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.2005年3月；16(3):1282-95.
doi:10.1091/mbc.e04-07-0578。 Epub 2005年1月5日。

磷脂酰肌醇4-激酶III型α产生磷脂酰肌糖醇4-磷酸的质膜池：对氧甾醇结合蛋白和FAPP1的PH结构域的研究

安德拉斯·巴拉 1, 加琳娜·图梅托娃, 阿诺德·齐奥梅科, 佩特·瓦尔奈, 塔马斯·巴拉
附属公司

磷脂酰肌醇4-激酶III型α生成磷脂酰肌糖醇4-磷酸的质膜池：对氧甾醇结合蛋白和FAPP1的PH结构域的研究

安德拉斯·巴拉等。 分子生物学细胞. 2005年3月.

摘要

利用融合到GFP的OSBP和FAPP1的PH结构域监测PI4K活性调控过程中COS-7细胞中PI4P的分布。这两个结构域都与高尔基体和小细胞质小泡相关，并且在质膜（PM）中发现少量OSBP-PH。10微米沃特曼（Wm）对III型PI4K的抑制显著降低，但没有消除PH域的高尔基体定位。siRNA对PI4KIIalpha或PI4KIIIbeta的下调减少了PH结构域对高尔基体的定位，在前一种情况下，任何剩余的高尔基体定位都被Wm处理消除。由Ca2+离子载体激活的PLC将这些结构域从所有膜上分离出来，但在Ca2+螯合后，它们迅速与高尔基体、细胞内小泡和PM重新结合。在Ca2+瞬变后，这些结构域的PM结合显著升高，并被Wm预处理所消除。PM重定位不受PI4KIIIbeta或-IIalpha下调的影响，但受PI4KIIIalpha或10μM PAO下调的抑制，后者也抑制PI4KIII alpha。我们的数据表明，在动态条件下，这些PH结构域检测到高尔基体外隔室中PI（4）P的形成，并且各种PI4K调节不同细胞隔室中的PI（4P合成。

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数字

图1。
图1。
COS-7细胞中表达的OSBP-PH-GFP（A）和FAPP1-PH-GFP（B）的细胞分布。用指定的PH结构域GFP嵌合体瞬时转染细胞24小时，并在35°C下通过共聚焦显微镜研究活细胞。在大多数低到中等表达水平的细胞中，这两种结构都显示出高尔基体室的定位（a和b中的a和b面板）。在许多表达低水平两种结构的细胞中，动态管状结构源自高尔基体，这让人想起早期BFA治疗的效果（面板c）。在较高的表达水平下，OSBP-PH在高尔基体区域周围和更多的外围位置显示出几个小水泡，而FAPP1-PH结构域生成了多个较大的水泡，这些水泡对其限制膜中的结构域呈强阳性反应（分别位于A和B上的面板d）。值得注意的差异是OSBP-PH而非FAPP1-PH的核积累，尤其是在表达较高水平蛋白质的细胞中。
图2。
图2。
过度表达OSBP-和FAPP1-PH-GFP对高尔基体标记分布的影响。将GFP融合（A）或mRFP融合（B）各自的PH结构域转染COS-7细胞24小时，并将其作为固定细胞进行免疫染色，以检测是否存在GFP融合的PH区域顺式-高尔基标记物gm130（A）或与含有β1,4-半乳糖基转移酶（Golgi-GFP）N末端跨膜结构域的GFP构建物共转染，并观察到活的（B）。注意顺式-在表达较高水平的任一PH结构域的细胞中的高尔基体标记物（比较A上两个箭头所示的结构），以及在低水平表达构建体的细胞中观察到的紧密共定位的丧失。（B） 在表达高水平FAPP1-PH-mRFP的活细胞中也观察到类似的高尔基体碎片，但在OSBP-PH-mRFP（顶行）中这种效果并不显著。
图3。
图3。
灯盏花素A（BFA）处理对COS-7细胞中OSBP-和FAPP1-PH-GFP定位的影响。用指示的构建物转染细胞，24小时后在35°C下用激光共聚焦显微镜检查活细胞。（A） 添加BFA（5μg/ml）后，OSBP-PH-GFP很快（在1分钟内）从高尔基体中分离出来，而FAPP1-PH结构域需要更长的时间（3-5分钟）。
图4。
图4。
沃特曼（Wm）处理对COS-7细胞中OSBP或FAPP1-PH-GFP融合蛋白定位的影响。用指示的PH-GFP构建物转染COS-7细胞24小时，并通过共焦显微镜作为活细胞进行研究。（A） 用10μM Wm处理细胞30分钟（37°C），以完全抑制III型PI4K。Wm治疗后，两个PH域的高尔基体定位都有所下降，但在囊泡室中仍有显著定位，通常与高尔基体区域有关。在大多数情况下，这些小泡比未经处理的细胞更分散。（B） Wm治疗前后的差异在Wm治疗之前和之后记录的细胞中进行了说明。底部面板显示了一个细胞，在Wm处理后，它迅速失去了部分OSBP-PH域定位。图7显示了Wm处理对高尔基体定位影响的其他示例。
图5。
图5。
siRNA处理下调III型βPI4K对OSBP-和FAPP1-PH-GFP在活细胞（A）和固定细胞（C）COS-7中定位的影响。用设计用于干扰PI4KIIIβ表达的双链RNA连续2天对COS-7细胞进行处理，并在第三天用PH-GFP构建物转染，再转染一天，如材料和方法。细胞要么在35℃（A）下进行活细胞研究，要么在固定并用多克隆抗PI4KIIIβ抗体（C）进行免疫染色后进行分析。箭头指向PI4KIIIβ基本消除的两个细胞。为了确定siRNA处理的效果，用针对三种PI4K酶的各种siRNA处理相同的细胞，使用针对各自激酶的抗体进行Western blot分析，并对blot进行肌动蛋白（B）分析。在显示PI4KIIIβ敲除效应的图片中，对照组和siRNA处理的样品未加载到相邻车道上，这由图像之间的间隙表示。然而，图像是从相同的凝胶中得到的，该凝胶以相同的设置进行扫描和处理。
图6。
图6。
siRNA处理下调II型αPI4K对OSBP-和FAPP1-PH-GFP在活细胞（A）和固定细胞（B）COS-7中定位的影响。用设计用于干扰PI4KIIα表达的双链RNA连续2天处理COS-7细胞，并用PH-GFP构建物转染额外一天，如材料和方法细胞要么在35°C（A）下进行活细胞研究，要么在固定并用多克隆抗PI4KIIα抗体进行免疫染色后进行分析（B；Guo等。，2003). 箭头指向两个细胞的高尔基体区域，一个细胞的PI4KIIα基本上被消除，另一个细胞的PI4KIIα仍然很容易被检测到。
图7。
图7。
沃特曼处理对PI4KIIαsiRNA 2-d处理后OSBP-和FAPP1-PH-GFP定位的影响。用siRNA处理COS-7细胞，并用PH结构域转染，如图5图例所示。在35°C下研究活细胞，并用10μM Wm处理指定的时间。注意，在siRNA处理的细胞中PH结构域的定位完全丢失，但在对照组中没有。
图8。
图8。
细胞质[Ca的影响2+]增加OSBP-PH-GFP融合蛋白的分布。用指示的构建物转染细胞，并在35°C下用共焦显微镜（Zeiss LSM410）检查活细胞。（A） 在2 mM外部钙存在下添加离子霉素（10μM）2+导致PH结构域从高尔基体转移到细胞质。钙的螯合作用2+BAPTA恢复高尔基体的定位，并诱导PH结构域的显著质膜定位。沃特曼（Wm）预处理可防止离子霉素/BAPTA处理后的质膜定位，但不能防止PH域的囊泡定位（A，下系列）。COS-7细胞中共表达的CFP-和YFP-融合OSBP-PH结构域之间的FRET测量显示初始FRET值较高（可能是因为结构体的核聚积较高），添加离子霉素后FRET值降低，但在Ca2+螯合作用，对Wm（10μM）处理最敏感（A，图）。（B） 分别通过GFP和mRFP融合PH结构域的共表达同时监测OSBP-PH和PLCδ1-PH结构区的易位。注意，在离子/BAPTA治疗后（但不是治疗前），红色和绿色信号明显同位。融合到CFP和YFP的相同结构域之间的FRET测量（OSBP-PH-CFP和PLCδ1-PH-YFP）显示，初始FRET很小，在离子霉素治疗后被废除，在Ca2+螯合作用。FRET分析显示，经Wm处理后，OSBP-PH运动的质膜成分显著减少。
图9。
图9。
细胞质[Ca的影响2+]FAPP1-PH-GFP融合蛋白的分布增加。实验细节见图8的图例。（A） 在2 mM外部钙存在下添加离子霉素（10μM）2+导致PH结构域从高尔基体转移到细胞质。钙的螯合作用2+通过EGTA恢复了FAPP1-PH结构域在高尔基体中的定位，但FAPP1-PH结构域的质膜定位不如OSBP-PH结构域明显。COS-7细胞中CFP-和YFP-融合的FAPP1-PH结构域之间的FRET测量值在添加离子霉素后迅速下降，在Ca2+螯合作用。大约50%的这种增加对Wm（10μM）处理敏感（A，图表）。（B） 分别通过GFP和mRFP融合PH结构域的共表达同时监测FAPP1-PH和PLCδ1-PH结构区的易位。在离子/EGTA处理后，红色和绿色信号的共定位不如OSBP-PH域显著。融合到CFP和YFP的相同结构域（FAPP1-PH-CFP和PLCδ1-PH-YFP）之间的FRET测量结果显示，初始FRET没有变化，在离子霉素处理后也没有变化。FRET值；然而，Ca后增加到基线以上2+螯合作用。FRET分析显示FAPP1-PH运动的质膜成分小于OSBP-PH，并且在Wm处理后也显著降低。
图10。
图10。
PI4K亚型下调或抑制的COS-7细胞中OSBP-和FAPP1PH-GFP的重新定位。用siRNA处理细胞并用质粒DNA转染，如图5图例所示。在蔡司410激光共聚焦显微镜的温控台上，在35°C温度下对细胞进行了活体研究。用离子霉素（10μM）刺激细胞，直到其大部分局部PH结构域从高尔基体中释放出来（2-3分钟），此时Ca2+通过添加EGTA（7 mM）进行螯合，并在3–7分钟后记录图像。当需要时，在存在或不存在1 mM DTT的情况下，在离子霉素前10分钟添加PAO（10μM）。注意，在PAO处理的细胞或PI4KIIIα下调的细胞中，两个PH域的显著质膜定位被取消。
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