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.2002年11月25日；159(4):613-24.
doi:10.1083/jcb.200205091。 Epub 2002年11月18日。

电压依赖性阴离子通道的重组表达增强了Ca2+微结构域向线粒体的转移

埃琳娜·拉皮齐 1, 保罗·平顿, Gyorgy Szabadkai公司, 马里乌斯·维奇科夫斯基, Gregoire Vandecasteele公司, 杰夫·贝尔德, 理查德·塔夫特, 凯文·福格蒂, 罗萨里奥·里祖托
附属公司

电压依赖性阴离子通道的重组表达增强了Ca2+微结构域向线粒体的转移

埃琳娜·拉皮齐等。 J细胞生物学. .

摘要

虽然线粒体Ca2+稳态的生理相关性已被广泛接受，但还没有关于参与这一过程的蛋白质的分子特性的信息。在这里，我们通过用靶向类胡萝卜素和钙敏感GFP测量细胞溶质和细胞器[Ca2+]，分析了线粒体外膜电压依赖性阴离子通道（VDAC）在内质网和线粒体之间Ca2+信号传递中的作用。在HeLa细胞和骨骼肌肌管中，VDAC的瞬时表达通过使Ca2+从内质网释放位点快速扩散到线粒体内膜，增强了线粒体基质Ca2+浓度的激动剂依赖性增加幅度。事实上，线粒体和细胞溶质[Ca2+]变化的高速成像显示，VDAC过度表达细胞中两个隔室中升高之间的延迟明显缩短。至于功能后果，VDAC过表达细胞更容易受到神经酰胺诱导的细胞死亡的影响，从而证实线粒体Ca2+摄取在凋亡过程中起着关键作用。这些结果揭示了广泛表达的VDAC通道的一种新功能，将其确定为Ca2+跨线粒体膜转运途径的分子组成部分。

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数字

图1。
图1。
重组表达的VDAC–GFP的细胞内分布。用VDAC–GFP转染HeLa细胞和原代肌管，置于荧光显微镜台上。按照材料和方法中的描述，对采集的图像（a和a’中显示的原始图像示例）进行计算去模糊。A和B显示了在VDAC过度表达的HeLa细胞中观察到的两种不同的荧光模式（见结果）；C显示VDAC–GFP在肌管中的定位。从HeLa细胞（A'和B'）和肌管（C'）的mtBFP图像中可以明显看到线粒体的典型杆状形态。A“、B”和C“表示重叠图像。
图2。
图2。
重组表达的VDAC–GFP在HeLa细胞中的细胞内分布。（A） 通过亚细胞分馏和免疫印迹评估内源性VDAC和VDAC–GFP定位。在插图中，还显示了细胞溶质（β-微管蛋白）和ER（SERCA）蛋白的免疫印迹，以验证通过过滤分离微粒体和细胞溶质部分（参见材料和方法）。在14%SDS-PAGE上分离来自对照（C）和VDAC–GFP转染（T）细胞的总匀浆（H；10μg/lane）、线粒体（M；10μg/mlane），带有微粒体的上清液（S+Mic；20μg/lane）和纯上清（S；20μg/klane）并用材料和方法中描述的抗VDAC多克隆抗体进行检测。显示的结果是三个重复的代表。（B） 该图显示了通过免疫印迹密度分析计算的HeLa细胞中过度表达VDAC–GFP的细胞分布(n个= 3).
图3。
图3。
VDAC过表达对线粒体Ca的影响2 + 肌管和HeLa细胞内的稳态。[加利福尼亚州2+]米在VDAC–GFP+mtAEQmut（VDAC过度表达细胞，灰色痕迹）或mtAEQmt（对照，黑色痕迹）表达细胞中进行测量。如有指示，分别用500μM卡巴胆碱和100μM组胺刺激肌管（A）和HeLa细胞（B），并将其添加到灌注介质中。这些痕迹代表了10次以上的试验。
图4。
图4。
VDAC过表达对ER-Ca的影响2 + 平衡。[加利福尼亚州2+]呃用erAEQmut测量。如有指示，用100μM组胺（A）或30μM tBuBHQ（B）攻击细胞。这些痕迹代表了10次以上的试验。VDAC过表达细胞和对照细胞的标签如图3所示。
图5。
图5。
VDAC过表达对线粒体Ca的影响2 + 在透化HeLa细胞中的摄取和在电容性Ca过程中的摄取2 + 进入完整的HeLa细胞。在A中，按照材料和方法中的描述对细胞进行渗透。如有说明，IB/EGTA替换为Ca2+-含有1、2和5μM[Ca的缓冲IB2+]. 在B中，电容Ca2+通过用补充2 mM CaCl的KRB替换KRB/EGTA，在完整的tBuBHQ处理细胞中开始进入2.追踪标签和所有条件，如图3所示。
图6。
图6。
VDAC过度表达可能影响线粒体Ca的替代机制的示意图模型2 + 动态平衡及VDAC过表达对线粒体Ca的影响2 + 反复激发的HeLa细胞的摄取。（A） 更多的VDAC分子可以诱导额外ER/线粒体“信号单位”的形成（左），也可以增加线粒体与ER接触处的外膜渗透性（右）。（B） 第一激动剂依赖性增加[Ca中Aequorin的消耗2+]米在对照细胞和VDAC过度表达细胞（分别为黑色和灰色柱）中使用高亲和力和低亲和力的线粒体靶向aequorin（mtAEQwt，mtAEQmut）。数据显示了[Ca2+]米增加，表示为实验总光放电的百分比。（C） [Ca增加的代表性痕迹2+]米用mtAEQmut测量的组胺重复刺激引起的。追踪标记和所有条件，如图3所示。
图7。
图7。
ER、VDAC和线粒体之间的空间关系。对照组和VDAC过度表达细胞的代表性图像（分别为大写字母和小写字母，n个=5）。如材料和方法中所述，对图像进行采集、去模糊、阈值处理和分析。VDAC–GFP（VDAC在转染细胞中过度表达，在对照细胞中无信号）（A和A）；抗坏血酸标记（B和B）；mtBFP（C和C）；mtBFP和抗坏血酸之间的三维叠加，在这两个图像中，与ER共定位的线粒体表面百分比为～29%（D和D）。面板E和E显示了mtBFP（蓝色）、线粒体内源性总VDAC（橙色和白色）和与钙网蛋白共定位的线粒体内源性VDAC（仅白色）之间的重叠，这两种情况下几乎占线粒体内源性总体VDAC的63%。图f显示了mtBFP（蓝色）、总过表达线粒体VDAC–GFP（绿色和白色）和与钙网蛋白共定位的线粒体VDAC-GFP（仅白色）之间的重叠。
图8。
图8。
线粒体和细胞溶质[Ca的同步单细胞成像2 + ]单个单元格中的变化。在A中，显示了Fura-2/AM（顶部）和mt-CaMgaro（底部）的成像。黑白图像显示细胞内Fura-2/AM和三维CaMgaroo分布。伪彩色图像（Fura-2/AM的350 nm/380 nm比值和CaMgaro的514激发）显示了组胺（10μM）吸入5 s后荧光的变化。在每个时间点（间隔200 ms），[Ca2+]如材料和方法中所述，在细胞质和线粒体中同时测量。在B中，表示[Ca荧光（f.a.u.，荧光任意单位）变化的痕迹2+]c（c）（虚线）和[Ca2+]米（连续线）。图像和痕迹是六次试验的代表。
图9。
图9。
C类2神经酰胺诱导细胞死亡和细胞内Bax定位。（A） 用C2对照组（mtGFP-转染）和VDAC过度表达（VDAC–GFP-转基因）细胞中的神经酰胺（10μM）。数据显示了存活细胞群中GFP荧光细胞的百分比（见结果）。平均值是通过分析三个独立实验中>50个字段得出的。（B） VDAC过表达对HeLa细胞内Bax分布的影响。免疫印迹法检测Bax定位。在14%SDS-PAGE上分离来自对照（C）和VDAC–GFP转染（T）细胞的总匀浆（H；10μg/lane）、线粒体（M；10μg/mlane），带有微粒体的上清（S+Mic；10μg/klane）和纯上清（S；10μl/lane）并用材料和方法中描述的Bax多克隆抗体进行检测。显示的结果是三个重复的代表。（C） 该图显示了通过免疫印迹密度分析计算出的Bax在HeLa细胞中的细胞分布(n个= 3).
图10。
图10。
C诱导线粒体网络的形态学变化2神经酰胺。在加入C2神经酰胺（10μM）。这些图像代表了10多个独立实验，得出了类似的结果。
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