SCON-一种用于一步合子注射条件敲除的短条件intrON

基因分型

用30μl含有1μl蛋白酶K（20 mg/ml；Promega，MC5005）在55°C下过夜。所得混合物用270μl不含核酸酶的水稀释，并在13000×克然后，根据制造商的说明，使用2–3μl溶液的透明部分与Gotaq（Promega，M7808）或LongAmp 2X（NEB，M0287S）进行PCR。为了检查基因组DNA的序列，使用纯化柱纯化预期大小的PCR条带。

eGFP-SCON/eGFP-DECAI构造

eG-SCON-FP和eG-DECAI-FP盒从Genscript中排序并由Genscript合成，然后用BamHI（R0136S，NEB）和XhoI（R0146S，NEB）消化并用T4连接酶（M0202S，NEP）连接后克隆到pcDNA4TO结构中。将载体与Cre-expressing细菌（A111，基因桥）重组以获得重组形式。通过SalI（R0138S，NEB）限制性酶切和Sanger测序确认了正确的克隆。

SCON A延伸变异体插入eGFP cDNA

在选定的内含子插入位点含有SapI识别位点的eGFP cDNA由Genscript进行排序和合成，并用BamHI和XhoI克隆到pcDNA4TO结构中。然后，将含有各自互补端的不同SCON变体片段插入eGFP中，并与SapI（R0569S，NEB）和T4连接酶进行20个循环，分别在37℃下2 min和16℃下5 min，然后在37℃和80℃培养下15 min和10 min⁵.混合物转化为大肠杆菌从单个菌落中提取DNA，并用限制性消化和Sanger测序进行检查。

细胞培养和转染

非洲爪蟾和达尼奥雷里奥胚胎注射

非洲爪蟾如前所述，收集卵子并在体外受精⁹将总共100 pg的DNA（包括50 pg的pcDNA4TO-eGFP、pcDNA4TO-eG-SCON-FP或pcDNA4TO-eG-SC-FP）和50 pg表达mCherry-的质粒注射到两个背向动物胚泡X·莱维斯胚胎处于4细胞期，大约24小时后在尾芽早期进行成像。对于达尼奥雷里奥实验中，将总共12 pg的DNA（包括6 pg的pcDNA4TO-eGFP、pcDNA4TO-eG-SCON-FP或pcDNA4TO-eG-SC-FP）和6 pg表达mCherry-的质粒注入每个受精卵/1细胞期斑马鱼约24小时后进行成像。X·莱维斯使用配备有GFP（激发：ET470/40nm；发射：ET525/50 nm）和mCherry（激发：ET560/40 nm；发射：ET630/75 nm）过滤器。斑马鱼胚胎用立体Lumar成像。配备GFP的V12荧光显微镜（蔡司）（激发470/40 nm；发射525/50 nm）和mCherry（激发550/25 nm；发射605/70 nm）滤波器。

肠道类有机物培养

组织学和免疫组织化学

使用自动组织处理器Donatello（Diapath）上的标准组织协议处理样本。将样品嵌入石蜡中，并在玻片上切割成2μm的切片。苏木精和伊红染色根据标准方案使用Gemini AS染色仪（Thermo Scientific）进行。免疫组化采用以下抗体：兔抗Ki67抗体（1:200；室温下2h；Abcam，Ab16667）和兔抗β-连环蛋白（1:300；室温下1h；Abcam，ab32572）。对于信号检测，使用了两步HRP共轭兔聚合物系统（DCS，PD000POL-K）。使用Pannoramic FLASH 250 III扫描仪（3DHISTECH）用40倍物镜对着色幻灯片进行成像，并使用CaseViewer软件对图像进行裁剪。

要识别奥尔夫姆4和重量3mRNA，我们使用RNAscope®多重荧光检测试剂盒v2（ACDBio 323110）进行了RNA原位杂交（ISH）分析。根据ACD公司提供的标准手册进行分析。简单地说，在染色前一周，将石蜡包埋样品在玻璃载玻片上新切至4μm厚，然后将载玻片干燥并仅在室温下保存。染色前一天，将载玻片手动脱蜡、预处理，并在室温下储存过夜，以便进一步处理。第二天根据制造商手册使用探针进行双重染色奥尔夫姆4（311831-C2，Cy3）和重量3（312241，Cy5）。使用Pannoramic FLASH 250 III扫描仪（3DHISTECH）用40倍物镜对着色幻灯片进行成像，并使用CaseViewer软件对图像进行裁剪。

肠道类有机物的免疫荧光分析

将含有有机物的BME液滴小心收集到1.5 ml试管中，并在台式离心机中以600×克持续5分钟。去除附着的BME的上清液和可见部分。将颗粒重新悬浮在4%多聚甲醛中，并在室温下固定15–20分钟。固定有机物在1x PBS中以10–15分钟的间隔清洗3次。在含有5%二甲基亚砜、0.5%Triton-X-100（Sigma，T8787）和2%正常驴血清（SigmaD9663）的溶液中，在4°C下封闭并渗透有机物1小时。样品用Alexa 647-共轭小鼠抗β-catenin（1:200；Cell Signaling Technology，4627S）和ATTO 488-共轭卵磷脂（1:300；Sigma，49409-10NMOL）染色过夜。用1x PBS清洗样品三次。在最后一次清洗过程中，样品用2μg/ml DAPI培养，然后在含有60%甘油和2.5M果糖的溶液中安装在盖玻片上¹¹然后在多光子SP8共焦显微镜（徕卡）上成像。

SCON的中性在各种脊椎动物中是保守的

几十年来，cKO等位基因已在小鼠中广泛使用，因为其方法稳健，涉及到具有种系竞争力的ES细胞¹⁶，国际敲除鼠协会的努力¹⁷以及最近CRISPR技术的出现¹⁸然而，在许多其他脊椎动物物种中，如斑马鱼、青蛙、大鼠、猪、牛和非人类灵长类动物模型，cKO方法的应用受到了限制，主要是因为缺乏可靠的种系竞争性ES细胞。因此，我们试图测试SCON是否是一种适用于非小鼠物种的cKO策略。为此，我们使用了不同物种的细胞系，包括C6(褐家鼠)，PK15(苏斯克罗法)，LLC-MK2型(马卡·穆拉塔)和Vero(欧硫磷Cercopithecus aethiops)细胞，并用eGFP、eG-SCON-FP或eG-DECAI-FP过表达构建物和相应的Cre-recombined形式转染它们。与HEK293T和小鼠ES细胞的结果一致，SCON内含子在任何被测细胞系中都没有引起任何明显的低形态效应（图。3a–d年与红色相比，蓝色），而SCON的重组形式完全消除了eGFP的表达（图。3a–d年，橙色）。有趣的是，与eG-SCON-FP相比，在三种细胞系（C6、PK15和Vero）中，eG-DECAI-FP的eGFP水平显著降低（图。​（图3e），第三版)再次证实SCON不存在与DECAI相关的低形态效应。此外，我们还探索了在青蛙中利用SCON的可能性(非洲爪蟾)和斑马鱼(达尼奥雷里奥)通过将eGFP、eG-SCON-FP和Cre重组质粒分别注射到4细胞期胚胎或受精卵中。我们在注射后24小时检查了胚胎。并观察到eGFP和eG-SCON-FP表达容易检测到的eGFP荧光，而接受重组形式的胚胎没有表达（图。3f，克). 总之，这些数据表明SCON有潜力在多种脊椎动物物种中用作cKO系统。

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图3

SCON适用于各种脊椎动物，并且是中性的。

一——d日C6的流式细胞术分析(一)，LLC-MK2型(b条)，PK-15(c（c）)和Vero(d日)转染eGFP（红色）、eG-SCON-FP（蓝色）、eG-SC-FP（黄色）或空载体或mCherry单独（灰色）的细胞。e（电子）流式细胞术分析比较转染eG-DECAI-FP（灰色）或eG-SCON-FP（黄色）的不同细胞系中的GFP水平*第页 < 0.001，来自未配对t检验。（f），克 爪蟾注射eGFP、eG-SCON-FP或eG-SC-FP构建物的斑马鱼胚胎在注射后24小时进行成像。使用含有mCherry的质粒作为注射对照。比例尺，500μm。

一步注射受精卵靶向插入SCON

由于我们的体外过度表达系统的结果证明了SCON对cKO方法的适用性，我们接下来试图测试它是否也能在体内靶向内源性基因。因此，我们选择生成SCON cKOCtnnb1型等位基因（图。4a、b)，编码β-连环蛋白，是一种发育所需的基因，其敲除会导致小鼠早期死亡。我们将含有300 bp-long商业合成单链脱氧核苷酸（ssODNs）的CRISPR核糖核蛋白（RNP）注射到发育中的2细胞期小鼠胚胎的细胞质中，单链脱脱氧核苷酸由短同源臂SCON组成（5′和3′同源臂分别为55和56 bp）¹⁹基因分型和测序结果显示，14个后代中有一个（7.1%）表现出精确的杂合子整合，其他等位基因保持完整（图。​（图4c）。4c类). 从这些后代中，我们能够进行回交以确认种系传播，并且我们继续繁殖直到获得纯合子(Ctnnb1型^{斯科恩/斯科恩})（图。​（图4d）。第4天). 从杂合子到杂合子（HET）杂交中，我们没有观察到纯合子（HOM）小鼠代表性不足的比率（图。​（图4e），第四版)HOM小鼠没有可识别的表型，通过SCON插入证实了完整的基因功能。类似地，我们生成了第二个SCON cKOSox2系统具有FRT重组位点的等位基因（图。​（图4f）。第4页). Sox2小鼠表现正常，可以繁殖到纯合子（图。​（图4g），4克)HET-HET杂交产生了预期的HOM小鼠比例（图。​（图4h）。4小时). 在当前的研究中，我们在两个不同的实验室成功地将SCON插入小鼠的13个不同等位基因中（图。​（图4a），4a类)，它们处于不同的繁殖阶段，以确认适当的功能。这些结果再次表明SCON适合在体内产生cKO等位基因。

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图4

SCON小鼠可以通过一步胚胎注射产生，SCON在纯合子中可以耐受。

一SCON成功靶向的等位基因列表以及使用的相应效率、基因型和重组位点。b条SCON靶向ssODN的示意图，其左、右同源臂分别为55和56 bp，位于Ctnnb1型基因。c（c）WT、5′和3′等位基因的Sanger序列追踪Ctnnb1型和Ctnnb1型^烤饼分别是。d日的基因分型PCRCtnnb1型^{斯科恩/斯科恩}（主页），Ctnnb1型^+/烤饼（HET），以及Ctnnb1型^+/+（WT），其中较低（403 bp）和较高（592 bp）的带分别对应于WT和敲入等位基因。e（电子）双杂合子杂交的基因型量化(Ctnnb1型^+/烤饼). 后代总数，n个=40（f）的示意图Sox2系统^烤饼等位基因。克的基因分型PCRSox2系统^{斯科恩/斯科恩}（主页），Sox2系统^+/+（WT），以及Sox2系统^+/烤饼（HET），其中较低（206 bp）和较高（395 bp）的带分别对应于WT和敲入等位基因。小时杂合子杂交的基因分型量化(Sox2系统^+/烤饼). 后代总数，n个=74

验证的条件功能Ctnnb1型^烤饼等位基因，我们利用维尔林·克莱尔^T2段(维尔-克莱尔^T2段)用于肠上皮特异性Cre重组。我们首先从HOM的十二指肠分离出隐窝(维尔-克莱尔^T2段;Ctnnb1型^{斯科恩/斯科恩})和野生型(Ctnnb1型^+/+)小鼠建立以成体干细胞为基础的肠道类有机物。然后，用4-OH-tamoxifen暂时处理出芽的类有机物培养物（含EGF、Noggin和R-spondin1）8小时。4-OH-tamaoxifen处理过的和未处理的野生类有机物以及未处理的HOM类有机物都继续正常生长（图。​（图5a）。5a级). 然而，4-OH-tamoxifen处理的HOM类有机物从第2天起停止生长或崩溃。免疫标记证实了小囊性突变类器官中β-连环蛋白的丢失，而DAPI和指骨样蛋白染色显示细胞仍然存活（图。​（图5a5a级).

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图5

Ctnnb1型^烤饼小鼠体内含有功能性条件等位基因。

一WT中的小肠类有机物(Ctnnb1型^+/+)和HOM(维尔-克莱尔^T2段; Ctnnb1型^{斯科恩/斯科恩})用4-OH-三苯氧胺（4-OHT）或载体处理小鼠8小时。在第4天固定有机物，并对β-连环蛋白（灰色）、指骨样蛋白（绿色）和DAPI（青色）进行染色。比例尺，100μm。纯合子(维尔-克莱尔^T2段; Ctnnb1型^{斯科恩/斯科恩})肠道健康，上皮隐窝绒毛形态正常(b条)细胞膜上的β-catenin(b条′）和Ki67标记隐窝中的增殖细胞(b条″). 杂合的(维尔-克莱尔^T2段; Ctnnb1型^+/烤饼)肠道形态无变化(c（c），e（电子）)，β-连环蛋白(c（c）′,e（电子）)或Ki67(c（c）″,e（电子）〃）三苯氧胺治疗后。在纯合子肠道中，三苯氧胺治疗会导致隐窝消失(d日)β-catenin染色(d日′）和Ki67染色(d日”）第3天。第5天，上皮细胞完全丧失(（f）——（f）″). H&E、苏木精和曙红。比例尺，50μm。克——j个小肠切片的smRNA-FISH与DAPI（蓝色），奥尔夫姆4（红色），和重量3（白色）。克，小时HET未诱导肠道切片(克)和HOM(小时)小鼠；我，j个诱导后第3天，每20 g体重的HET服用3 mg三苯氧胺(我)和HOM(j个)老鼠。比例尺，10μm。

为了直接验证体内功能，我们将每20 g体重3 mg他莫昔芬注射到两个HOM中(维尔-克莱尔^T2段;Ctnnb1型^{斯科恩/斯科恩})和HET(维尔-克莱尔^T2段;Ctnnb1型^+/烤饼)并在第3天和第5天收获肠道。对照样品显示正常的隐窝绒毛轴、可检测到的膜结合β-连环蛋白和位于隐窝底部的Ki67+增殖区，干细胞和祖细胞位于此处（图。5b，b′，b〃，c，c′，c〃，e，e′，e〃). 第3天，三苯氧胺处理的HOM样品显示增生性隐窝明显消失，β-连环蛋白染色消失（图。5d，d′，d〃). 在第5天，三苯氧胺治疗的HOM小鼠表现出肠道缩短和发炎，其切片显示肠上皮几乎完全丧失（图。5f，f′，f〃). 这些数据表明Ctnnb1型^烤饼体内等位基因和重组后β-catenin功能的丧失。我们还使用单分子RNA荧光原位杂交（smRNA-FISH）分析奥尔夫姆4和重量3分别是肠干细胞和Paneth细胞分泌的分子的标记。两者都有奥尔夫姆4和重量3在两个HET的未诱导隐窝中表达（图。​（图5g）5克)和HOM（图。​（图5h）5小时)基因型。注射三苯氧胺后第3天，奥尔夫姆4和重量3HET隐窝中仍有表达（图。​（图5i）第5页)但在HOM肠中丢失（图。​（图5j），5焦耳)表明干细胞和Paneth细胞丢失。

我们感谢古、埃林和乌尔班实验室的成员进行了宝贵的讨论和提出了批判性意见，感谢瑞克·齐特洛博士阅读和更正了手稿，感谢VBC核心设施（特别是组织病理学设施、生物光学和动物管理员），感谢田中Elly博士的实验室提供了青蛙胚胎。这项工作得到了奥地利科学院分子生物技术研究所（IMBA）的核心资助；ERC启动拨款，Troy干细胞，639050；Interpark生物融合中心赠款计划；以及S.W.和K.G.（奥地利科学院DOC奖学金）和G.C.（Lise Meitner博士后奖学金M 2976，FWF）的奖学金。