The lactose transport protein is a cooperative dimer with two sugar translocation pathways

doi:10.1093/emboj/20.12.3056

.2001年6月15日；20(12):3056-62.

doi:10.1093/emboj/2012.3056。

乳糖转运蛋白是一种具有两条糖转运途径的协同二聚体

L M Veenhoff先生¹, E H休伯格, B普尔曼

附属机构

PMID： 11406582
预防性维修识别码： PMC150208项目
DOI（操作界面）： 10.1093/emboj/2012.3056

乳糖转运蛋白是一种具有两条糖转运途径的协同二聚体

L M Veenhoff先生等。欧洲工商管理硕士J. 2001.

.2001年6月15日；20(12):3056-62.

doi:10.1093/emboj/2012.3056。

作者

L M Veenhoff先生¹, E H休伯格, B普尔曼

附属

¹格罗宁根大学生物分子科学和生物技术研究所生物化学系，荷兰格罗宁恩AG 9747，Nijenborgh 4。

PMID： 11406582
预防性维修识别码： PMC150208项目
DOI（操作界面）： 10.1093/emboj/2012.3056

摘要

主要促进因子超家族乳糖转运蛋白（LacS）在洗涤剂溶解状态下发生可逆的自缔合，并以二聚体的形式存在于膜中。我们在一个蛋白脂质体系统中确定了质子动力（Deltap）驱动的乳糖摄取和乳糖/甲基-β-D-半乳糖苷平衡交换的功能单元，其中一个在Deltap驱动的摄取中有缺陷的单一半胱氨酸突变体LacS-C67与全功能无半胱氨酸蛋白LacS-cl共同重建。从摄取活性与LacS-C67/LacS-cl比率之间的二次关系中，我们得出结论，Deltap驱动的摄取需要LacS的二聚状态。蛋白质脂质体的N-乙基马来酰亚胺（NEM）处理消除了LacS-C67交换活性，但不影响LacS-cl。NEM处理后，交换活性随LacS-C67/LacS-cl比值的增加呈线性下降，表明LacS的单体状态足以满足这种转运方式。我们认为，LacS的两个亚单位在与空结合位点构象重定位相关的步骤中功能耦合，这是Deltap驱动摄取的唯一步骤。

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数字

**图1。**通过LacS-C67、NEM标记的LacS-C67和LacS-cl进行TMG/乳糖交换。通过测量TMG负载的蛋白脂质体中乳糖的减少量来跟踪乳糖的转运A类₆₀₀由于Cl的减少₂也就是说，在内部sGDH氧化运输的乳糖之后。TMG用作交换反应中的反底物，因为这种乳糖类似物不被sGDH氧化。用50µM Cl将10µl蛋白质脂质体稀释成500µl 50 mM KPi pH 7.0，在0.5 min的时间点开始交换反应₂Ind加上5 mM乳糖（第i、ii和iii行）或葡萄糖（第iv行）。每个突变体的摄取量是针对三个不同的蛋白脂质体批次进行测量的，每个批次进行两次分析。线“i”表示NEM标记前后含LacS-cl的蛋白脂质体对乳糖的摄取；线“ii”和“iii”分别是含有LacS-C67和NEM标记的LacS-C67的蛋白质脂质体。吸收率根据0.7到0.9分钟（阴影区）之间吸光度的线性下降来确定。

**图2。**LacS-C67和NEM标记的LacS-C67的二聚体。通过分析超速离心法测定了DDM溶解的LacS-C67（正方形）和NEM标记的LacS-C67（圆形）的重量平均沉降系数，作为蛋白质浓度的函数。直线是最小二乘拟合，假设单体与二聚体的缔合模式；残差绘制为观测值减去计算值。

**图3。**不同LacS-C67/LacS-cl比率的蛋白质脂质体中TMG/乳糖平衡交换。如图1图例所示，测量乳糖/TMG交换转运活性。每个点是三个不同蛋白质脂质体批次的平均值，每个样品测量两次；指出了测量的标准误差。圆和正方形对应于独立的实验集。打开和关闭符号分别表示NEM治疗前后测得的活动。数据可用线性回归拟合；残差绘制为观测值减去计算值。虚线表示两种LacS物种随机形成二聚体但只有LacS-cl同型二聚体具有活性时的预测活性。

**图4。**LacS-C67和LacS-cl对Δp的吸收[¹⁴C] 在三批蛋白质脂质体中测量每个突变体（三角形、方形和圆形）的LacS-C67（开放符号）和LacS-cl（封闭符号）蛋白质脂质体对人工Δp的反应中的乳糖。

**图5。**不同LacS-C67/LacS-cl比率的蛋白质脂质体中Δp驱动的摄取。Δp驱动[¹⁴C] 乳糖转运活性如图4图例所示进行测量。每个点是三个不同的蛋白脂质体批次的平均值，并指出了标准误差。圆和正方形对应于独立的实验集。数据可以用二次函数拟合，对应于异二聚体和LacS-C67同源二聚体不活跃的情况；残差绘制为观测值减去计算值。

**图6。**LacS-cl同源二聚体Δp驱动摄取的示意图(A类)和LacS-cl/LacS-C67异二聚体(B类)和LacS-cl/LacS-C67-NEM异二聚体交换(C类). 为了简单起见，只显示了糖配体；黑色和白色椭圆分别代表来自外部和内部腔室的配体。LacS的二聚体显示为白色和黑色亚单位。在LacS-cl同型二聚体中，催化Δp-驱动乳糖摄取，配体结合位点从外表面到内表面的重新定向与另一亚单位（A）中空结合位点的相反重新定向相耦合。在含有非活性LacS-C67的异二聚体中，如果没有内部配体（B），LacS-cl就无法异构化回到外部构象。另一方面，如果糖配体既存在于内部也存在于外部（交换运输方式），则活性亚单位能够在两个方向上重新定位其结合位点（C）。

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