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.2002年8月19日；158(4):647-57.
doi:10.1083/jcb.200205057。 Epub 2002年8月19日。

人类沉默信息调节器（Sir）2同源hSIRT3是一种线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性脱乙酰酶

比约恩·施沃 1, Brian J North公司, 罗伊·A·弗莱, 梅兰妮·奥特, 埃里克·威尔第
附属公司

人类沉默信息调节器（Sir）2同源hSIRT3是一种线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性脱乙酰酶

比约恩·施沃等。 J细胞生物学. .

摘要

酵母沉默信息调节器（Sir）2蛋白通过其依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的组蛋白脱乙酰酶活性将细胞代谢和转录沉默联系起来。我们报道哺乳动物细胞线粒体含有NAD依赖的脱乙酰酶活性。这种活性被NAD水解产物烟酰胺抑制，但不被曲古菌素A抑制，这与III类脱乙酰酶一致。我们将该脱乙酰酶鉴定为核编码的人类Sir2同源物hSIRT3，并表明hSIRT2位于线粒体基质中。hSIRT4的线粒体输入依赖于富含碱性残基的NH2末端两亲性α-螺旋。hSIRT3在线粒体基质中通过蛋白质水解作用被加工成28-kD的产物。这一过程可以用重组线粒体基质处理肽酶（MPP）在体外重建，并被精氨酸99和100突变所抑制。hSIRT3的未加工形式不具有酶活性，在MPP切割后在体外完全激活。这些观察结果表明，存在一种潜在的III类脱乙酰酶，该酶在输入人类线粒体时被催化激活。

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图1。
图1。
线粒体含有类Sir2脱乙酰酶活性。（A） 从HEK293T细胞制备线粒体裂解物，并在25°C下，在NAD（1 mM）存在或不存在或与烟酰胺（5 mM）或TSA（400 nM）结合2 h的情况下，对组蛋白H4肽的脱乙酰酶活性进行检测。按照材料和方法中的描述对释放的乙酰基进行定量。给出了一个具有代表性的实验。（B） 转染hSIRT3后从全细胞裂解物（顶部）或纯化线粒体（底部）获得的抗FLAG免疫沉淀物的Western blot分析。由于免疫沉淀中使用了不同数量的细胞和线粒体裂解物，因此无法对顶部和底部面板进行定量比较。（C） 用抗FLAG抗体从转染HEK293T细胞的全细胞裂解物中免疫沉淀hSIRT蛋白，并在NAD（1 mM）存在或不存在的情况下进行分析。（D） 对转染hSIRT蛋白的HEK293T细胞纯化线粒体进行裂解，并对FLAG标记蛋白进行免疫沉淀和体外脱乙酰酶活性分析。（E） 从转染hSIRT3–FLAG（WT）、hSIRT3N229A–FLAG、hSIRT 3H248Y–FLAG或对照载体（pFLAG）的HEK293T细胞中分离出线粒体。制备裂解液并测试其脱乙酰酶活性。（F） 通过Western blotting分析线粒体野生型和突变型hSIRT3。检测到两种hSIRT3–FLAG特定形式（星号）。
图2。
图2。
hSIRT3在线粒体中的亚细胞定位。（A） 将hSIRT3–GFP转染到盖玻片上生长的HeLa细胞中。细胞用线粒体标记物MitoTracker染色，包埋，并用共焦激光扫描显微镜进行分析。（左）hSIRT3–GFP融合蛋白的荧光。（中）同一焦平面中线粒体的MitoTracker荧光染色。（右）显示两种染色模式完全重叠的合并图像。（B） 转染hSIRT3–FLAG的HEK293T细胞通过差速离心进行均质和分级。用免疫印迹法分析等量（30μg）的重膜（HM）、轻膜（LM）和细胞溶质蛋白（S-100）组分。用单克隆M2抗FLAG抗体检测发现hSIRT3–FLAG。检测到两种hSIRT3–FLAG特异性形式（星号）。将硝化纤维素膜剥离，并用抗细胞色素c（cyt c）和Hsp90α的抗体重新处理。（C） 从HEK293T细胞制备线粒体，用多克隆兔hSIRT3抗血清或同一兔获得的免疫前血清对裂解产物进行Western blotting分析。在NAD不存在（−）或存在（+）的情况下，对等量的免疫沉淀进行体外脱乙酰酶活性分析。
图3。
图3。
NH 2 -hSIRT3的末端区域是线粒体输入所必需的。（A） hSIRT3原理图。橙色方框表示线粒体靶向区域（左）。NH的部分2-末端区域显示出形成两性α-螺旋的高概率（中间）。残基4–21的螺旋轮图显示，在假定螺旋的一侧（右侧）有一簇碱性氨基酸（黑色）。（B） 将生长在盖玻片上的HeLa细胞转染hSIRT3Δ1–25–GFP 36 h，用MitoTracker染色，并用共焦激光扫描显微镜进行分析。（左）融合蛋白发出的GFP荧光（绿色）。（中间）MitoTracker信号（红色）。（右）合并图像。
图4。
图4。
hSIRT3在体外的线粒体导入.（A）[35S] 将兔网织红细胞裂解物中合成的标记hSIRT3–FLAG或hSIRT2Δ1–25–FLAG在30°C下导入分离的哺乳动物线粒体。在没有Δψm（通道4）的情况下，在添加蛋白质前5分钟，通过向线粒体中添加缬霉素（1μm）、抗霉素（8μm）和寡霉素来安排导入。2、5或15分钟后，通过耗散Δψm（添加1μm缬霉素）并在0°C下孵育，停止导入。用蛋白酶K处理样品以去除非输入蛋白质。线粒体再分离和SDS-PAGE后，通过放射自显影术观察导入的蛋白质。（B） 通过磷光成像定量来自面板A的数据。（C，左）产生突变体，以评估hSIRT3的两亲性螺旋在线粒体导入中的作用。[35S] 标记的hSIRT3野生型或突变体在30°C下导入分离的线粒体20分钟。如上所述停止输入，通过蛋白酶K处理去除非输入蛋白质。再分离和洗涤的线粒体在SDS样品缓冲液中进行裂解，并通过SDS-PAGE进行分析。在每个进口样品附近加载了代表50%的单个进口反应输入的标准。（右）单个hSIRT3突变体的导入效率通过磷光成像相对于其标准进行量化。hSIRT3（WT）的导入效率设置为100%。
图5。
图5。
hSIRT3定位于线粒体基质中。（A） 从用hSIRT3–FLAG转染的HEK293T细胞中分离线粒体，并用蛋白酶K处理以去除与线粒体外表面结合的蛋白质。将线粒体制剂分开，一半用低渗缓冲液稀释以产生有丝分裂体（MP），另一半保持在等渗条件下（M）。孵育后（0°C下20分钟），用蛋白酶K再次处理线粒体和有丝分裂体，然后通过离心分离和Western blotting再次分离。内源性膜间空间蛋白细胞色素c（cytc）检测证实线粒体外膜破裂。以基质蛋白Hsp60为标记物测定线粒体内膜的完整性。使用抗FLAG M2抗体检测hSIRT3-FLAG。（B） 从转染hSIRT3–FLAG的HEK293T细胞中分离出线粒体，并用蛋白酶K处理。将制剂分开，一半再悬浮在SDS样品缓冲液中（Total，左车道）。另一半制剂重新悬浮在碳酸钠（Na2一氧化碳三)缓冲区。提取物以100000离心克在4°C时，线粒体膜（颗粒，中间通道）重新悬浮在SDS样品缓冲液中。用TCA沉淀含有可溶性和外周膜蛋白（可溶性，右车道）的上清液。样品通过Western blotting进行分析。用抗FLAG抗体检测hSIRT3。通过检测标记蛋白COXIV和mtHsp70控制碱提取。
图6。
图6。
MPP对hSIRT3的蛋白水解处理导致酶激活。（A）[35S] -标记的hSIRT3–FLAG（左）或pSu9–DHFR（右）与纯化的重组酵母MPP在27°C下培养45分钟。样品通过SDS-PAGE和放射自显影进行分析。m、 成熟型pSu9–DHFR；p、 前体形式。（B）[35S] -标记的hSIRT3–FLAG（WT）和hSIRT3R99/100G–FLAG。（右）同一实验的放射自显影。（C） 在兔网织红细胞裂解物中体外合成的未标记hSIRT3–FLAG（WT）或hSIRT3H248Y–FLAG。用抗FLAG M2-糖珠免疫沉淀FLAG标记的蛋白质，并在有或无NAD（1 mM；左）的情况下，用H4组蛋白肽分析体外脱乙酰酶活性。脱乙酰酶分析中使用的免疫沉淀物的Western blot分析（右）。
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