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.2004年10月；24(19):8649-61.
doi:10.1128/MCB.24.19.8649-8661.2004。

DeltaN-plakoglobin对表皮生长和分化的β-catenin依赖性和非依赖性影响

托利埃J 1, M M Faraldo先生, M Shtutman先生, W伯奇迈尔, J Huelsken先生, J P Thiery公司, M A Glukhova公司
附属公司

DeltaN-plakoglobin对表皮生长和分化的β-catenin依赖性和非依赖性影响

托利埃J等。 分子细胞生物学. 2004年10月.

摘要

β-连环蛋白和斑球蛋白均可刺激Lef/Tcf靶基因的体外表达。已知β-连环蛋白与Lef/Tcf因子相关，并直接参与体内的转录激活，而斑球蛋白在转录调控中的作用研究较少。为了分析斑球蛋白在体内的功能，我们培育了在表皮中表达N-末端截断斑球蛋白（DeltaN122-PG）的转基因小鼠，该转基因小鼠缺乏糖原合成酶激酶3beta磷酸化位点，因此可以防止降解（转基因系K5-DeltaN122-PG）。DeltaN122-PG的表达导致了额外的毛发细菌、增生的毛囊和非侵袭性毛囊肿瘤的形成，这一表型与N末端截断的β-catenin的表达所诱导的表型相似。然而，如果在β-catenin-null表皮中表达，DeltaN122-PG不会诱导新的毛囊细菌和毛囊肿瘤。因此，DeltaN122-PG在体内不能替代β-catenin的信号功能，在K5-DeltaN122-PG小鼠皮肤中观察到的表型一定是由于β-catentin信号的异常激活所致。另一方面，β-catenin-null皮肤中DeltaN122-PG的表达显著提高了突变小鼠的存活率，挽救了分化，限制了滤泡间表皮的过度增殖，提示斑球蛋白可能参与表皮分化所必需的细胞内信号传导事件。

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数字

图1。
图1。
斑球蛋白和β-连环蛋白在角质形成细胞中的外源性表达和皮肤中的转基因表达的反激活作用。（A） 在转基因小鼠表皮中K5启动子控制下用于表达的斑球蛋白构建物。（B） ΔN122-PG、斑球蛋白和ΔN57-β-catenin激活（左侧）TOPFLASH荧光素酶报告子。Pam212小鼠角质形成细胞与TOFLASH或FOPFLASH瞬时共转染，如有指示，与LEF-1（62.5 ng）、ΔN122-PG、全长斑球蛋白或ΔN57-β-连环蛋白（每个，125 ng）质粒共转染。通过ΔN57-β-catenin和ΔN122-PG或斑球蛋白共同激活（右侧）TOPFLASH。为了研究斑球蛋白对ΔN57-β-catanin激活TOPFLASH的影响，将不同数量（62.5、125和250 ng）的ΔN22-PG或全长斑球蛋白质粒与ΔN57/β-catening质粒（125 ng）共转染。数字（0.5、1.0或2.0）表示斑球蛋白与ΔN57-β-catenin质粒DNA的比率。对转染效率的值（bar）进行了校正，并表示了与仅使用TOPFLASH或FOPFLASH.获得的值相比的激活水平。一式三份的代表性实验数据显示为误差条。通过Western blotting分析转基因小鼠皮肤中ΔN122-PG和斑球蛋白的（C至E）表达。C组显示了用抗HA-tag和抗β-catenin抗体探测的3个月龄雄性K5-ΔN122-PG和K5-PG小鼠（第44行和第1行，显示高水平转基因表达）的皮肤蛋白提取物获得的Western blots。注意K5-PG和K5-ΔN122-PG皮肤中的转基因表达水平相似。图D显示了3个月大的雄性K5-ΔN122-PG小鼠皮肤的蛋白质提取物（第44和51行，显示出高水平的转基因表达）。抗-HA标签抗体检测转基因产物，而针对斑球蛋白C末端部分的抗体检测内源性斑球蛋白和转基因产物ΔN122-PG。E组显示3个月龄雄性野生型和K5-PG小鼠（第1、8和15行）皮肤样本中的斑球蛋白表达水平。用抗HA-tag抗体分析两个野生型和五个K5-PG小鼠（一个来自15号系，两个来自8号系和1号系）的皮肤蛋白提取物，以检测转基因表达，并用识别内源性血小板球蛋白和转基因产物（总血小板球蛋白）的血小板球蛋白C末端抗体进行分析。请注意，转基因小鼠皮肤样品中的总斑球蛋白水平没有改变。K5用作装载控制。WT，野生型。
图2。
图2。
K5-ΔN122-PG小鼠表皮的皮肤损伤。（A） K5-ΔN122-PG小鼠的口吻、尾巴和爪子的皮肤损伤。（B） 野生型和K5-ΔN122-PG（第44行）小鼠足背皮肤的整体染色。注意所有可见毛囊的异常形状。hf，毛囊；hhf，毛囊增生。（C和D）6个月龄野生型和K5-ΔN122-PG（第12行）小鼠尾部皮肤切片的苏木精和伊红染色。面板D显示了面板C中显示的一个异常毛囊，但放大倍数较高。注意表皮增厚（ep），异常毛胚（hg），异位皮脂细胞（s）。hf、毛囊、sg、皮脂腺。E组显示了野生型和K5-ΔN122-PG小鼠表皮的透射电镜超微结构分析。大箭头表示野生型和K5-ΔN122-PG（中央面板，第12行；右面板，第44行）表皮中的细胞-细胞连接，小箭头表示桥粒，箭头表示基底膜。星号表示在K5-ΔN122-PG小鼠表皮基底层和棘层观察到的细胞间隙，显示出高水平的转基因表达和严重的表型。插图显示单个桥粒。WT，野生型，Tr，转基因。棒=0.4 mm（B）、80μm（C）、40μm（D）、1.2μm（E）和90 nm（插入）。
图3。
图3。
K5-ΔN122-PG小鼠表皮增生。（A） 对6个月龄小鼠背部爪子皮肤进行连续冷冻切片。在野生型皮肤中，K5表达于基底层，K10表达于基底上棘层，而K6仅限于毛囊，表皮中不存在。在K5-ΔN122-PG皮肤（第44行）中，K6在基底层角质形成细胞中表达，而K5和K10分别在基底层和基底层上角质形成细胞中正常表达。用抗HA-tag抗体在基底细胞中检测到转基因产物。hf，毛囊。面板A和C中的虚线表示基底膜的位置。（B） 野生型和K5-ΔN122-PG（品系12）6月龄雄性小鼠尾部表皮BrdU-incoming细胞的免疫组织化学。（C） 免疫荧光染色分析cyclin D1（Cyc D1）在野生型和K5-ΔN122-PG（品系12）6月龄雄性小鼠尾部表皮的分布。注意，在转基因小鼠皮肤中经常观察到含有核细胞周期蛋白D1的基底角质形成细胞簇。（D） cyclin D1在野生型和K5-ΔN122-PG小鼠皮肤中的表达。使用抗细胞周期素D1抗体对2只野生型和3只K5-ΔN122-PG（品系12）3个月龄雄性小鼠的皮肤蛋白提取物进行Western blot分析。去除印迹并用抗-HA-抗体重制，以确定转基因产品水平，并用抗K5抗体作为负荷控制。棒材=50μm（A）和25μm（B和C）。WT，野生型。
图4。
图4。
K5-ΔN122-PG转基因小鼠皮肤毛囊增生。（A） 用抗HA-tag对K5-ΔN122-PG 6月龄雄性小鼠（第12行）的背爪皮肤冷冻切片进行双重免疫荧光染色，显示ΔN122-PG和抗E-cadherin抗体。转基因产物存在于异常毛囊的外层细胞层。注意扩张的毛囊，大量异常的毛胚，以及由先前存在的毛囊形成的毛囊。（B） 抗层粘连蛋白抗体染色K5-ΔN122-PG 6个月大雄性小鼠（12系）足背皮肤增生毛囊周围的基底膜。（C） En1在野生型和K5-ΔN122-PG（第51行）皮肤中的表达。用免疫组织化学方法对含有石蜡的石蜡包埋皮肤样品进行检测。野生型小鼠背部皮肤切片，显示生长期（a）和休止期（b）的毛囊。En1仅在毛囊的低周期部分发现。在K5-ΔN122-PG小鼠尾部皮肤（c）中，在异常毛囊中检测到大量En1-阳性细胞。含有异位皮脂细胞的头发细菌和肿瘤没有En1染色。（D和E）K5-ΔN122-PG转基因小鼠皮肤中的皮肤囊肿（第44行）。在K5-ΔN122-PG小鼠（D）背爪皮肤的卵泡囊肿中，许多细胞被抗毛囊角蛋白抗体AE13（绿色）染色。K1（红色）是早期表皮角质形成细胞终末分化标志物，未检测到。DAPI染色显示为蓝色。在K5-ΔN122-PG小鼠口吻皮肤表皮样囊肿中，外壁层细胞表达K5（绿色），而最内层细胞表达K10（红色）。c、 囊肿；dhf，毛囊扩张；ec，表皮样囊肿；表皮；fc，滤泡囊肿；hhf，增生性毛囊；hg，毛囊胚；m、 矩阵；前皮质；s、 皮脂细胞。棒材=50μm（A、B、c、D和E的框架A和c）和25μm（c、框架B）。
图5：。
图5：。
转基因产物在K5-ΔN122-PG皮肤中的细胞内分布。（A） 共焦显微镜下，通过K5-ΔN122-PG小鼠（第12行）表皮，用抗结蛋白（DP）和抗HA-tag抗体对冷冻切片进行双重免疫荧光染色，以检测ΔN122-PG。在表皮中，在与结蛋白共定位的细胞-细胞边界处发现ΔN22-PG。虚线表示基底膜的位置。（B和C）通过K5-ΔN122-PG小鼠背爪皮肤毛囊肿瘤对石蜡包埋切片进行双重免疫荧光染色（第12行）。B组显示用抗体标记斑球蛋白的C末端部分，显示内源性蛋白和转基因产物，并用抗体标记HA-tag，检测ΔN122-PG。在K5启动子不活跃的内层细胞中，仅用抗斑球蛋白抗体染色细胞-细胞边界，而这两种抗体都染色了基底细胞层的大量细胞核。箭头表示斑球蛋白和HA-tag阳性细胞核。注意，只有HA-阳性细胞核用抗血小板球蛋白抗体染色。C组显示用抗β-连环蛋白和抗HA-tag抗体标记。箭头表示细胞核被β-catenin强烈染色。DAPI染色细胞核。棒材=5μm（A）和12μm（B和C）。
图6。
图6：。
通过野生型和突变型（K14-βcat）部分恢复表达ΔN122-PG.（A）的β-catenin-null表皮的分化−/−和K14-βcat−/−-K5-ΔN122-PG）1个月龄雄性小鼠背部皮肤用苏木精和伊红染色。注意K14-βcat表皮异常增厚−/−小鼠皮肤与K14-β猫表皮结构的改善−/−-K5-ΔN122-PG小鼠。在野生型皮肤中，毛囊处于生长期，而在突变小鼠皮肤中，毛囊循环停止。（B） 野生型和突变型（K14-βcat）中增殖和分化标记的表达−/−和K14-βcat−/−-K5-ΔN122-PG）小鼠表皮。从1个月大的小鼠身上切下甲硫氨酸固定石蜡包埋的背部皮肤。注意，β-catenin-null表皮中ΔN122-PG的表达降低了增殖和K6和K14的表达，恢复了K10的表达以及表皮基底层中C/EBPβ的核定位。箭头表示β-catenin-null表皮基底层上的BrdU阳性细胞核。（C） C-Myc在野生型和突变2个月龄小鼠表皮中的表达。含副甲醛的石蜡包埋背部皮肤部分。在K14-βcat中，核c-Myc染色可见大量基底和基底上角质形成细胞−/−-K5-ΔN122-PG皮肤。箭头表示c-Myc阳性细胞核。棒材=60μm（A）和15μm（B和C）。WT，野生型。
图7。
图7。
E-cadherin和catenins在野生型和突变小鼠皮肤中的亚细胞分布。（A） 通过Western blotting（B）免疫沉淀法测定E-cadherin、β-catenin、plakoglobin和抗HA-tag抗体在皮肤提取物的洗涤剂-可溶性（S）和不溶性（I）组分之间的E-cadherin和catenin分布。免疫沉淀物经Western blotting分析。来自野生型皮肤提取物（WTS）的洗涤剂可溶性部分用作HA-tag免疫沉淀物的对照。*，全长斑球蛋白的位置；**，ΔN122-PG.（C）共焦显微镜的位置。通过2个月大的K14-βcat进行冷冻−/−(β−/−)和K14-βcat−/−-K5-ΔN122-PG（β−/−ΔN-PG）小鼠表皮。箭头表示K14-β猫细胞-细胞边界处的抗去丝蛋白激酶抗体的特征性斑片状染色−/−-K5-ΔN122-PG表皮。棒材=10μm（上面板）和5μm（下面板）。
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