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.2000年2月；11(2):747-63.
doi:10.1091/mbc.11.2747。

小鼠SKD1是酵母Vps4p的同源物，在哺乳动物细胞的正常内吞体运输和形态中是必需的

T吉森 1, F山形, 山本, 北水岛, Y卡贝亚, 奈良, 我是Miwako, M Ohashi先生, M Ohsumi先生, Y Ohsumi先生
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小鼠SKD1是酵母Vps4p的同源物，在哺乳动物细胞的正常内吞体运输和形态中是必需的

T吉森等。 分子生物学细胞. 2000年2月.
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摘要

小鼠SKD1是一种AAA型ATP酶，与酵母Vps4p同源，参与从内体到液泡的转运。为了阐明SKD1在哺乳动物内吞作用中的可能作用，我们产生了一个突变体SKD1，该突变体携带一个突变（E235Q），该突变相当于Vps4p中的显性负突变（E233Q）。突变SKD1在培养哺乳动物细胞中的过度表达导致转铁蛋白和低密度脂蛋白摄取缺陷。这是由于细胞表面的受体丢失。表面转铁蛋白受体（TfR）的减少与突变蛋白的表达水平相关。与野生型SKD1的扩散模式相比，突变蛋白显示出核周点状分布。TfR、溶酶体蛋白lamp-1、内吞右旋糖酐和表皮生长因子（但不是分泌途径的标记物）在突变的SKD1放大的隔间中积累。抑制表皮生长因子的降解。电子显微镜显示，这些小室是放大的多泡空泡，有许多小管-小泡延伸，包含TfR和内吞辣根过氧化物酶。早期内体抗原EEA1也重新分配到这些异常膜。综上所述，我们的研究结果表明，SKD1调节内体的形态和通过它们的膜交通。

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数字

图1
图1
GFP-融合SKD1和SKD1的构建与表达E235Q系列（A）本研究中使用的蛋白质结构示意图。在SKD1和SKD1的N端标记GFPE235Q系列以及AAA域中的Walker-type A、Walker-type B和SRH基序。建造SKD1E235Q系列，SKD1中引入了一个单点突变，导致氨基酸从谷氨酸交换到Walker B基序235位置的谷氨酰胺（箭头）。（B） HeLa细胞转染GFP-SKD1（通道1和4）、GFP-SKD2E235Q系列（通道2和5）或仅矢量（通道3和6）。使用SKD1抗体（1-3道）或GFP抗体（4-6道）对其提取物进行免疫印迹分析。
图2
图2
HeLa细胞过度表达GFP-SKD1E235Q系列未能内化Tf。用GFP-SKD1（a、c和e）或GFP-SKD1转染的HeLa细胞E235型问（b、d和f）在100 nM Texas Red-Tf存在下37°C孵育15分钟。然后固定细胞进行荧光共聚焦显微镜检查。（a和b）显示GFP融合蛋白标记的荧光显微照片；（c和d）显示德克萨斯红Tf标记的荧光显微照片；（e和f）微分干涉对比显微照片。每列（a、c和e或b、d和f）代表相同的字段。箭头表示表达GFP融合蛋白的细胞。棒材，20μm。
图3
图3
CHO细胞过度表达GFP-SKD1E235Q系列既不约束也不内化LDL。CHO细胞转染GFP-SKD1型E235Q系列在5%LPDS/F12培养基中培养。18 h后，将细胞在10μg/ml R18-LDL的存在下在37℃的相同培养基中培养10 min（a和C）或在4℃培养1 h（b和d）。然后固定细胞进行荧光共聚焦显微镜观察。（a和b）显示GFP-SKD1的荧光显微照片E235Q系列标记；（c和d）显示R18-LDL标记的荧光显微照片。a和c、b和d对代表同一字段。表达GFP-SKD1的细胞第235页用箭头表示。棒材，20μm。
图4
图4
过度表达GFP-SKD1的HeLa细胞表面的TfR消失E235Q系列HeLa细胞转染GFP-SKD1基因或GFP-SKD1E235Q系列在有抗TfR抗体的情况下，在4°C下孵育1 h。然后固定细胞，并与Cy5结合的第二抗体孵育，用于免疫荧光共聚焦显微镜。（a和b）显示GFP融合蛋白标记的荧光显微照片；（c和d）显示表面TfR染色的荧光显微照片；（e和f）微分干涉对比显微照片。每列（a、c和e或b、d和f）代表相同的字段。箭头表示表达GFP融合蛋白的细胞。棒材，20μm。
图5
图5
GFP-SKD1的过度表达E235Q系列降低细胞表面共同转染的异位TfR占总转染TfR的比例。仅用GFP-SKD1载体转染HeLa细胞E235Q系列或GFP-SKD1，以及myc-tagged TfR。这些细胞被标记为[35S] 蛋氨酸/半胱氨酸15分钟，在37°C或4°C下追逐3小时，并按照材料和方法中的描述进行表面生物素化。（A） SDS-PAGE分析免疫沉淀myc标记的TfR（T）和与链霉亲和素琼脂糖（S）结合的myc标记TfR。用生物图像分析仪对总TfR和表面myc标记的TfR进行定量，并用总量（B）对表面表达进行标准化。这些值是相对于与载体共转染并在37°C培养的细胞中的表面myc-TfR表达的（载体37°C:100%）。每列代表用重复皿进行的三个实验的平均值±SEM。
图6
图6
流式细胞术分析与表面TfR和GFP-SKD1的丢失相关E235Q系列表达式。转染GFP-SKD1（A）或GFP-SKD2的HeLa细胞E235Q系列（B） 按照图4所示对表面TfR进行染色，但使用了PE结合的第二抗体。每次转染分析2万个细胞。对于在指定强度范围内表达GFP融合蛋白的每个细胞亚群，表面TfR的平均量以C表示。所示为重复两次的代表性实验。
图7
图7
TfR、内吞的右旋糖酐和lamp-1积聚在E235Q区室中。转染GFP-SKD1的HeLa细胞E235Q系列在37°C下，在1 mg/ml TRITC-dextran存在下孵育8 h。然后固定、渗透细胞，并使用Cy5结合的第二抗体进行免疫荧光共聚焦显微镜检查。每组a–d和e–h显示同一场的荧光显微照片。GFP-SKD1型E235Q系列显示了标记（a和e）、TfR染色（b）、lamp-1染色（f）、TRITC-dextran标记（c和g）和合并图像（d和h）。箭头、箭头和星号表示未转染细胞，即GFP-SKD1中的E235Q隔间E235Q系列-转染细胞和lamp-1，其分布分别不同于E235Q隔室。棒材，20μm。
图8
图8
在表达GFP-SKD1的细胞中，内化EGF的降解受到抑制E235Q系列转染GFP-SKD1的HeLa（a–h）和a-431（i–p）细胞E235Q系列分别在3.3和0.1μg/ml Texas Red-EGF存在下，在4°C下培养1小时。清洗后，将细胞在37°C下培养30分钟（a–d和i–l）或3小时（e–h和m–p）。然后固定细胞进行荧光共聚焦显微镜观察。GFP-SKD1型E235Q系列标签（a、e、i和m），德克萨斯州Red-EGF标签（b、f、j,以及n），示出了合并图像（c、g、k和o）和差分干涉对比度图像（d、h、i和p）。每一行代表相同的字段。表达GFP-SKD1的细胞E235Q系列用箭头表示。棒材，20μm。
图9
图9
GFP-SKD1的过度表达E235Q系列改变早期内体抗原EEA1的分布，但不改变分泌途径标记物的分布。转染GFP-SKD1的HeLa细胞E235Q系列使用针对早期内体（a–c）的EEA1抗体、针对晚期内体（d–f）的Rab7抗体、针对高尔基体（g–i）的GM130抗体、针对内质网（j–l）的KDEL序列以及针对质膜（m–o）的Na，K-ATP酶的抗体，进行免疫荧光共聚焦显微镜检查。对于Rab7染色，在固定前进行渗透。转染NRK细胞也检测TGN38（p–r）。左柱，GFP-SKD的荧光显微照片E235Q系列标记；中间柱，使用Cy5-共轭第二抗体对每个标记进行染色的荧光显微照片；右列，合并的图像。每一行代表相同的字段。a–c中的箭头和箭头表示转染了GFP-SKD1的细胞E235Q系列和未转染细胞。星号表示突变体SKD1相关的异常空泡在NRK细胞中形成。棒材，20μm。
图10
图10
通过电子显微镜在SKD1中观察到异常的内吞膜E235Q系列-转染细胞。（a） SKD1转染HEK293细胞E235Q系列固定并用电子显微镜观察。（b） a.（c）的高放大率图像–e） SKD1E235Q系列-将转染的HEK293细胞在37°C和10 mg/ml HRP存在下培养1 h。细胞固定并用DAB染色，在电子显微镜下检测内吞HRP。观察到细胞质中出现了一个过度异常的多泡空泡（V），伴随着许多小管-泡状结构（T）。高尔基体（G）形态正常。小管-囊泡膜似乎与液泡相连（箭头所示）。棒材，1μm。。
图10
图10
通过电子显微镜在SKD1中观察到异常的内吞膜E235Q系列-转染细胞。（a） SKD1转染HEK293细胞E235Q系列固定并用电子显微镜观察。（b） a.（c）的高倍图像–e） SKD1E235Q系列-将转染的HEK293细胞在37°C和10 mg/ml HRP存在下培养1 h。细胞固定并用DAB染色，在电子显微镜下检测内吞HRP。观察到细胞质中出现了一个过度异常的多泡空泡（V），伴随着许多小管-泡状结构（T）。高尔基体（G）形态正常。小管-囊泡膜似乎与液泡相连（箭头所示）。棒材，1μm。。
图11
图11
GFP-SKD1的免疫电子显微镜E235Q系列、内源性SKD1、TfR和EEA1。转染GFP-SKD1的HEK293细胞第235页固定，GFP-SKD1定位E235Q系列（a） 、TfR（c）和EEA1（e–h） 分别使用抗GFP、TfR和EEA1抗体通过银增强免疫金电子显微镜检查。还使用SKD1（b）抗体检测内源性SKD1在H-4-II-E细胞中的分布。（d） GFP-SKD1双重染色E235Q系列（银增强金颗粒）和TfR（HRP-DAB染色）。V、 夸大的异常多泡液泡；T、 小管-小泡结构。b中的箭头，与膜室/囊泡相关的内源性SKD1；f–h中的箭头，EEA1与空泡突起有关。棒，1μm。。
图11
图11
GFP-SKD1的免疫电子显微镜E235Q系列、内源性SKD1、TfR和EEA1。转染GFP-SKD1的HEK293细胞E235Q系列固定，GFP-SKD1定位E235Q系列（a） 、TfR（c）和EEA1（e–h） 分别使用抗GFP、TfR和EEA1抗体通过银增强免疫金电子显微镜检查。还使用SKD1（b）抗体检测内源性SKD1在H-4-II-E细胞中的分布。（d） GFP-SKD1双重染色E235Q系列（银增强金颗粒）和TfR（HRP-DAB染色）。五、 过度畸变多泡空泡；T、 小管-小泡结构。b中的箭头，与膜室/囊泡相关的内源性SKD1；f–h中的箭头，EEA1与空泡突起有关。棒材，1μm。。
图12
图12
内源性和异位SKD1的亚细胞定位。（A） 从HeLa细胞（T）制备的细胞匀浆通过10万倍离心分离成上清液（S）和颗粒（P）克使用SKD1、TfR（作为膜蛋白标记物）和醛缩酶（作为细胞溶质标记物）抗体通过免疫印迹分析这些组分。（B） HeLa细胞转染GFP-SKD1型或GFP-SKD1型第235页按照A所述进行细胞分馏。使用SKD1抗体通过免疫印迹分析分馏物。
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引用人

  • 新生VPS4A突变导致神经发育异常的多系统疾病。
    Rodger C、Flex E、Allison RJ、Sanchis-Juan A、Hasenahuer MA、Cecchetti S、French CE、Edgar JR、Carpentieri G、Ciolfi A、Pantaleoni F、Bruselles A；英国基因组研究联合会；Onesimo R、Zampino G、Marcon F、Siniscalchi E、Lees M、Krishnakumar D、McCann E、Yosifova D、Jarvis J、Kruer MC、Marks W、Campbell J、Allen LE、Gustincich S、Raymond FL、Tartaglia M、Reid E。 Rodger C等人。 美国人类遗传学杂志。2020年12月3日；107(6):1129-1148. doi:10.1016/j.ajhg.2020.10.012。Epub 2020年11月12日。 美国人类遗传学杂志。2020 PMID：33186545 免费PMC文章。
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