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.1999年10月；10(10):3067-79.
doi:10.1091/mbc.10.10.3067。

同时表达的粘附受体的功能层次：整合素α2beta1而非CD44在三维透明质酸胶原基质中介导MV3黑色素瘤细胞迁移和基质重组

K Maaser公司 1, K沃尔夫, C E克莱因, B尼格曼, 哈萨克斯坦, E B Bröcker公司, P弗里德尔
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同时表达的粘附受体的功能层次：整合素α2beta1而非CD44在三维透明质酸胶原基质中介导MV3黑色素瘤细胞迁移和基质重组

K Maaser公司等。 分子生物学细胞. 1999年10月.
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摘要

触体细胞跨表面迁移由粘附受体介导，包括β1整合素和CD44，分别为胶原和透明质酸（HA）等细胞外基质（ECM）配体提供粘附。然而，对于这些不同的受体系统如何通过三维（3-D）互连ECM配体协同细胞迁移，人们知之甚少。在高度能动的人MV3黑色素瘤细胞中，β1整合素和CD44均大量表达，分别支持跨胶原和HA的迁移，并在迁移时沉积，而只有β1整合素而非CD44重新分布到局部粘连。在存在或不存在HA和交联硫酸软骨素的三维胶原晶格中，抗β1和抗α2整合素单克隆抗体阻断了MV3细胞迁移和相关功能，如极化和基质重组，而阻断CD44、α3、α5、α6或αv整合素的单克隆抗体则没有任何作用。使用高灵敏度的延时视频显微镜和计算机辅助细胞追踪技术，CD44的迁移功能被排除。1） 添加HA不会增加迁移细胞数量或迁移速度，2）阻断HA结合的Hermes-1表位不会影响迁移，3）阻断或激活β1整合素后受损的迁移不能通过CD44恢复。由于α2β1介导的迁移既没有协同作用，也没有被CD44-HA相互作用所取代，因此我们得出的结论是，三维多组分ECM的生物物理特性对粘附受体的分子功能施加了更多限制，从而与跨表面的触觉动力学迁移不同。

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数字

图1
图1
纳入三维胶原晶格的MV3黑色素瘤细胞上的β1整合素和CD44表面表达。细胞在液体培养（灰色区域）或胶原晶格内培养14 h，然后在胶原酶中培养并用单克隆抗体4B4（β1整合素）或Hermes-1（CD44）染色（灰色线：等型对照）。与液体培养CD44而非β1整合素中培养的细胞相比，胶原格培养14 h后表达上调。此外，高水平的α3整合素（荧光强度：2-6×102)α5、α6和αv整合素中度染色（0.5–1×102)，这与之前公布的数据一致（Klein等。1991年b；达能科技等。, 1993; 戈贝尔等。, 1996).
图2
图2
通过粘附扰动抗β1整合素单克隆抗体4B4（A、B和D）而非非阻断单克隆抗体K20（C）抑制MV3细胞在三维胶原晶格中的迁移。对单个细胞的路径进行了数字化，并获得了细胞步步移动的百分比。在A（‖-‖）中所示的稳态运动时间段内，获得了细胞运动的累积百分比和运动时间分数（B，白色条：对照；黑色条：mAb 4B4）以及代表性细胞形态（D）。用mAb（10μg/ml）或PBS预孵育细胞，洗涤并嵌入胶原基质中。除D外，未向晶格（A–C）中添加额外的mAb，D中上清液中含有额外的mAb 4B4。数据表示三个独立实验（总共120个细胞）的平均值（+SD）。星号表示差异显著，P<0.05。（D） 视频记录显示，在存在单克隆抗体4B4的情况下，极化细胞形态（白色箭头）被消除。黑细胞和白细胞对应于胶原蛋白晶格中不同深度的细胞。棒材，100μm。
图3
图3
与阻断型单抗4B4和非阻断型单克隆抗体K20孵育后，β1整合素的分布（左）以及与胶原纤维的相应相互作用（右）。MV3细胞与单克隆抗体4B4（A–C）或非阻断单克隆抗体K20（D–F）孵育，另外用LRSC结合的F（ab）′片段（红色荧光）染色，清洗，然后嵌入胶原晶格。将样品在37°C下孵育0小时（A和D）、2小时（B和E）或24小时（C和F），固定，并用FITC偶联的抗β1整合素mAb 4B4（绿色荧光）再次染色。红色（A和B）表示绿色单克隆抗体4B4的二次染色强度较低，这是由4B4–LRSC结合物先前占领现有表位所致。黄色（D和E）表示检测β1链上不同表位的K20（红色）和4B4染色（绿色）的重叠。棒材，20μm。
图4
图4
单克隆抗体Hermes-1抑制HA在二维底物上诱导的迁移。所示为实际位置的单个细胞路径（A，n=40个随机选择的细胞）、随时间变化的迁移速度（B）以及在存在或不存在mAb Hermes-1（10μg/ml）的情况下种群内的迁移变化（C）。显示了至少两个实验中的一个代表。
图5
图5
高纯度（A、B和D）和高分子量HA（C和D）对MV3细胞在多组分基质中迁移的影响。细胞被植入由纤维胶原（col）或胶原蛋白补充HA（1 mg/ml）（col+HA）或HA（1毫克/毫升）和CS（20毫克/毫升，col+HA+CS）组成的基质中。与多组分基质相比，胶原蛋白的自发基线迁移是通过n=3个独立实验获得的（共有120个细胞）。C代表40个细胞（n=2的一个代表性实验）。（B） 从A中导出的单单元水平累积速度的箱线图分析。箱线中的线表示中位数，而箱线表示第25至75个百分位。进一步散射由须状物指示（指示值在1.5×盒长范围内），极端散射值单独指示（●）。（D）对于HA的剂量反应，评估平均速度±SD（40个细胞，一个代表性实验）。
图6
图6
CD44非依赖性基线迁移（A和B）和阻断β1整合素功能后缺乏CD44介导的迁移恢复（C和D）。实验如图5所示。用嵌于不同基质中的阻断单克隆抗体（抗CD44单克隆抗体Hermes-1和抗β1整合素单克隆抗体4B4；10μg/ml）或PBS预培养细胞，并将单克隆抗体额外添加到上清液和基质中在mAb Hermes-1缺失（开放符号）或存在（封闭符号）的情况下。数据表示A和D中的120个细胞（n=3个实验），以及n=2（B和C）中的一个代表性实验。
图7
图7
粘附诱导的抗β1整合素单克隆抗体8A2对MV3细胞迁移（A和B）、β1整合素分布（C，左）以及与胶原纤维的相互作用（C，右）的影响。MV3细胞嵌入胶原晶格。迁移开始后3小时，将mAb 8A2添加到上清液中（A，黑色箭头）。24小时后，固定样品，用次级LRSC结合F（ab）′片段对8A2修饰的β1整合素进行染色。共焦显微镜检测荧光（C，左）和反射图像（C，右）。白色箭头表示β1整合素的聚集及其与胶原纤维的相互作用。棒材，20μm。
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