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.2000年10月30日；151(3):563-72.
doi:10.1083/jcb.151.3.563。

细胞角蛋白8和19在小鼠胎盘发育中的作用

Y塔迈 1, T石川, M R Bösl先生, M Mori先生, M野崎, H巴里鲍尔, R G大岛, M M Taketo先生
附属公司

细胞角蛋白8和19在小鼠胎盘发育中的作用

Y塔迈等。 J细胞生物学. .

摘要

为了研究细胞角蛋白19（K19）在发育和成体组织中的表达及其生物学作用，我们通过在胚胎干细胞中同源重组插入细菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ），使小鼠K19基因（Krt1-19）失活，并建立了种系突变小鼠。杂合子和纯合子突变小鼠都是活的、可生育的，并且看起来正常。到性交后7.5-8.0天，杂合突变胚胎在脊索板和后肠憩室中表达lacZ，反映出脊索和肠道内胚层来源于轴中胚层起源的细胞。在成年突变体中，lacZ主要在上皮组织中表达。为了研究K19和K8之间可能的功能合作和协同作用，我们构建了复合纯合突变体，其胚胎死亡约10 dpc。致命性由K19和K8正常表达的胎盘缺陷引起。早在9点。5dpc，复合突变胎盘有过多的巨大滋养层细胞，但缺乏适当的迷路滋养层细胞或海绵滋养层细胞发育，这明显导致母体血液涌入胚胎胎盘。这些结果表明，K19和K8在确保胎盘组织的正常发育方面相互配合。

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图1
图1
小鼠K19基因失活(Krt1-19)通过同源重组。（a） 野生型等位基因、靶向载体pJBX和靶向等位基因的结构。靶向载体包含两个与基因组DNA同源的区域，其中包含一个lacZ公司报告员-新选择磁带。同源重组导致外显子1大部分缺失lacZ公司记者是从Krt1-19发起人。填充框代表外显子；非编码区域显示为实线。箭头表示用于基因分型的PCR引物的位置：KO-PCR，目标等位基因的引物，WT-PCR，野生型等位基因引物。Southern杂交探针显示为实线。RI、EcoRI站点。箭头位于lacZ公司reporter-neo选择磁带显示转录方向。（b） 野生型、杂合型和纯合突变小鼠尾部DNA的基因型分析。（上图）PCR测定的目标等位基因向后代的传递。KO，靶向等位基因（739 bp）；WT，野生型等位基因（958 bp）。（下图）Southern杂交分析。4.5 kb和1.6 kb的EcoRI片段分别来自野生型和靶向等位基因。（c） 野生型、杂合型和纯合型小鼠K19 mRNA的北方杂交分析。从结肠（c）或小肠（i）中纯化的总RNA的10μg装载在每个通道中，并用K19 cDNA探针进行探测（Ichinose等人，1989年）。箭头表示K19 mRNA的大小（1.4 kb）。
图2
图2
K19基因杂合和纯合突变小鼠肠道中K19、K8、K18和K7的免疫荧光染色。成年小鼠冰冻切片用甲醇固定，并用TROMA-3（抗-K19）、-1（抗-K8）和-2（抗-K-18）及抗-K7单克隆抗体染色。
图3
图3
β-半乳糖苷酶基因的表达(Krt1-19-lacZ)在7.5–9.0dpc的杂合小鼠胚胎中。（a和b）前视图和后视图中分别为7.5 dpc的代表性胚胎。注意脊索板、结节和外胎盘锥中的β-半乳糖苷酶活性。（c） 后视图中具有代表性的8.5 dpc胚胎。注意β-半乳糖苷酶活性呈拱形（箭头所示）。（d和e）前视图（d）和后视图（e）中另一个8.5 dpc的胚胎。请注意，该胚胎的发育比c中的胚胎进展更快：后肠β-半乳糖苷酶染色的拱型（e，箭头）比c中所示的胚胎小得多。还请注意d中前肠内的染色（箭头）。（f和g）9.0 dpc的代表性胚胎。（h） 同一胚胎的横切面，如f和g所示（曙红复染）。hf，头部折叠；nc，脊索板；nd，节点；pg，原始肠道。所有解剖显微照片（全贴装原位染色）均在暗场照明下拍摄，但a和g除外，它们位于明亮的视野中。棒材，100μm。
图4
图4
小鼠胚胎外组织中K8和K19的克隆化。用TROMA-3（抗-K19）、TROMA-1（抗-K8）和抗-Kip2抗体对7.5 dpc的子宫野生型胚胎进行免疫组织化学染色。注意，K19和K8在细胞质中表达，而Kip2在细胞核中表达。（a和b）K19染色。（c和d）K8染色。（e和f）Kip2染色。epc，胎盘外锥；gc，巨细胞；糖原细胞；pe，壁卵黄囊内胚层；ve，内脏卵黄囊内胚层。请注意，a、c和e是连续截面，而b、d和f分别是a、c和e中截面的较高放大倍数。条形图：a、c和e，100μm；b、 d和f，50μm。
图7
图7
9.5dpc时K8/19复合纯合胎胎盘的退化；与K19纯合对照进行比较。（a–f）用X-gal对β-半乳糖苷酶活性进行双重染色（绿蓝色），用Kip2特异性抗体（棕色）进行双重染色，然后用苏木精进行轻度复染。请注意，X-gal的蓝色略带绿色是由于电子增强；Kip2在细胞核中表达*胎盘病变；al，尿囊；gc，巨细胞；lb，迷路滋养层；海绵滋养细胞。（g和h）通过间接免疫荧光显微镜对K7进行染色。请注意，图像g电子增强超过h。（左）K8/K19复合纯合子样本[Krt2-8号公路(−/−):Krt1-19(−/−)]. （右）简单K19纯合子样本[Krt2-8型(+/+):Krt1-19(−/−)]. 棒材：（a–f）100μm；（g和h）1μm。
图5
图5
K8/K19复合纯合突变概念中较小的胎盘和胚胎生长迟缓。（a） a类Krt2-8号公路(−/−):Krt1-19（−/−）conceptus，9.75 dpc。注意红色病变（箭头）。（b） A类Krt2-8号公路(−/−):Krt1-19（−/−）胚胎，表现出生长迟缓。（c） A类Krt2-8型(+/+):Krt1-19（−/−）conceptus，9.75 dpc。箭头表示植入部位。（d） A类Krt2-8号公路(+/+):Krt1-19（−/−）胚胎作为对照。请注意，a和c，以及b和d是在相同的放大倍数下拍摄的。（e） 比较K8/K19复合纯合子和简单K19纯合子的胎盘，β-半乳糖苷酶染色为9.75 dpc。（−/−，−/–）复合纯合子[即。，Krt2-8号公路(−/−):Krt1-19(−/−)]; （+/+，−/−）简单K19纯合子[Krt2-8号公路(+/+):19克朗(−/−)]. （f） 高倍放大e。
图6
图6
K8/K19复合纯合子和简单K19纯合子10.5 dpc胎盘区域的比较。（左）K8/K19复合纯合概念的切片[Krt2-8号公路(−/−):Krt1-19(−/−)]. （右）简单K19纯合概念的切片[Krt2-8号公路(+/+):Krt1-19(−/−)]. （β-半乳糖苷酶染色，苏木精复染。）注意，与b、d、f和h的健康巨细胞和海绵滋养层细胞相比，母血（*）和退化的尿囊组织的损伤血管较少。在正常胎盘中，β-半乳糖苷酶（K19）在巨细胞和海绵滋养层中表达，但在尿囊或迷路滋养层中不表达。注意复合纯合子中的海绵滋养层和迷路滋养层的变性。g中的箭头表示有核胚胎红细胞。al，尿囊；e、 胚胎血；gc，巨细胞；lb，迷路滋养层；m、 母血；sp，海绵滋养细胞。棒材，100μm。
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