跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.1999年6月1日；19(11):4370-87.
doi:10.1523/JNEUROSCI.19-11-04370.1999。

转基因表达BDNF的成纤维细胞移植促进成年大鼠红核脊髓轴突再生和前肢功能恢复

Y刘 1, D金, B T Himes公司, S Y Chow先生, T夏勒特, M Murray先生, 一个Tessler, I费舍尔
附属公司

转基因表达BDNF的成纤维细胞移植促进成年大鼠红核脊髓轴突再生和前肢功能恢复

刘Y等。 神经科学. .

摘要

成年哺乳动物的中枢神经系统神经元通常不会再生其切断的轴突。这种失败归因于损伤部位的瘢痕组织和抑制分子，它们阻碍了再生轴突，对轴切神经元缺乏营养支持，以及轴切术后固有的神经元变化，包括细胞萎缩和死亡。我们研究了通过基因工程产生脑源性神经营养因子（BDNF）的成纤维细胞移植能否促进成年大鼠红核脊髓束（RST）再生。通过逆转录病毒介导转移编码人BDNF基因的DNA构建物、内部核糖体进入位点以及lacZ和新霉素耐药基因的融合基因，对原代成纤维细胞进行修饰。经修饰的成纤维细胞在体外产生具有生物活性的BDNF。将这些细胞移植到完全阻断一个RST的部分颈部半切腔中。在损伤和移植后的一个月和两个月，逆行和顺行追踪技术显示RST再生。荧光金逆行追踪显示，大约7%的RST神经元再生轴突，至少在移植体尾部三至四段。生物素化葡聚糖胺顺行追踪显示，RST轴突通过移植体及其周围再生，在移植体尾部的白质内长距离生长，并终止于RST轴轴突的正常靶区脊髓灰质区域。未经修饰的原代成纤维细胞或明胶海绵单独移植不能诱导再生。行为测试表明，接受BDNF诱导的成纤维细胞后，前肢的使用明显恢复，但第二次损伤横断再生轴突后，前臂的使用恢复了。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
LIG/BDNF逆转录病毒。该病毒编码全长人BDNF cDNA和GEO，GEO是β-gal和新霉素耐药基因的融合基因。整个BDNF-IRES-GEO序列由RSV LTR启动子驱动，并转录成多顺反子mRNA。位于BDNF和GEO之间的EMCV IRES允许cap依赖性启动多顺反体mRNA的翻译。
图2。
图2。
实验范式示意图。动物接受右侧C3–4部分半切，破坏左侧RN的轴突。A类，脊髓横截面图；病变和移植由阴影区域脊髓损伤后，立即将明胶海绵、Fb或Fb/BDNF细胞移植到损伤腔内。使用BDA顺行追踪或FG逆行追踪研究RST再生(B类).
图3。
图3。
分析在体外转基因表达。培养的Fb/BDNF(A、 C–E类)或Fb(B类)细胞被抗BDNF抗体染色(A、 B类)或用抗BDNF双重标记(C类)和抗β-半乳糖抗体(D类).E类，从与C类和D类; 用核染料（4′，6-二氨基-2-苯基吲哚）标记细胞，以显示培养物中的整个细胞群。来自Fb的调节介质(如果)或Fb/BDNF(G公司)利用E8鸡DRG外植体实验分析细胞产生生物活性BDNF的情况。重组人BDNF作为阳性对照(H（H）). Fb/BDNF细胞分泌BDNF的速率是使用缝隙印迹法相对于对照重组BDNF进行计算的(我). 重组BDNF(脑源性神经营养因子)以2000、400、80、16、3.2和0.064 ng的压力加载到槽式印迹仪上(1–6车道并与来自Fb和Fb/BDNF的20μl条件培养基（5000个细胞，一式三份）进行比较。Fb/BDNF细胞以12.8 ng/10的速率分泌BDNF6而Fb细胞不分泌可检测到的BDNF水平。比例尺，100μm。
图4。
图4。
显示不同动物组损伤和移植的颈脊髓切片的显微照片。动物接受右侧C3-4半切和明胶海绵移植(A类)，Fb(B类)或Fb/BDNF(C类). 手术后1个月处死动物。脊髓组织被切成横截面并用甲酚紫染色。D、 E类，的高倍图像C类显示宿主-移植物界面(D类)移植组织中成纤维细胞的特征形态(E类). 比例尺：A–C500微米；D、 E类，100微米。
图5。
图5。
显示Fb/BDNF移植中转基因表达的颈脊髓切片的显微照片。动物接受右侧C3-4半切和Fb/BDNF细胞移植。脊髓组织的连续切片用X-gal组织化学染色，并用甲酚紫轻微复染。在B类，连续重建切片（间隔500μm），以显示病变和移植的范围。A类,C类，来自的高倍图像B类(箭头).A类、宿主-移植物界面和移植中的大量血管。C类、宿主-移植物整合和强烈的X-gal染色，表明转基因表达水平较高。存活一周。比例尺：A、 C类，200微米；B类500微米。
图6。
图6。
颈脊髓切片的显微照片显示宿主轴突生长为Fb/BDNF或Fb移植。接受Fb的动物的脊髓横截面(A类)或Fb/BDNF(B类)移植体用RT-97抗体染色并显示细胞移植物(克)，宿主灰质(小时)以及宿主-移植物界面(虚线). Fb/BDNF移植体内和宿主-移植物界面存在大量轴突(B类)而宿主轴突稀疏而浅地穿透Fb移植(A类). 存活一个月。比例尺，100μm。在C类和D类用抗CGRP抗体对Fb/BDNF受体的脊髓横截面进行染色。一个背根再生到移植体中，并向背角伸长，这部分被移植程序破坏，正如预期的那样。箭头勾勒出移植物的轮廓。D类，到达后角的轴突的高倍视图。两个月生存期。比例尺：C类，200微米；D类，100微米。在E–G公司Fb/BDNF受体的脊髓横截面用抗性欲抗体染色。整个移植过程中都有大量的5-羟色胺免疫反应纤维(E类). 在更高功率下(F、 G公司)，轴突表现出特征性的“串珠状”形态。在E箭头概述移植物-宿主界面。存活一个月。比例尺，100μm。
图7。
图7。
显示宿主免疫反应的颈脊髓切片的显微照片。用GFAP对接受Fb/BDNF移植的动物的脊髓横截面进行免疫染色(A、 B类)，OX-42型(C、 D类)和ED-1(E、 F类)抗体。移植物-宿主界面可见轻度星形胶质细胞活化，但移植物中有星形胶质细胞时很少有活化(A、 B类). 巨噬细胞和活化的小胶质细胞在移植物-宿主界面积聚，但在移植中很少(C–F类). 存活一个月。比例尺，100μm。
图8。
图8。
显示正常动物经BDA顺行追踪后RST分布的颈脊髓切片的显微照片。将BDA注射到左侧RN的磁细胞部分。颈脊髓切片用DAB染色，显示RST在浅背外侧象限的离散位置(A类).B类，RST轴突形态和组织的高倍视图。在B箭头指向灰质中的轴突分支。比例尺，100μm。
图9。
图9。
颈脊髓切片的显微照片显示损伤-移植部位RST轴突的BDA顺行追踪。该动物接受了右颈半切和Fb/BDNF移植。左侧RN在死亡前15天用BDA顺行追踪。移植后存活两个月。A类，从其吻端1000μm处通过移植进行切片。用DAB对切片进行染色，作为BDA标记纤维的铬红，并用甲酚紫进行复染。移植中存在大量BDA标记的轴突(箭头)以及移植物-宿主界面(大箭头)把树枝送进灰质(小箭头). 然而，大多数BDA标记的轴突被反染色所掩盖。B类，相邻切片用FITC染色以识别BDA标记的纤维，无复染。C–E类，相应区域的放大倍数更高B类.C类，移植中有大量BDA标记的轴突。大多数是横向切割的。箭头指向小口径轴突箭头指向大口径轴突。在D类，许多横切的大口径轴突在移植物-宿主界面被标记(箭头)并将垂直于主茎的枝条向灰质方向送出(箭头).E类，进入灰质的轴突分支的高倍视图(箭头).F–小时，用FITC双重标记的部分-抗生物素(如果)和抗GFAP抗体(G公司).H（H），合并的图像如果和G公司许多RST轴突与活化的星形胶质细胞的突起交织在一起。比例尺：A类，200微米；C、 F类，100微米。比例尺输入A类适用于B类; 比例尺输入C类适用于D类和E类; 比例尺输入如果适用于G公司和H（H）.
图10。
图10。
颈脊髓切片的显微照片显示通过Fb/BDNF移植后RST轴突再生。动物接受右颈半切和Fb(A类)或Fb/BDNF移植(B–J类). 左侧RN在死亡前15天用BDA顺行追踪。移植后存活一个月。脊髓组织被切成矢状(A–H)或水平(一、 J型)章节。对于所有部分左边是吻侧的，并且正确的是尾部的。A类，所有BDA-标记的RST轴突都被损伤-移植中断，无法进入Fb移植。B类，部分RST轴突再生为Fb/BDNF移植；这个虚线表示吻侧移植物-宿主界面。C类，移植部位的吻侧区域。大量的轴突分支是明显的，这表明移植诱导了发芽。D类,E类，区域放大率较高B类.D类，BDA标记的轴突穿透了移植体-宿主界面。E类RST轴突位于移植区的深处。如果，位于移植体尾部的宿主白质区域。这个虚线表示尾侧移植物-宿主界面。BDA标记的轴突退出移植并在尾部伸长。一些轴突有类似于末端隆起的静脉曲张。G公司，更高功率下的终端bouton样结构。H（H），BDA标记的轴突经FITC染色。再生轴突(箭头)通过吻侧移植物-宿主界面，继续通过移植物和尾侧移植物/宿主界面数毫米。我,J型，Fb/BDNF移植中许多小口径和一些大口径RST轴突在口-尾方向的高倍视野。比例尺，100μm。中的比例尺E类适用于C、 D、I、和J型.
图11。
图11。
上胸椎的显微照片(A、 B类)和中胸(C、 D类)脊髓显示BDA标记的RST轴突。A类，显示正常RST位置和组织的正常动物的横截面。箭头指向灰质中的轴突分支。B类，Fb/BDNF移植动物的横截面。存活一个月。许多BDA标记的轴突存在于侧索中，但它们的位置异常，比正常情况下更为弥漫。灰质中也有一些横向切片的BDA标记轴突(箭头). 一个轴突分支垂直于主干出现并进入VII层(箭头).C类，轴突在灰质中分支，静脉曲张类似于终末隆起。D类，更高功率下的末端波顿状结构。比例尺：A–C，100微米；D类，25微米。比例尺输入A类也适用于B类.
图12。
图12。
中脑显微照片显示RN神经元FG逆行追踪。在正常动物的脊髓两侧注射FG，逆行追踪两个RN中的神经元(A–C)或凝胶泡沫的接受者(D–F)，磅(G–I型)或Fb/BDNF(J–L型)移植。移植后存活1个月。所有切片均取自RN尾极～480μm处。B、 E、H、K，对应于的左RN区域的高倍视图A、 D、G、和J型.C、 F、I、L，右RN区域的高倍视图对应于A、 D、G、和J型在正常动物中，两个RN的标记相同(A–C). 在凝胶泡沫受体中，左侧FG几乎没有标记RN神经元(D、 E类)，而右侧的标签是正常的(D、 F类). 在Fb移植受体中，极少数RN神经元标记在左侧RN(G、 H（H）)，而正确的RN通常被标记为(G、 我). 在Fb/BDNF移植受者中，许多RN神经元标记在左侧RN中(J、 K（K）)，右RN标记正常(J、 L（左）). 比例尺，100μm。中的比例尺J型适用于A、 D、G、和J型; 中的比例尺K适用于B、 C、E、F、H、I、K、和L（左）.
图13。
图13。
条形图，比较动物组中FG标记的RN神经元的数量。对正常动物和接受Fb/BDNF、Fb或明胶海绵移植的动物的FG标记RN神经元进行计数，并通过单因素方差分析进行比较，然后采用Fisher’s事后（post-hoc）移植后1或2个月进行测试。在接受Fb/BDNF移植的动物中，手术对侧标记的RN神经元（～7%）明显多于接受Fb或明胶海绵（<1%）的动物。第页< 0.00001;n个=3（正常）；n个Fb/BDNF 1m、Hx 1m和Hx 2m=5；n个=6，对于Fb/BDNF 2m、Fb 1m和Fb 2m。
图14。
图14。
对比前肢使用的照片。在圆柱体试验中对动物进行分析，以研究首选前肢的使用。A类,C类移植后7周，Fb/BDNF受体使用同侧前肢探索病灶周围环境(A类)而Fb和凝胶泡沫受体很少这样做(C类). Fb/BDNF移植动物的前爪姿势几乎正常(A类)，但Fb或明胶海绵受体使前爪与病灶同侧强烈弯曲(C类).B类,D类在C2缓解7周后，接受Fb/BDNF移植的动物失去了正常的前肢姿势和使用病变同侧前肢的能力(B类). 相比之下，Fb移植动物的前肢姿势和前肢使用受到的影响较小(D类).A类,B类，同一动物与Fb/BDNF移植物在再移植前后拍摄的照片。C、 D类，来自于同一只移植了Fb的动物。箭头在里面A–D指向病变同侧的前肢。
图15。
图15。
前肢使用行为分析。移植后三周，Fb/BDNF受体显示出单独或与未受损肢体一起使用受损肢体的明显恢复，而Fb或凝胶泡沫受体显示出仅使用受损肢体可以忽略不计(A类). Fb/BDNF受体的大部分前肢功能被解除，但对Fb或凝胶泡沫受体几乎没有影响(B类).n个对于Fb/BDNF和Fb＝6，n个Hx=5。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Bernstein-Goral H，Bregman BS。脊髓移植支持出生时脊髓损伤后轴切神经元的再生：一项定量双标记研究。实验神经学。1993;123:118–132.-公共医学
    1. Bregman BS、Kunkel-Bagden E、Schnell L、Dai HN、Gao D、Schwab ME。神经突起生长抑制剂抗体介导的脊髓损伤恢复。自然。1995;378:498–501.-公共医学
    1. Bregman BS、McAtee M、Dai HN、Kuhn PL。神经营养因子增加成年大鼠脊髓损伤和移植后的轴突生长。实验神经学。1997;148:475–494.-公共医学
    1. Brosaml C，Schwab ME。成年大鼠皮质脊髓束腹侧非交叉成分的起源、过程和终止模式细胞。《计算机神经学杂志》。1997;386:293–303.-公共医学
    1. 棕色LT.大鼠红核脊髓投射。《综合神经病学杂志》。1974;154:169–187.-公共医学

出版物类型

物质