靶向中性粒细胞胞外陷阱（NETs）减少新型冠状病毒肺炎小鼠模型的多器官损伤

摘要

背景

2019年冠状病毒病（COVID-19）是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的感染[1,2]肺部相关症状是其特征之一[三,4]. 中性粒细胞被描述为呼吸道症状严重程度和新冠肺炎预后不良的指标[5–7]. 中性粒细胞胞外陷阱（NETs）是炎症疾病中中性粒细胞最相关的效应机制之一，在器官损伤中起着重要作用[8–10]。

NETs是细胞外DNA纤维的网状结构，包含组蛋白和颗粒衍生酶，如髓过氧化物酶（MPO）、中性粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶G[11,12]. NETs的形成被称为NETosis，它首先由模式识别受体（例如TLR）或趋化因子激活中性粒细胞。该过程随后产生活性氧和钙动员，从而激活精氨酸脱氨酶4（PAD-4）蛋白[13]. 中性粒细胞弹性蛋白酶的激活也在炎症反应中NETs的产生中起作用[14–17]。

在严重新型冠状病毒肺炎患者的血液、血栓和肺部中发现NETs水平升高，这表明中性粒细胞和NETs可能在新冠肺炎的病理生理学中起重要作用[8–10]。

药物再利用是加快发现新的有效治疗新冠肺炎的关键策略[18]. 在这种情况下，如文献显示NETs在新型冠状病毒肺炎中的作用，DNase I是一种FDA批准的降解NETs的药物，可以作为新型冠状腺炎治疗的潜在候选药物[19–21]. Dornase alfa（重组人DNase I）广泛用于改善囊性纤维化患者的肺功能[19——21]. 这种药物通过降解呼吸道中的细胞外DNA显著降低粘液粘度[19–21]. 因此，我们建议将DNase I作为一种治疗剂，以减少新冠肺炎中的NETs，从而潜在地改善临床结局、肺功能以及疾病的预后。

在此，我们证明DNase I治疗可降低SARS-CoV-2感染小鼠血浆和肺部NETs的浓度，并改善实验性COVID-19。这些发现突出了NETs抑制剂作为新冠肺炎潜在治疗方法的重要性。

方法

结果

DNase I降低新型冠状病毒肺炎实验模型的临床结局

为了研究NETs在新型冠状病毒肺炎病理生理学中的作用，我们用K18-hACE2小鼠经鼻感染SARS-CoV-2；[22,24]. 在病毒感染前1小时给受感染小鼠注射生理盐水或DNAse I（10 mg/kg；皮下注射），在感染后4天内每天注射一次（图1a） ●●●●。我们根据基线测量（基础）和临床评分评估了体重减轻情况，并读取了疾病进展（附加文件1：表S1）。我们的数据表明，与经载体治疗的小鼠相比，DNase I治疗可以减轻SARS-CoV-2感染引起的体重减轻和临床评分（图1b、 c）。

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图1

DNase I降低了新型冠状病毒肺炎实验模型的临床结局。一K18-hACE2小鼠（n=6）经鼻接种SARS-CoV-2（2×10）⁴PFU）并用DNase I（10mg/kg，皮下注射）处理5天。使用Biorender.com创建。未感染组用作阴性对照（n=5）。分析体重减轻和临床评分（b、c）.代表性点图（d）、频率和总数（e）流式细胞术检测Ly6G+CD11b+细胞的表达。（f）通过血清和肺组织匀浆中的MPO-DNA PicoGreen分析对NETs进行定量。克免疫荧光分析SARS-CoV-2感染小鼠和DNase I处理小鼠肺中H3Cit（绿色）和MPO（红色）的表达。DAPI（蓝色）用于细胞核染色。比例尺指示50µm。小时Pearson体重或临床评分与肺匀浆中NETs浓度之间的相关性。数据代表至少两个独立实验，显示为平均值±SEM。P值通过双向测定（b、c）和单向方差分析（e、f）

我们观察到NETs浓度增加（图1f、 g）以及诱导新冠肺炎模型后感染小鼠肺部中性粒细胞的数量（图1d、 e）。这些数据证实了我们小组或其他作者发表的一些发现，这些发现显示了NETs的全身水平，以及局限于新冠肺炎患者肺组织中的NETs[8–10]。

在SARS-CoV-2感染小鼠的肺组织中，DNase I治疗并没有改变浸润中性粒细胞的数量。FACS分析显示中性粒细胞（Ly6G+CD11b+细胞；图1d、 e）未被治疗改变。分析CD45+细胞群时观察到类似结果（附加文件1：图S1）。然而，我们证明，对SARS-CoV-2感染小鼠进行DNAse I治疗后，NETs的产生显著减少，这与较低的疾病评分有关（图1h） ●●●●。这些数据表明，NETs在SARS-CoV-2感染中起着关键作用。

抑制NETs改善SARS-CoV-2感染小鼠的肺病理

肺部炎症是危重和严重新冠肺炎中危及生命的呼吸系统疾病的主要原因[三,4,25]. 已在SARS-CoV-2感染患者的肺组织和肺损伤实验动物模型中发现NETs[8,9,26]. 因此，我们接下来研究了DNase I处理COVID-19小鼠模型对NETs降解的影响。

我们注意到K18-hACE2感染小鼠的肺组织出现广泛损伤，间质白细胞浸润。肺泡单位表现出结构扭曲，损害了肺泡-毛细血管屏障。DNase I治疗能够防止SARS-CoV-2感染引起的肺损伤（图2a） ●●●●。此外，分析面积分数，作为间隔厚度评分，DNase I治疗降低了SARS-CoV-2感染小鼠的面积分数，并与较低浓度的NETs释放有关（图2b） ●●●●。肺病理学的减少与用DNase I治疗的小鼠肺组织中促炎细胞因子/趋化因子的减少有关，尤其是IL-6和CXCL-1（图2c） ●●●●。这些结果表明，药物抑制NETs可能是抑制SARS-CoV-2诱导的肺病理的新途径。

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图2

NETs的药物降解可改善体内SARS-CoV-2感染时的肺部病理。K18-hACE2小鼠（n=6）经鼻（i.n）接种严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型（2×10⁴PFU）并用DNase I（10mg/kg，皮下注射）处理5天。一从模拟或SARS-CoV-2感染小鼠的肺部进行代表性H&E染色，并用DNase I处理。b条肺匀浆中面积分数和NETs浓度之间的Pearson相关性。使用Pro Plus 7软件（美国马里兰州Media Cybernetics公司）对总隔面积和总肺面积进行量化。总间隔面积与总肺面积之比表示为面积分数（%）。c（c）采用ELISA法检测肺部TNF-α、IL-6、IL-10、CXCL-1、CCL-2和CCL-4水平。数据代表两个独立实验，显示为平均值±SEM。P值通过单向方差分析确定

DNase I减轻COVID-19小鼠模型的肺外损伤

新型冠状病毒肺炎是一种全身性病毒性疾病，可影响肺部以外的其他重要器官，如心脏和肾脏[27–30]. 为了研究这种情况，我们在感染后5天采集了动物的心脏和肾脏，并评估NETs抑制是否可以改变这种表型。我们观察到，SARS-CoV-2感染小鼠的心脏在心脏组织中出现病理变化，弥漫性和稀疏性心脏炎性细胞浸润和血管周围损伤（图三a） ●●●●。此外，治疗后，心脏组织中的炎症细胞明显减少，留下“受损”（细）纤维和间质水肿，类似于自身免疫性心肌炎。此外，感染组小鼠的血浆肌酸激酶MB（CK-MB）浓度高于对照组小鼠（图三b） ●●●●。有趣的是，DNase I治疗减弱了病理学和CK-MB浓度。

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图3

在新型冠状病毒肺炎实验模型中，NETs降解可减轻心衰和肾衰竭。K18-hACE2小鼠（n=6）经鼻接种SARS-CoV-2（2×10）⁴PFU）并用DNase I（10 mg/kg，s.c）处理5天。心脏的典型H&E染色（a）和肾脏（c）模拟SARS-CoV-2感染小鼠并用DNase I治疗。血清肌酸激酶-MB（CK-MB）水平（b）和肌酐（d）通过比色分析测定。数据代表两个独立实验，显示为平均值±SEM。P值通过单向方差分析确定

最后，我们旨在研究SARS-CoV-2感染是否会导致K18-hACE2小鼠肾脏损伤。与肺和心脏的病理变化一致，我们发现在新冠肺炎模型中存在缺血性肾小管间质性肾炎，类似于急性肾小管坏死和细胞性肾小球炎（图三c） ●●●●。此外，与未感染动物相比，感染小鼠血液中的肌酐水平更高（图三d） ●●●●。正如预期的那样，DNase I治疗减少了肾脏损伤（图三c、 d）。总的来说，这些发现表明，用DNase I对NETs进行药物抑制可以预防新冠肺炎的多器官功能障碍。

DNase I预防NETs诱导SARS-CoV-2感染小鼠肺组织凋亡

为了了解NETs在新型冠状病毒肺炎病理生理学中的可能作用，我们探索了NETs可能参与伴随疾病的肺损伤的假设，如前所述[9,31]。

为此，对感染SARS-CoV-2的k18-hACE2小鼠的肺部分析显示，感染5天后出现大量凋亡细胞。DNase I治疗能够防止COVID-19小鼠模型引起的肺细胞凋亡（图4a） ●●●●。我们的分析表明，NETs降解后，TUNEL阳性细胞减少了约60%（图4b） ●●●●。

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图4

DNase I可防止肺组织和肺上皮细胞凋亡。K18-hACE2小鼠（n=6）经鼻（i.n）接种严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型（2×10⁴PFU）并用DNase I（10mg/kg，皮下注射）处理5天。一TUNEL染色（绿色）用于检测小鼠肺组织原位凋亡细胞。b条肺组织中TUNEL阳性细胞的百分比。从健康中性粒细胞中纯化NETs，并在37°C下用PMA（50 nM）刺激4小时c（c）FACS分析Annexin V+A549细胞的代表性点图，用纯化的NETs（10 ng/ml）和DNase I（0.5 mg/ml）在37°C下预处理或不处理培养24小时。d日Annexin V+A549的频率。数据是两个独立实验的代表性数据，显示为平均值±SEM。P值通过单向方差分析确定，然后进行Bonferroni的事后检验

在我们的下一步中，将健康人中性粒细胞纯化的NETs与A549细胞（人肺泡基底上皮细胞）孵育，并通过流式细胞术测定细胞活力（膜联蛋白V+细胞）.

我们发现，与未经处理的细胞相比，将A549细胞暴露于纯化的NETs显著增加了凋亡细胞的百分比。重要的是，用DNase I预处理纯化的NETs可以阻止NETs诱导的上皮细胞（图4c、 d）在未经处理的细胞中观察到类似水平的凋亡。综上所述，这些结果证明DNase I对NETs在肺组织中的有害功能具有保护作用，并可能成为新冠肺炎期间阻止器官损伤的潜在策略。

讨论

虽然新冠肺炎患者的数量在全球范围内不断增加，但目前尚无有效的治疗方法[32,33]. 因此，了解宿主处理SARS-CoV-2病毒的机制，可以开发新的治疗策略，以防止感染引发的组织损伤。在这里，我们报告了在COVID-19小鼠模型中，NETs在K18-hACE2小鼠的肺部以较高浓度全身释放。此外，DNase I治疗减少了多器官损伤，改善了与NETs释放相关的结果。

循环中性粒细胞数量的增加表明新冠肺炎的预后较差[34]. 2004年，Brinkmann等人首次描述了中性粒细胞释放NETs，并作为杀微生物介质发挥作用[11]. 然而，NET具有以下能力，可以介导在几种炎症疾病中观察到的损伤，包括类风湿性关节炎、狼疮、糖尿病和脓毒症[8,10,35–39]. 抑制NETs的生成可预防实验性脓毒症中观察到的肺、心脏和肝脏损伤[38–40]。

SARS-CoV-2感染影响肺部和多个器官，偶尔导致死亡。除免疫接种外，预防新冠肺炎患者器官功能障碍的策略也很重要。新的证据表明，NET的形成在炎症、凝血病、器官损伤和免疫血栓形成的病理生理学中起着关键作用，这些是新冠肺炎严重病例的特征[8,9]。

一些刺激触发NETs释放，包括病原体相关分子模式（PAMP）、损伤相关分子模式和炎症介质，研究表明NETs具有双重生物学作用。除了他们的杀微生物剂，如细胞因子和趋化因子[41——43]. 我们的小组先前已经证明SARS-CoV-2可以直接感染人类中性粒细胞，并且是触发NETs产生的关键。SARS-CoV-2感染中性粒细胞的第一步是病毒与人类中性粒细胞表面表达的ACE2和TMPRSS2的相互作用[8]. 可以推测宿主细胞释放的细胞因子和趋化因子作为激活剂参与其中[44,45]K18-hACE2模型中中性粒细胞产生的NETs；然而，这值得进一步调查。

人类对SARS-CoV-2感染的反应包括细胞因子和趋化因子的产生[46]. 在此，我们表明，K18-hACE2小鼠的SARS-CoV-2感染可引起可测量的系统性炎症前细胞因子反应，该反应在5DPI时显著增加，其特征是TNF-α、IL-6和IL-10增加，并包括细胞再结晶趋化因子CXCL-1、CCL-2和CCL-4的上调。重要的是，TNF-α和IL-6水平的升高与新冠肺炎患者的疾病严重程度相关[47]. 此外，细胞因子水平也被报道为肺外多器官衰竭的指标[48,49]. 有趣的是，DNase I可以预防一些新冠肺炎患者的全身炎症，包括减少促炎细胞因子TNF-α和IL-6[50,51]. 这需要进一步研究，以澄清我们的观察结果是否表明NETs水平对免疫反应和发病机制有不同的调节。

网络英语扮演着一个自相矛盾的角色。一旦释放，由于其有毒成分，它们起着重要的杀菌作用，有助于捕获和灭活不同类型的病原体，包括病毒[11,13,41,43,52]. 然而，过量的话，这些陷阱也会导致严重的组织损伤，如类风湿性关节炎[35]、糖尿病[37]血栓前事件和脓毒症[39,40]. 我们小组和其他小组已经证明，新冠肺炎患者血浆和肺组织中NETs的浓度显著增加[8,10]. 因此，将抗病毒药物与NETs的控制相结合可能是治疗短命病毒感染性疾病，尤其是新型冠状病毒肺炎的战略选择。尽管我们证明了NETs的存在，但正如一些作者在患者样本中所证明的那样，无细胞DNA可以在新冠肺炎期间发挥作用。然而，正如最近证明的那样，无细胞DNA的大规模生产来自网络[53]。

文献描述NETs可以对不同类型的哺乳动物细胞（包括上皮细胞和内皮细胞）产生直接的细胞毒性作用，从而诱导细胞凋亡或坏死[12,54]. 此外，NETs还可以激活不同的PRR受体，如toll-like receptor（TLR）-4和9，它们介导炎症介质的释放；反过来，放大网络的直接影响[35]. 在此背景下，在新冠肺炎期间，先前观察到肺上皮细胞凋亡。这些事件会损害肺功能，加重疾病的严重性[三,4]. 考虑到这些发现，在本研究中，我们观察到DNase I阻止SARS-CoV-2感染小鼠肺组织的凋亡。根据COVID-19模型中观察到的结果，从PMA刺激的人类中性粒细胞培养物中分离出的NETs在体外诱导A549上皮细胞凋亡，在DNase I存在下具有反向稳态。A549是模拟肺部炎症环境的一个很好的工具，并被用作研究NET诱导的肺细胞凋亡的模型，如上所述。在未来的工作中，我们打算研究NET诱导肺细胞凋亡的分子机制.

将这一发现扩展到新冠肺炎，有可能表明肺细胞活性的降低是局部产生NETs的结果。在这一系列中，我们观察到中性粒细胞释放NETs，以及SARS-CoV-2感染小鼠肺部的高浓度NETs。据报道，DNase可降低SARS-CoV-2感染患者血浆中的NETosis，减轻全身炎症，并降低脓毒症小鼠模型的死亡率[51]。

在一项随机临床试验中，对重度新冠肺炎患者使用DNase I治疗，可产生显著的抗炎作用并降低免疫病理学标志物[55]. 在另一项临床试验中，DNase I治疗与氧合改善和NETs肺液减少相关[21]. 这些数据表明，吸入DNase I对NET或NET相关结构的降解在肺部疾病的情况下是有益的。DNase I对急性呼吸道感染和炎症患者的疗效证实了我们的实验结果。一些作者描述，在接种SARS-CoV-2的仓鼠的炎症肺中发现NET，该病毒可介导免疫血栓形成和肺损伤[26]. 事实上，在严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型感染的K18-hACE2小鼠中，对NET形成的实验性抑制可以减弱疾病迹象的发展，并减少肺部病理和细胞因子风暴[38,56]. 总之，我们的研究结果支持NETs作为改善新冠肺炎临床结局的目标。

结论

我们观察到在感染小鼠肺泡腔检测到的肺组织中存在释放NETs的中性粒细胞。DNase I体内治疗可阻止疾病进展。这一观察结果与肺损伤的发展密切相关，表明降低NETs水平的策略可能对肺功能的恢复产生有利影响。

总之，我们的研究结果证明了NETs在新冠肺炎期间的潜在有害作用，并支持使用NETs抑制剂，如DNase I，作为改善新冠肺炎多器官损伤的策略。

补充信息

鸣谢

作者贡献

FPV、GFG、FQC、TMC、JCA-F、EA和ATF参与了研究设计。FPV、GFG、ESC、RM、DBC和BMSS在体内进行SARS-CoV-2 K18-hACE2小鼠感染。FPV进行免疫染色和共聚焦分析。AHS、CJLRA和CMSS对网络进行了量化。SSB和ATF有助于组织病理学分析。FPV和BMSS进行A549上皮细胞损伤分析和FACS分析。AHS对NETs进行净化。FPV、RM、CSB、EA、FQC、TMC和JCA-F撰写了手稿。所有作者都阅读并批准了这份手稿。

基金

本研究得到圣保罗保护基金会（FAPESP）拨款（2013/08216-2和2020/05601-6）、国家环境保护委员会（CNPq）和国家环境保护协会（CAPES-Epidemias 88887.5131/2020-00）拨款的支持。

数据和材料的可用性

本研究中生成或分析的所有数据都包含在本文和其他信息中。应相应作者[F.Q.C.或F.P.V.]的合理要求，也可获得支持本研究结果的所有数据。

声明

脚注

参与者信息

弗拉维奥·维拉斯，电子邮件：rb.psu@oisatorpf.

费尔南多·库尼亚，电子邮件：rb.psu.prmf@ahnucqdf.

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