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.2003年2月；71（2）：973-84。
doi:10.128/IAI.71.2.973-984.2003。

感染初期沙眼衣原体囊泡与内吞小室的限制性融合

Marci A Scidmore公司 1, 伊丽莎白·费舍尔, 特德·哈克斯塔特
附属公司

感染初期沙眼衣原体囊泡与内吞小室的限制性融合

Marci A Scidmore公司等。 感染免疫. 2003年2月.

摘要

衣原体包涵体在真核细胞内占据一个独特的生态位，它不与内吞小室相互作用，而是与含鞘磷脂的胞外小泡亚群融合。沙眼衣原体包涵体在感染后2小时即获得这些独特的特性，这可以通过获得由6[N-[（7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基）氨基]己酰基鞘氨醇]（C（6）-NBD-神经酰胺）内源性合成的鞘磷脂的能力来证明。除了需要早期衣原体转录和翻译外，还不清楚包涵体性质转化和细胞相互作用的分子机制。虽然包涵体的性质是在感染后2小时确定的，但在与外细胞途径融合之前的短暂间隔内与内吞途径的相互作用程度尚不清楚。使用共焦显微镜和电子显微镜联合定位感染早期沙眼衣原体感染细胞中的内吞和溶酶体标记，我们证明在包涵体的包涵膜或内腔中缺乏这些标记物，从而得出结论，在感染早期的这段时间内，新生的衣原体包涵体与内腔的相互作用最小。即使在蛋白合成抑制剂存在的情况下，通过培养避免改变包涵体的性质，含有基本体的囊泡也很难获得溶酶体特征。这些结果表明衣原体避免溶酶体融合的机制有两个阶段：（i）由于基本体的固有特性，导致溶酶体成熟延迟的初始阶段，以及（ii）需要衣原体蛋白合成的包涵体的囊泡相互作用的积极改变。

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图1。
图1。
宿主质膜脂质和蛋白质是包裹内化EB的内胚小泡的成分。（A） HeLa 229细胞质膜在感染沙眼衣原体L2，感染后30分钟进行透射电镜检查。（B） HeLa细胞质膜在感染前用NHS-生物素标记沙眼衣原体L2和生物素化蛋白在感染后3小时用阿维丁纳米金检测。银增强后的电子致密沉积物在新生包涵膜中可见。箭头表示细胞内EB。棒材，0.5μm。
图2。
图2。
电子显微镜显示Tf-HRP的存在与沙眼衣原体进入点的EB。（A） Tf-HRP分布使发育中的内体出现出芽的现象，即使内体正在形成（白色箭头）。（B） 内部EB（黑色箭头）不显示标记。
图3。
图3。
在感染早期的不同时间，新生衣原体包涵体与再循环内体的联系。沙眼衣原体在与Tf-HRP孵育之前，允许EB附着并进入。管状内体内可见电子致密反应产物。在感染后0（A）和1（B）h，与再循环内体无明显关联。感染后2小时（C），管状内体（箭头）与新生包涵体紧密并列，尽管与这些小泡没有明显融合。氯霉素抑制衣原体蛋白合成可防止EB（D）附近再循环内体的增生。棒材，0.5μm
图4。
图4。
感染后不同时间新生衣原体包涵体与EEA1的相关性。（A） HeLa 229细胞被感染沙眼衣原体L2，在感染后的不同时间（以分钟为单位），EB和EEA1（在合并图像中分别显示为绿色和红色）。（B）肠炎沙门氏菌使用伤寒血清型作为阳性对照，在感染后15分钟显示抗EEA1的环向染色。图中还显示了相应的Nomarski微分干涉对比度（DIC）图像。箭头表示沙门氏菌-含有液泡。
图5：。
图5：。
内吞免疫过氧化物酶染色沙眼衣原体电子显微镜观察感染后4小时的EB。（A） 变压器。（B） M6PR。（C） 灯1。（D） 阴性对照，其中一级抗体是抗TfR抗体，但与HRP结合的二级抗体被省略。箭头标识每个面板中的几个EB。棒材，0.2μm。
图6。
图6。
感染多重性对TfR再分配的影响。HeLa细胞以0（未感染对照）（A和D）、10（B和E）或100（C和F）EBs/细胞的感染倍数感染，并同时用异硫氰酸荧光素结合的抗兔二级抗体（A、B和C）对EBs进行染色以定位EBs以及在感染后4小时用德克萨斯州Red-conjugated抗鼠二级抗体（D、E和F）检测TfR。图D和图E中的箭头表明表达TfR的早期内体的典型组织集中在高尔基体周围区域。图F中的箭头表示TfR在早期包裹体聚集物相同区域的浓度。棒材，10μm。
图7。
图7。
溶酶体与氯霉素抑制EB融合的速率。HeLa细胞被感染沙眼衣原体L2 EB或假结核耶尔森菌在感染后的不同时间进行固定，并用抗LAMP1单克隆抗体作为溶酶体标记物进行免疫电镜染色。（A） 氯霉素抑制的免疫电镜观察沙眼衣原体L2 EB和假结核耶尔森菌LAMP1染色。左侧面板中的箭头识别LAMP1染色阳性的EB；箭头表示LAMP1的EB为负值。（B） 氯霉素抑制的LAMP1阳性空泡分析沙眼衣原体L2 EB和假结核耶尔森菌。每个时间点至少对100个细菌进行评分，并绘制显示溶酶体标记证据的百分比。沙眼衣原体在感染后12或24小时检查时，允许正常复制（无抗生素）未显示溶酶体标记（未显示）。
图8。
图8。
的融合沙眼衣原体含有鞘磷脂小泡的包涵体需要衣原体早期蛋白质合成。HeLa 229细胞在指定的时间间隔内被氯霉素（CAP）以高度多重感染率感染。在感染后8小时，培养物被标记为C6-NBD-神经酰胺（A、B和C）或用抗L2 EB抗血清（D、E和F）固定和免疫荧光染色。当在氯霉素存在下孵育整个时间时，EB不能从宿主细胞获得鞘磷脂，并保持分散在细胞质中（C和F）。在加入氯霉素之前，那些被允许正常合成蛋白质2小时的培养物会与含有鞘磷脂的囊泡融合，并被正常输送到宿主细胞的高尔基体周围区域。图A和B中的箭头确定了结合了NBD鞘磷脂的高尔基体周围局部聚集体，其来源于NBD神经酰胺的代谢（15）并通过荧光显微镜检测。棒材，10μm。
图9：。
图9：。
的融合沙眼衣原体含有鞘磷脂小泡的包涵体需要持续的蛋白质合成。（A和B）HeLa 229细胞感染沙眼衣原体L2在感染后18小时用氯霉素（CAP）（B）（200μg/ml）或模拟治疗（A）治疗，并在用C标记前再培养24小时6-NBD-神经酰胺。（C） B组中受感染细胞的Nomarski图像，显示完整的内含物。箭头指示包含的位置。棒材，10μm。
图10。
图10。
衣原体蛋白合成受到抑制后，溶酶体标记物的获得与含鞘磷脂小泡的融合性丧失并不同时发生。HeLa 229细胞感染沙眼衣原体L2在感染后18 h用氯霉素（200μg/ml）处理，并在抑制剂的持续存在下培养。文化成本计算沙眼衣原体（αEB）或LAMP1。还显示了相应的Nomarski微分干涉对比度（DIC）图像。箭头指示夹杂物的位置。
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