在远端上皮尖端强烈表达，但在近端大气道中不表达。这种表达模式与SP-C的表达模式相同(B类). 与LPCAT探针杂交的肺部没有信号（数据未显示）。与LPCAT探针杂交的E15.5和E18.5肺切片显示对远端腺泡的特异性定位，而大气道则为阴性。在成人肺部(C类和D类)LPCAT在肺泡壁上皮细胞中表达最高，而在气道上皮中不表达。(E类)实时PCR用于测定正常化为β-肌动蛋白的发育中肺中LPCAT mRNA的表达水平，并与成人肺中的水平进行比较。结果是每个胎龄三次独立测定的平均值±SEM。*，显著地(P（P）<0.01）与第E12.5、E14.5和E16.5天相比增加。
图4。
图4。
LPCAT在成人器官中的表达。(A类)用10μg大鼠和小鼠不同器官的总RNA制备Northern印迹，然后与放射性标记的小鼠LPCAT cDNA杂交。大鼠和小鼠的肺中表达最丰富。大鼠在胃中也有显著表达，在大脑、脾脏和肠道中也有微弱表达。在小鼠的脾脏中也检测到微弱的表达。(B类)实时PCR用于比较成年小鼠肺和新鲜分离的小鼠肺泡II型细胞中LPCAT和SP-C mRNA的含量。归一化为β-actin后，II型细胞中LPCAT含量增加7.4倍，SP-C含量增加4.8倍。结果是来自四个独立实验的平均值±SEM。*，显著大于(P（P）<0.05）高于全肺。
图5。
图5。
在发育中的肺中，LPCAT的表达受糖皮质激素和FGF的调节。E16.5肺外植体在含有10−7M Dex或10μM SU5402；0.1%乙醇（EtOH）或0.1%二甲基亚砜用作各自的载体控制。通过实时PCR测定LPCAT mRNA含量，并将其归一化为β-肌动蛋白。结果是三个独立实验的平均值±SE。与时间0组织相比，LPCAT表达显著增加(P（P）<0.001），在培养24小时和48小时时，存在EtOH、DMSO或没有添加（+0）。与EtOH相比，添加Dex导致(P（P）<0.001）24小时和48小时LPCAT表达增加。相比之下，SU5402显著消除FGF信号(P（P）<0.01）抑制了二甲基亚砜处理培养物中LPCAT表达的增加。*，与车辆控制显著不同；†，24h时与相同处理有显著差异。
图6。
图6。
Ⅱ型细胞LPCAT的调节。(A类)KGF增加了大鼠肺泡II型细胞LPCAT的mRNA水平。II型细胞在加入和不加入KGF（10 ng/ml）的情况下培养5天。通过实时PCR测定mRNA水平，如材料和方法结果用亲环素B标准化，并表示为与不含KGF的培养物相比的折叠变化。结果是五个实验的平均值±SE。*，显著增加(P（P）<0.01）。KGF增加LPCAT水平（R1），而其他假定酰基转移酶（R2–R4）的表达没有改变。R3的mRNA低于检测水平（ND）。(B类——D类)大鼠肺泡II型细胞在含有10%FBS的塑料孔中培养。在指定的日期采集细胞。通过实时PCR检测LPCAT、SP-A（II型细胞标记物）和T1α（I型细胞标记）的mRNA水平，并将其归一化为GAPDH。(B类)SP-A的mRNA表达在在体外从II型细胞过渡到I型样细胞。(C类)LPCAT的表达与SP-A平行减少，而T1α的表达在这些培养条件下如预期的那样增加(D类). 结果是三个实验的平均值±SE。*，显著差异(P（P）<0.05）。
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