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.2004年11月22日；167(4):769-81.
doi:10.1083/jcb.200408028。

肿瘤细胞通过细胞外基质的运输由膜锚定胶原酶MT1-MMP控制

法里德·萨贝赫 1, 大田一郎, 肯·霍姆贝克, 亨宁·比克达尔·汉森, 索罗威, 米拉格罗斯·巴尔宾, 卡洛斯·洛佩斯·奥廷, 史蒂文·夏皮罗, 稻田正树, 斯蒂芬·克莱恩, 爱德华·艾伦, 杜安·钟, 史蒂芬·J·维斯
附属公司

肿瘤细胞通过细胞外基质的运输由膜锚定胶原酶MT1-MMP控制

法里德·萨贝赫等。 J细胞生物学. .

摘要

当癌细胞穿过富含胶原蛋白的细胞外基质（ECM）屏障并进入血管内时，它们采用成纤维细胞样表型，并参与介导侵袭活性的未定义的蛋白水解级联反应。在此，我们发现成纤维细胞和癌细胞表现出难以区分的细胞周胶原酶溶解活性，使它们能够穿过ECM。利用从基因靶向小鼠分离的成纤维细胞，确定了基质金属蛋白酶（MMP）依赖性活性，该活性独立于纤溶酶原、明胶酶a/TIMP-2轴、明胶蛋白酶B、胶原酶-3、胶原酶-2或基质溶素-1驱动侵袭。相反，在成纤维细胞或肿瘤细胞中删除或抑制膜栓系MMP（MT1-MMP）的表达会导致体外或体内胶原蛋白溶解和侵袭活性的丧失。因此，MT1-MMP是赋予正常或肿瘤细胞侵袭活性所必需的主要细胞相关蛋白酶。

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数字

图1。
图1。
成纤维细胞和肿瘤细胞的胶原蛋白无创性和降解活性。（A） 在培养期开始（0 d）或6 d后，在含有10%血清的PDGF-BB（10 ng/ml）的三维胶原凝胶（2.2 mg/ml）上培养的成纤维细胞单层的透射电子显微照片，无论是否含有5μM BB-94。在侵入细胞周围观察到胶原清除区（中间，箭头）。双头箭头表示底层凝胶的位置。棒材，10μm。（B） 罗丹明标记胶原蛋白凝胶（2.2 mg/ml）与成纤维细胞和PDGF在10%血清中孵育0或6天，在没有或存在BB-94的情况下的激光共焦显微照片。棒材，10μm。（C） 胶原蛋白横截面的免疫荧光染色显示，在BB-94不存在但不存在的情况下，浸润的成纤维细胞（红色箭头）周围存在变性胶原蛋白（绿色箭头）区域。棒材，100μm。（D） 在胶原蛋白凝胶（2.2 mg/ml）上培养的SCC-1单层的光显微照片，在没有或存在BB-94的情况下，用10%血清中的肝细胞生长因子（HGF；50 ng/ml）刺激0或4天。箭头表示侵袭细胞岛。棒材，100μm。（E） HGF刺激的SCC-1细胞在罗丹明标记胶原凝胶的三维凝胶上在10%血清中培养4d，并通过激光共聚焦显微镜评估隧道行为。在BB-94存在的情况下，未观察到隧道。SCC-1细胞（用DAPI和指骨苷染色）侵入罗丹明标记的、胃蛋白酶提取的胶原蛋白凝胶，而不产生隧道。（F和G）成纤维细胞（F）或肿瘤细胞（HT1080和SCC-1；G）侵袭和胶原蛋白溶解活性分别在添加10%血清的三维胶原蛋白凝胶（2.2 mg/ml）中监测6或4天，无抑制剂或有抑制剂。结果表示为三个或更多实验的平均值±1 SEM。
图2。
图2。
成纤维细胞MMP表达谱和胶原蛋白溶解活性。（A，top）RT-PCR分析在含有PDGF的10%血清中培养3天的胶原凝胶上的野生型和无效成纤维细胞的MMP表达。（底部）从野生型MMP-2中回收的无血清上清液的明胶酶谱−/−，TIMP-2型−/−，或MT1-MMP−/−单独与PDGF或TIMP-1或TIMP-2培养的成纤维细胞。野生型成纤维细胞表达前MMP-2（黑箭头），并通过TIMP-2敏感性过程生成成熟的MMP-2。MMP-2中未检测到MMP-2−/−培养物中，而TIMP-2中未产生成熟的MMP-2−/−文化。高M的身份第页TIMP-2上清液中的胶溶物种−/−成纤维细胞尚不清楚。（B和C）通过共聚焦激光显微镜（B）或羟脯氨酸释放（C）评估接种在I型胶原膜上的成纤维细胞的胶原分解活性。成纤维细胞接种在100μg/2.2 cm2罗丹明标记的胶原膜，在10%自体小鼠血清中用PDGF刺激，不含BB-94或用BB-94刺激，或在20μg/ml纤溶酶原存在下用PDGF在无血清条件下培养5天。（B）野生型或MT1-MMP−/−在合并图像（序列中的第一、第九和最后两张图像）中，用钙黄绿素-AM（绿色）和DAPI（蓝色）标记成纤维细胞。棒材，100μm。（C） 在没有或存在TIMP-2的情况下，在不含或含PDGF的10%血清中监测羟脯氨酸的释放。结果表示为三个或更多实验的平均值±1 SEM。
图3。
图3。
MT1-MMP调节肿瘤细胞中胶原蛋白的降解活性。（A） HT-1080细胞（5×10）的降解活性4)在罗丹明标记的I型胶原膜（100μg/2.2 cm）上培养2)单独使用10%的血清（HT-1080；用指骨苷/DAPI染色）或BB-94、TIMP-1或TIMP-2染色。在用21-bp MT1-MMP siRNA（MT1-siRNA）电穿孔前后或用小鼠MT1-MMP-质粒（mMT1）共电穿孔后，用共焦激光显微镜监测胶原降解区。培养2天后，从对照或MT1-siRNA处理的HT-1080或SCC-1细胞中回收的无血清上清液的明胶酶谱（底部）。酶谱分析表明，MMP-2（72 kD）和MMP-9（92 kD）的表达不受MT1-siRNA的影响。对照组HT-1080细胞产生前MMP-2（黑箭头）和成熟MMP-2。（C） HT-1080细胞要么用对照siRNA、MT1-siRNA处理，要么用MT1-siRNA和MMP-1共同电穿孔RXKR公司，基质金属蛋白酶-13RXKR公司，基质金属蛋白酶-2RXKR公司或mMT1-MMP表达载体，在10%血清中罗丹明标记的I型胶原膜上培养3d，并通过共焦激光显微镜监测胶原降解区。在经MT1-siRNA处理的HT-1080细胞的分割图像的顶部，胶原膜上方显示了经指骨样蛋白/DAPI染色的肿瘤细胞，而下部仅显示了底层胶原层。结果代表了四个执行的结果。棒材，100μm。
图4。
图4。
成纤维细胞MT1-MMP介导胶原蛋白侵袭活性。（A–C）在I型胶原凝胶（2.2 mg/ml；顶部两行，2-D）顶部或10%血清中的三维胶原凝胶（2.2mg/ml；底部一行）内培养野生型和无野生型成纤维细胞，并在没有或存在TIMP-2的情况下用PDGF梯度（10ng/ml）刺激6d。面板左侧的箭头表示胶原单层的表面或成纤维细胞岛的边缘。凝胶内的箭头指示侵入成纤维细胞的位置。棒材，100μm。在含有10%野生型血清的三维胶原蛋白凝胶中定量侵袭（B）和胶原蛋白降解（C），以备MMP-2实验−/−，基质金属蛋白酶-9−/−，或TIMP-2−/−成纤维细胞，其中从各个小鼠菌株中分离出无效血清。结果表示为三个或更多实验的平均值±1 SEM。
图5。
图5。
野生型和MMP-全成纤维细胞侵袭CAM。（A） 用荧光微球（绿色）标记野生型、MMP缺乏型或FAP-null小鼠的成纤维细胞，并将其接种在11日龄小鸡CAM上，培养3天。CAM横截面的荧光显微照片显示了小鼠成纤维细胞穿透CAM表面的能力（CAM表面经DAPI染色的鸡细胞蓝色细胞核用箭头突出显示）。MT1-MMP−/−MT1-MMP瞬时转染逆转了缺陷−/−含有MT1-MMP的细胞。结果代表了四个执行的结果。棒材，100μm。（B） 侵袭被量化为穿过CAM表面的野生型或空成纤维细胞的百分比以及三个或更多成纤维细胞前缘的平均侵袭深度。结果表示为至少三个实验的平均值±1 SD。
图6。
图6。
MT1-MMP促进癌细胞侵袭和灌注。（A和B）HT-1080或SCC-1细胞与TIMP-1、TIMP-2、21-bp MT1-MMP siRNA或21-bp对照siRNA单独孵育，并在罗丹明标记的I型胶原凝胶（2.2 mg/ml）上，在含有50 ng/ml HGF的10%血清中培养3天。HT-1080和SCC-1电池的隧道行为（A）通过共焦激光显微镜监测（下图显示了指骨样肽/DAPI标记的SCC-1细胞和周围罗丹明标记的胶原的合并图像）。如B所述，对HT-1080和SCC-1细胞的侵袭灶和羟脯氨酸释放进行量化。如有指示，MT1-MMP siRNA-处理的细胞用小鼠MT1-MMP/mMT1表达载体（MT1-siRNA/mMT1）转染。（C） 荧光纳米珠标记的HT-1080或SCC-1细胞单独孵育、单独用MT1-siRNA电穿孔或与MT1-siRNA和mMT1-MMP表达载体共电穿孔对CAM的侵袭。经过三维潜伏期后，通过CAM横截面的荧光显微镜观察肿瘤细胞的侵袭。CAM曲面由箭头标记。对照siRNA、MT1-siRNA和mMT1-MMP转染MT1-siRNA-处理的HT-1080细胞的侵袭百分比分别为24±7%、1±1%和25±3%，SCC-1细胞的侵袭百分率分别为15.8±1%、1±2%和16±4%（平均值±1 SD；n个= 3). （D） 用对照siRNA或MT1-siRNA电穿孔并在CAM上培养3d后，HT-1080细胞对人皮肤外植体的侵袭。对照siRNA和MT1-siRNA处理的HT-1080的侵袭细胞百分比和侵袭深度分别为16.9±5.9%和144.1±47.6μm，2.9±0.2%和22.9±10.8μm。（E） 通过PCR从HT-1080或SCC-1细胞的下部CAM中提取的DNA，在三维孵育期后检测到肿瘤细胞的内流/外渗为Alu序列。小鸡GAPDH（chGAPDH）用作装载控制。结果代表了所进行的四个实验。棒材，100μm。
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