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.2006年3月1日；66(5):2576-83.
doi:10.1158/0008-5472.CAN-05-3241。

von Hippel-Lindau抑癌基因条件失活小鼠肾囊肿的发生

埃琳·兰金 1, 约翰·托马泽夫斯基, Volker H Haase公司
附属公司

von Hippel-Lindau抑癌基因条件失活小鼠肾囊肿的发生

埃琳·兰金等。 癌症研究. .

摘要

von Hippel-Lindau抑癌基因pVHL的失活与遗传性和散发性肾囊肿以及肾细胞癌有关，肾细胞癌通常被认为是由肾近端小管引起的。pVHL调节缺氧诱导因子（HIF）-α亚单位的蛋白质稳定性，pVHL功能的丧失导致HIF稳定。HIF在VHL相关肾脏病变发展中的作用尚待确定。为了研究pVHL失活的功能后果和HIF信号在肾上皮细胞中的作用，我们使用磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）启动子来生成转基因小鼠，其中Cre-regusise在肾近端小管和肝细胞中表达。我们发现，PEPCK Cre突变体中VHL的条件失活导致肾囊肿的发展，这与红细胞生成素水平升高和红细胞增多症有关。HIF靶基因促红细胞生成素的表达增加仅限于肝脏，而碳酸酐酶9和多药耐药基因1的表达在突变小鼠的肾皮质上调。灭活HIF-α结合伙伴，芳基碳氢化合物受体核转运体（Arnt），但不灭活HIF-1α，抑制肾囊肿的发展。在此，我们提出了第一个VHL相关肾病小鼠模型，该模型将为进一步的遗传学研究提供基础，以确定VHL相关肾囊肿向清除细胞性肾细胞癌进展所需的分子事件。

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图1
图1
PEPCK-Core转基因小鼠的制备。A类通过同源重组，用PEPCK-靶向载体靶向HPRT缺失的胚胎干细胞（E14Tg2a）。E14tg2a胚胎干细胞缺乏启动子和外显子1和2的基因组图高效放射治疗基因、PEPCK-核心靶向载体和修复的高效放射治疗含等位基因重新组合受控制的表达PEPCK公司发起人。矩形框，外显子。绿色方框,PEPCK-核心转基因。黑盒子，用BamHI（B）消化后用于鉴定重组胚胎干细胞克隆的探针位置。B类，通过Southern blot分析确定经过同源重组的胚胎干细胞克隆的基因型分析。C类，PEPCK-在肾脏中的表达。5′-溴-4-氯-3-吲哚-β-d日-与ROSA-LacZ报告小鼠交配的PEPCK-Core小鼠肾脏组织切片的吡喃半乳糖苷（Xgal）染色。蓝色染色，表达PEPCK-核心的细胞。请注意，PEPCK-Core在肾皮质和外髓质中表达。D类，PEPCK-在肾近端小管中的表达。与ROSA-LacZ报告小鼠交配的PEPCK-Core小鼠肾组织切片的凝集素和Xgal染色。LTA和BSAII染色位于肾皮质（S1、S2）和外髓质（S3）的近端小管S1、S1和S3段。Xgal染色显示表达PEPCK-核心的细胞。请注意，约70%的LTA阳性细胞和100%的BSAII阳性细胞染色为Xgal。E类，PEPCK-核心在Henle的肾远端小管或髓质厚升支中不表达。Xgal染色的定位(蓝色)THP表达(棕色的)在肾皮质(顶部)和外髓质(底部)PEPCK Cre/ROSA-LacZ小鼠的表达。放大倍数，×200。
图2
图2
使用沃尔,沃尔和Hif-1型α、 或沃尔和阿恩特肾皮质缺失。A类，基因组图沃尔（2-液氧），Hif-1型α（2-lox），以及阿恩特（3-lox）条件等位基因。矩形框外显子；灰色外显子靶向缺失；黑色所有其他外显子。灰色箭头,LoxP公司地点。黑色箭头，用于扩增非结合型（2-lox或3-lox）、重组型（1-lox）和野生型的引物的位置(重量)等位基因。H（H）,HindIII；N、 NcoI公司;E类,生态R1;对,PstI；Bgl，BglII；新，新霉素选择盒。B类，通过基因组PCR对从PEPCK-Vhlh突变小鼠收集的组织进行基因型分析。2-线非结合等位基因；1-液氧，重组等位基因。C类用基因组PCR对PEPCK突变小鼠进行基因型分析。T型，尾部；K（K），肾皮质；2，2-氧基；三，3-液氧；+，野生型(+用于PEPCK-核心，存在PEPCK Cre公司转基因）。
图3
图3
PEPCK-核心突变小鼠HIF靶基因表达。通过实时PCR测定2月龄雄性小鼠肾皮质或肝脏中HIF靶基因的相对表达水平。表达水平归一化为18S。A类，灭活沃尔在PEPCK-Core突变小鼠中诱导肾皮质HIF靶基因表达。柱，所示基因型三只小鼠的平均mRNA转录水平；酒吧，SD.*，与Student’s测定的对照小鼠（Cre-）相比，靶基因表达显著增加或减少t吨测试（*，对< 0.05; **,对< 0.001).B类,Epo公司PEPCK-Vhlh和PEPCK-WHLH/Hif-1α突变小鼠的表达仅限于肝脏。柱，相对Epo公司肝脏mRNA表达水平(我)或肾皮质(K（K）)针对指定基因型的单个小鼠。
图4
图4
PEPCK-Vhlh突变小鼠宏观肾囊肿的发育是ARNT依赖性的。A类，PEPCK-Vhlh和PEPCK-WHLH/Hif-1α突变肾脏的照片。箭头宏观肾囊肿的位置。B类，在PEPCK-核心突变小鼠中观察到宏观肾囊肿的发生率。柱，肾功能正常的小鼠数量(灰色)或肾囊肿(黑色)对于给定的基因型，在2至11个月龄（组1）和12至25个月龄时（组2）。χ2试验表明，在12个月以上的PEPCK-Vhlh和PEPCK-Vhlh/Hif-1α突变小鼠之间，肾囊肿的数量没有显著差异。
图5
图5
PEPCK-核心突变肾脏中肾微囊的发生率。A类PEPCK-Core突变小鼠和对照小鼠肾脏切片的H&E染色。×200时PEPCK-Vhlh和PEPCK-Vhlh/Hif-1α突变小鼠肾小管和肾小球囊肿的亮场照片(左边)和×600(正确的)放大倍率为200倍的PEPCK-Vhlh/Arnt和对照（Cre-）小鼠的肾皮质。T-Cy公司管状囊肿；G-Cy公司，肾小球囊肿。B类，在PEPCK-Core突变小鼠肾皮质观察到的显微镜下囊肿的发生率。柱，正常小鼠数量(灰色)或囊性(黑色)肾皮质。白线、PEPCK-Vhlh和PEPCK-WHLH/Hif-1α突变小鼠的数量，这些小鼠同时出现了肾小管囊肿和肾小球囊肿。χ2测试表明，两个突变株之间的肾小管或肾小球囊肿发生率没有统计学差异。
图6
图6
PEPCK-Vhlh突变小鼠微囊的特性。A类和B类，PEPCK-Vhlh突变肾脏管状微囊的基因型分析。A类，激光显微切割前后微囊的亮场照片，以及收集到盖子上的三个微囊的显微切割上皮细胞衬里。原始放大倍数，×400。B类,沃尔肾皮质DNA的1-lox PCR扩增(1)，控制盖(2)和六个微囊的上皮细胞衬里(三). 请注意沃尔1-lox等位基因存在于微囊壁上皮细胞中。C类到E类PEPCK-Vhlh突变小鼠的肾微囊表达来自肾单位多段的分子标记。C类用荧光标记的LTA进行凝集素染色(绿色). 请注意，管状囊肿1至3为LTA阴性，管状囊4为LTA阳性。D类在管状微囊内壁上皮细胞中，用抗细胞脱分化标记物波形蛋白（VIM）抗体染色。*，管状囊肿的腔。E类用THP抗体染色。注意，囊肿的上皮细胞在整个细胞质中表达THP。F类，用管状微囊内壁上皮细胞中抗VEGF抗体染色。*，管状囊肿的腔。G公司，在管状微囊肿内衬的细胞核中对增殖标记物Ki67进行染色。箭头Ki67阳性的上皮细胞。
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