果蝇属pVALIUM10 TRiP RNAi线路导致基于网关的转基因的非期望沉默

摘要

介绍

dsRNA-介导的转录后基因沉默，也称为RNAi，是一种古老的抗病毒防御机制，已被用作各种培养细胞、植物和动物模型系统中反向功能遗传学的有力工具(Kennerdell&Carthew，1998年;Lohmann等人，1999年;Wargelius等人，1999年;Wianny&Zernicka-Goetz，2000年;Zamore等人，2000年). dsRNA沉默依赖于一种名为Dicer的高度保守的RNase III酶，该酶识别dsRNA并将其加工成21-23 bp的小片段（siRNA）。当加载到多蛋白RNA诱导的沉默复合物中时，引导链有助于与互补的靶向RNA配对，这些互补的靶RNA随后会被Argonaut蛋白的作用降解(Tomari&Zamore，2005年). 在果蝇属，通过使用转基因二进制表达系统（如Gal4/UAS）表达dsRNA，可以实现时空控制的RNAi敲除(Brand&Perrimon，1993年). 最初的转基因RNAi系是使用从一个质粒转录的连接性反向重复序列质粒生成的(Kennerdell&Carthew，1998年)或两个(佐丹奴等人，2002年)相反的启动子。然而，这些载体是不稳定的，并且通常用于克隆的菌株不能很好地耐受(哈根和沃伦，1983年;Piccin等人，2001年)，这个问题后来通过在重复序列之间引入内含子间隔符来解决(Lee&Carthew，2003年;Bao&Cagan，2006年). 这一循序渐进的进展导致了pVALIUM（蠕虫attB-loxP-intron-UAS-MCS）的开发，这是一种通用的转基因RNAi文库生成载体系统。pVALIUM RNAi载体包含眼睛颜色选择标记(朱砂)，一个attB位点，使phiC31介导的位点定向整合到预定义的基因组位置，白色或自由贸易区内含子促进dsRNA的加工，一盒两个UAS五聚体，其中一个两侧有loxP位点以调节dsRNA表达水平，以及多个克隆位点（MCS）(Ni等人，2008年).

基于pVALIUM10的高效转基因RNAi库存在果蝇属转基因RNAi项目（TRiP；https://fgr.hms.harvard.edu/fly-in-vivo-rnai)哈佛医学院https://fgr.hms.harvard.edu代表了果蝇属社区(Perkins等人，2015年). 撰写本文时，布卢明顿有1808种基于pVALIUM10的转基因TRiP RNAi库存果蝇属库存中心（BDSC；https://bdsc.indiana.edu/index.html) (佩里蒙等人，2010年). pVALIUM10载体携带吉普赛人显著提高击倒效率的绝缘体，以及两个倒置的“attR1-选择-attR2”盒，通过位点特异性网关体外重组促进dsRNA片段的克隆(Ni等人，2009年;Reece-Hoyes&Walhout，2018年). 通过LR克隆酶催化attL和attR位点之间的重组，可以很容易地将长度为400–600 bp且两侧有attL1和attL2重组位点的所需单个片段从入口载体转移到pVALIUM10目的载体，从而产生UAS驱动的dsRNA表达载体(Ni等人，2009年).

Gateway克隆技术还经常用于生成用于表位标记或未标记蛋白质表达的转基因构建物，利用果蝇属网关质粒收集果蝇属基因组资源中心（DGRC；https://dgrc.bio.indiana.edu/). 重要的是，与pVALIUM10 dsRNA质粒一样，网关表达载体的产生依赖于attL和attR位点之间的重组，从而形成attB1和attB2位点。

在这里，我们证明了pVALIUM10衍生的RNAi株会导致通过Gateway克隆技术产生的转基因报告基因和过表达株遭到不良的敲除。它们通过靶向作为转录mRNA一部分的attB位点来实现这一目的。从Gateway表达目的载体中删除attB1和attB2序列会消除这种影响并恢复预期的转基因表达水平。

结果

多个pVALIUM10 RNAi系对RNase H1:：GFP报告基因的意外脱靶沉默

基于RNAi的体内基因筛查已被证明在识别多种肿瘤的发育和病理过程中涉及的新基因方面非常成功果蝇属使用组织特异性Gal4驱动线表达的体组织(Lesch等人，2010年;Neey等人，2010年;Saj等人，2010年;Port等人，2011年;Zeng等人，2015;Pletcher等人，2019年;Rotelli等人，2019年;Zhou等人，2019年;Graca等人，2021年;Rylee等人，2022年). 因此，我们着手进行候选基因筛查，旨在确定控制基因组稳定性的因素。在潜在候选基因的预筛选过程中，我们观察到pVALIUM10-based的表达BuGZ公司^{RNAi[TRiP.JF02830]}在发育中的三龄翼膜囊区的RNAi线，使用球蛋白Gal4,无人机-mRFP(nub>mRFP)驱动系，有效抑制多表位标记的BuGZ转基因(BuGZ公司^{FlyFos[v318366]}) (Sarov等人，2006年) (图1A、B和D). 使用独立的BuGZ公司^{RNAi[KK104498]}从维也纳出发的线路果蝇属资源中心（VDRC）KK RNAi库(图1C和D). 受这些结果的鼓舞，两个BuGZ RNAi株都被纳入候选基因筛选，该筛选基于用nub>mRFP驱动程序。作为基因组稳定性的读数，我们使用了通过重组核糖核酸酶H1将序列从果蝇属网关质粒收集。这导致在多泛素启动子的控制下C末端GFP标记的RNase H1的表达(图2A和B). RNase H1酶识别并分解转录过程中出现的R环，即DNA:RNA杂交体，如果无法解决，将对基因组稳定性构成威胁(圣佩雷拉和阿奎莱拉，2015年;Crossley等人，2019年). 出乎意料的是，我们观察到RNase H1:：GFP信号在表达BuGZ公司^{RNAi[TRiP.JF02830]}但不是BuGZ公司^{RNAi[KK104498]}线路(图2C、D和H). 令人惊讶的是，基于pVALIUM10的RNA酶H1:：GFP也有类似的下调myc公司^{RNAi[TRiP.JF01761]}但不是myc公司^{RNAi[TRiP.HMS01538]}或myc公司^RNAi[GD2948]分别来自pVALIUM20和pMF3载体(图1D和2E–H型). 所有三个myc公司其他人已经证明RNAi线路有效(Aughey等人，2016年;Kim-Yip&Nystul，2018年;Rust等人，2018;Ledru等人，2022年). 这些结果表明，受试的pVALIUM10 TRiP RNAi株而非pVALIUM20、KK或GD株可能会导致RNase H1:：GFP转基因的不良沉默。我们进一步推测，从pVALIUM10表达的dsRNA包含与触发这种意想不到的脱靶效应的靶基因特异性序列无关的片段。

在单独的窗口中打开

图1。

pVALIUM10和KK RNAi线路可有效沉默。

（A、B、C）pVALIUM10的表达BuGZ公司^{RNAi[行程JF02830]}（B，B’）和基于KKBuGZ公司^{RNAi[KK104498]}使用球蛋白Gal4,UAS-myr-mRFP驾驶员(核心>mRFP，淡蓝色）导致BuGZ显著减少^{FlyFos[v318366]}翼盘（WDs）囊区相对于铰链和凹槽的转基因蛋白质，并控制WD（A，A'）。显微照片显示了从7日龄AEL三龄幼虫分离的WDs的多个共焦切片的投影。多岩坑-标记为BuGZ^{FlyFos[v318366]}用抗GFP抗体（白色）免疫染色观察蛋白质。用DAPI（洋红色）对细胞核进行复染。比例尺：100µ米。（D）用于克隆和过度表达dsRNA的各种载体的示意图。在缺乏靶向特异性抗体的情况下，可以在内源性调控序列的控制下，借助表达多孔标记蛋白的FlyFos转基因来评估RNAi功效。

在单独的窗口中打开

图2。

基于pVALIUM10的株系导致RNase H1:：GFP转基因报告子的非靶向沉默。

（A）转基因的示意图pUWG-R酶H1表达多泛素C末端GFP标记的RNase H1:：GFP蛋白的报告构建(联合国大学)启动程序。这个核糖核酸酶H1编码序列的两侧是通过LR克隆酶催化的网关介导的重组产生的attB1和attB2位点。（B、C、D、E、F、G）用GFP特异性抗体进行的免疫染色显示，细胞核蛋白结构域（mRFP，浅蓝色）中的RNase H1:：GFP水平显著降低，其中pVALIUM10基于BuGZ公司^{RNAi[行程JF02830]}（C） 以及myc公司^{RNAi[TRiP.JF01761]}（E） RNAi系使用球蛋白Gal4,UAS-myr-mRFP驾驶员(nub>mRFP). 在对照WD（B）和KK-based表达后，未观察到RNase H1:：GFP信号的下调BuGZ公司^{RNAi[KK104498]}（D） ，基于pVALIUM20myc公司^{RNAi[TRiP.HMS01538]}（F） ，或基于GDmyc公司^RNAi[GD2948]（G） 。显微照片显示了从7日龄AEL三龄幼虫分离的WDs的多个共焦切片的投影。用DAPI（洋红色）对细胞核进行复染。比例尺：100µ米。（H）RNase H1:：GFP信号的定量描述为眼袋和凹口区域之间的相对强度比。采用Tukey多重比较检验，通过单因素方差分析确定统计显著性；n≥3**P（P）< 0.01, ****P（P）<0.0001，不适用，无显著性。（一）pVALIUM10 RNAi系的产生依赖于LR克隆酶介导的dsRNA片段从进入载体到pVALIUM10目的载体的重组(Ni等人，2009年). 由pVALIUM10 dsRNA表达载体产生的dsRNA发夹是siRNA物种的来源，siRNA物种不仅针对感兴趣的转录物（目标ORF），还针对通过相同重组机制产生的任何网关表达载体中的attB1和attB2位点。

此图的源数据可用。

图2的源数据LSA-2022-01801_S数据F2.xlsx

pVALIUM10 RNAi系通过attB位点沉默Gateway转基因

为了验证我们的假设，我们克隆了m樱桃色将序列编码到pUWG网关表达载体（pUWG-m樱桃色)允许普遍表达m樱桃色转录本两侧为attB1和attB2位点。pUWG-m樱桃色然后将载体用作重叠PCR的模板，以生成pUWG^ΔattB-m樱桃色缺少attB站点的构造(图3A). 这两种质粒都被用于通过标准品建立转基因蝇系果蝇属种系转化法(Rubin&Spradling，1982年). 易感性或抵抗力ubi-m樱桃（pUWG）-m樱桃色)和联合国大学^ΔattB-m樱桃色（pUWG）^ΔattB-m樱桃色)然后，通过驱动不同的RNAi株，在nub-Gal4合金驱动程序。使用抗RFP抗体对三龄翼型椎间盘进行免疫染色，发现ubi-mCherry和ubi的模式相同^ΔattB-对照组中的樱桃转基因(节点>)背景(图3B和C). 相比之下，ubi-mCherry的水平，而不是ubi^ΔattB-mCherry转基因蛋白在过表达BuGZ公司和myc公司pVALIUM10 TRiP RNAi线路(图3D、E、H–J和M)，而当BuGZ公司和myc公司分别使用KK和pVALIUM20 RNAi线路敲除(图3F-H和K-M). 重要的是，使用一组额外的pVALIUM10 TRiP RNAi序列，以靶向性为靶点，重新描述了ubi-mCherry的attB位点依赖性沉默附件3,嘴唇4,yki公司,DH44型,ftz-f1型,杂志,小子、和行动β基因(图S1).

在单独的窗口中打开

图3。

pVALIUM10 RNAi序列通过attB1和attB2位点沉默Gateway转基因。

（A）转基因示意图pUWG-m樱桃色和突变型pUWG公司^ΔattB-m樱桃色记者构建。mCherry由多泛素表达(联合国大学)启动程序。（B、C） ubi-m樱桃和突变型联合国大学^ΔattB-m樱桃色记者在翅膀的影像盘上显示出类似的表达模式。（D、E、F、G、H、I、J、K、L、M） ubi-m樱桃被pVALIUM10有效下调BuGZ公司^{RNAi[行程JF02830]}和myc公司^{RNAi[TRiP.JF01761]}在球蛋白Gal4驾驶员(节点>)相对于WD的其余部分（D、H、I、M）。（东、西、中、日）相反，attB1和attB2序列的缺失使得联合国大学^ΔattB-m樱桃色报告者对pVALIUM10 RNAi介导的沉默具有耐药性（E，H，J，M）。（F、G、H、K、L、M）都不是基于KK(BuGZ公司^{RNA干扰[KK104498]})也不基于pVALIUM20(myc公司^{RNAi[TRiP.HMS01538]})RNAi株系影响未修饰或突变报告基因结构（F、G、H、K、L、M）表达的mCherry水平。显微照片显示了用抗mRFP抗体（白色）免疫染色的第7天AEL三龄幼虫分离的WDs的多个共焦切片的投影。用DAPI（洋红色）对细胞核进行复染。比例尺：100µ米。（高、中）mCherry信号的量化描述为眼袋和眼窝区域（H，M）之间的相对强度比。每组中的上标文字表示使用的RNAi类型。采用Tukey多重比较检验，通过单因素方差分析确定统计显著性；n≥3**P（P）< 0.01, ****P（P）<0.0001，不适用，无显著性。（N、O、P、Q）pVALIUM10的表达BuGZ公司^{RNAi[行程JF02830]}（O） 在翼袋中使用球蛋白Gal4,无人机-mRFP驾驶员(核心>mRFP)与对照组（N）和基于KK的SmD3:：3xHA水平相比降低BuGZ公司^{RNA干扰[KK104498]}（P） ●●●●。注意SmD3的病灶：对照组中的3xHA蛋白（N“）和BuGZ公司^{RNAi[KK104498]}不存在于BuGZ公司^{RNAi[行程JF02830]}-表达细胞（O”）。显微照片显示了用抗-HA抗体（白色，N'，O'，P'；红色，N“，O”，P“）免疫染色的第7天AEL三龄幼虫分离的WDs的多个或单个共焦切片的投影。用DAPI（洋红色）对细胞核进行复染。比例尺：100或5μm（N“，O”，P“）。（问）眼袋区SmD3:：3xHA信号强度（Q，左）和SmD3::：3xHA-阳性点刺（Q，右）的定量。分别采用Tukey多重比较检验和Kruskal–Wallis检验进行单因素方差分析，确定统计学显著性；n≥6**P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，无显著性差异。

此图的源数据可用。

图3.1的源数据LSA-2022-01801_S数据F3.1.xlsxLSA-2022-01801_S数据F3.2.xlsxLSA-2022-01801_S数据F3.3.xlsx

在单独的窗口中打开

图S1。

pVALIUM10 RNAi序列通过attB1和attB2位点沉默Gateway转基因。

（A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P）重量ubi-m樱桃但不是联合国大学^ΔattB-m樱桃色缺乏attB1和attB2序列的报告者通过靶向pVALIUM10 RNAi株在眼袋区域有效下调附件3（A、B）、，yki公司，（C，D），行动β（E，F），频率-频率f1（G，H），DH44型（I，嘴唇4（K，L），杂志（M，N），和小子（O，P）转录本在球蛋白Gal4驾驶员(节点>)相对于WD的其余部分。显微照片显示了用抗mRFP抗体（白色）免疫染色的第7天AEL三龄幼虫分离的WDs的多个共焦切片的投影。用DAPI（洋红色）对细胞核进行复染。交叉保持在29°C。比例尺：100µ米。

最后，我们测试了pVALIUM10 TRiP RNAi系是否也可能干扰含有UAS诱导型attB的转录物，例如从Gateway目的地载体pGW-HA.attB表达的转基因苍蝇ORF(Bischof等人，2014年). 为此，我们评估了pVALIUM10或KK-BuGZ-RNAi株存在时SmD3:：3xHA蛋白的水平。与之相反，对照组的翼囊细胞中SmD3:：3xHA蛋白和阳性点刺的富集(节点>)和BuGZ公司^{RNAi[KK104498]}在表达翼盘时，总水平和阳性穿孔数在年明显减少nub>BuGZ^{RNAi[TRiP.JF02830]}单元格(图3N-Q). 这些结果表明，由pVALIUM10 RNAi载体产生的dsRNA发夹产生attB1和attB2-siRNAs，指导含有此类靶位点的转录物的破坏。这种通过attB位点的离靶沉默是基于pVALIUM10的RNAi谱线所特有的。attB1和attB2位点的缺失使得网关衍生转录物对非预期pVALIUM10 TRiP RNAi沉默具有抵抗力。

讨论

利用转基因RNAi实现候选基因的发育阶段和组织特异性敲除，并在果蝇属在过去二十年里已经司空见惯了(Dietzl等人，2007年;Port等人，2011年;Blake等人，2017年;胡等，2017). 近年来，我们对RNAi机制的认识和高效生成新型RNAi结构的工具都有了很大的发展。因此，建立了几个独立的转基因RNAi库存集合，包括维也纳果蝇属库存中心（VDRC，23411 RNAi线路；https://stockcenter.vdrc.at/control/main网站)，布鲁明顿果蝇属库存中心（BDSC，13698 RNAi线路；https://bdsc.indiana.edu/)和国家遗传学研究所（NIG，12365 RNAi株；https://shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/)在写作时。然而，尽管转基因技术被广泛应用，但对基因表达的转基因操作仍可能产生无法预料的后果。VDRC KK收集的大部分RNAi株被发现产生表型，因为二次插入和随后的异位表达顶部基因(Green等人，2014年;Visser等人，2016年). 最近，范德格拉夫（van der Graaf）及其同事报告称，转基因插入到常用的附件40第二条染色体上的着落位点可以降低LINC复合体成员Msp300的表达，从而导致核大小、形状和定位表型(范德格拉夫等人，2022 预打印).

在这里，我们证明了基于pVALIUM10的RNAi株导致从Gateway表达载体或可能包含attB1和attB2位点的任何转录物表达的ORF的非靶向沉默。我们表明，删除这些站点可以消除不受欢迎的击倒。鉴于Gateway表达载体广泛用于生成转基因蛋白报告子和标记过表达构建物，我们的结果表明，同时使用pVALIUM10 TRiP RNAi可能会导致与所研究的生物过程无关的实验伪影。

值得注意的是，在pVALIUM10载体的原始出版物中，作者通过比较发夹序列和果蝇属基因组(Ni等人，2009年)，它不包含与attB1和attB2序列等效的内源性21-nt延伸。然而，作为转基因工具箱果蝇属在不断扩大的情况下，每一个额外的转基因都有可能与现有的RNAi株产生合成效应。因此，我们建议研究人员在开始实验之前验证TRiP RNAi系的类型或表达载体序列。例如，我们不建议将基于pVALIUM10的RNAi与FlyORF的3xHA标记过表达株结合(网址：https://flyorf.ch) (Bischof等人，2014年)或fly-FUCCI（基于荧光泛素的细胞周期指示剂）细胞系，通过表达两个荧光标记的降解子，可以实时可视化细胞周期动态(Zielke等人，2014年). 在这两种情况下，转基因都是通过Gateway反应产生的，并且包含插入ORF两侧的attB位点(Bischof等人，2014年;Zielke等人，2014年)这可能导致转录本的非目标沉默。此外，这一发现加强了这样一种观点，即RNAi实验应该遵循过去几十年建立的标准，包括研究可能的非靶向效应以消除意外基因的敲除，使用多个独立的RNAi株来重述表型，并确认靶向基因产品的敲除(Echeverri等人，2006年;Green等人，2014年;卡亚·乔珀和施诺勒，2016年).

材料和方法

补充材料

致谢

工具书类