肺递送IL-10治疗对内毒素暴露后诱导的肺部炎症和消退后果产生有益影响

炎症标记物分析

使用3×1mL PBS收集支气管肺泡灌洗液（BALF）。计算组合回收灌洗液中的总细胞数，并用DiffQuick（Siemens，Newark，DE）染色的细胞蛋白预载玻片（细胞离心仪，ELITech Group，Logan，UT）测定差异细胞数。通过在500μl无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中匀浆肺样品来制备肺组织匀浆。通过ELISA（明尼苏达州明尼阿波利斯R&D Systems，Minneapolis，MN；最小检测剂量（MDD）为1.88、1.6、31.3、2.0、，分别为1.5和15.6 pg/ml。

肺细胞染色和流式细胞术

在血管灌注和BALF去除后，使用gentleMACS分离仪（加利福尼亚州奥本市Miltenyi Biotech）对采集的肺（右肺）进行自动分离程序¹⁹用LIVE/DEAD固定蓝死细胞染色试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，CA）和CD16/32（Fc Block，Biolegend，San Diego，CA）培养每只动物的肺细胞，以尽量减少非特异性抗体染色。用抗大鼠抗鼠CD45（克隆：30-F11；BD Biosciences，新泽西州富兰克林湖）、CD11b（克隆：M1/70；BD bioscience）、Ly6G（克隆：1A8；BD Biosciences）、CD11-c（克隆：N418；Invitrogen）、CD4（克隆RM4-5，BD Biosciences，仓鼠抗鼠CD3e（克隆145-2C11，BD Biosciences）和鼠抗鼠NK1.1（克隆PK136，BD bioscience）。Ly6G的选通策略⁺中性粒细胞，CD3⁺CD4细胞⁺T细胞，CD3⁺CD8（CD8）⁺T细胞，CD19⁺B细胞和NK细胞（如补充图所示¹)和单核细胞/巨噬细胞的数量如前所述^18,20–24。从活CD45中测定所有相应细胞群的百分比⁺排除碎片和双倍体后的肺白细胞。将该百分比乘以相应的总肺细胞数，以确定每只动物的特定细胞群数量。

肺组织病理学

灌洗后，左肺被切除并充气至15厘米高₂用10%福尔马林加压24小时（新泽西州费尔草坪Fisher Scientific公司），以保护肺部结构¹⁹对切片（4–5μm）的肺进行H&E染色，并在所有扫描放大倍数下对载玻片进行审查，并由对治疗条件不知情的实验病理学家（T.A.W.）利用先前公布的评分系统对肺部炎症的程度和分布进行半定量评估¹⁴该评分系统评估肺泡室炎症和细支气管室炎症的炎症变化谱。每个参数都被独立赋值，从0到5，分数越高表示肺部炎症变化越大。

确定CCR2⁺用抗CCR2（1:100，NBP267700，Lot HM0537，Novus，Littleton，CO）、抗髓过氧化物酶（MPO，1:100，Cat#ab9535，Lot#GR331736-4；Abcam）、抗波形蛋白（Abcam，ab92547，Lot#GR3258719-9，1:200）、，和抗CD68（泛巨噬细胞和清道夫受体标记物，Abcam ab31630，批号GR3305929-3，1:100）。与赛默飞世尔公司、马萨诸塞州沃尔瑟姆公司或山羊抗鼠IgG Alexa Fluor Plus 555（Invitrogen A32727，Lot#UL287768^25,26切片用VECTASHIELD®Antifade Mounting Medium with DAPI（4′6-二氨基-2-苯基吲哚；以识别细胞核）（Cat#H-1200，Lot#ZG1014，Curlingame，CA）固定，并在蔡司荧光显微镜下观察。在蔡司荧光显微镜（Zeiss Observer.Z1[Zeiss，White Plains，NY]）下从整个切片上拍摄肺实质的照片（每只小鼠10张肺图像）。中央控制室2⁺单核细胞源性巨噬细胞⁺通过Image J FIJI插件（版本：2.9.0/1.53t）定量中性粒细胞、波形蛋白表达和CD68+巨噬细胞。

该机构的组织科学核心设施还用改良的Masson’s Trichrome对肺部切片进行染色，并用Aperio扫描仪（莱卡生物系统公司，伊利诺伊州鹿园）进行扫描。使用VENTANA图像查看器（印第安纳波利斯罗氏诊断公司，印第安纳州，3.1.4版）从扫描切片中以20×的速度在每个切片上采集10张图像。将tiff图像插入图像J的FIJI插件。按照陈和同事的描述，对三色图像中的胶原蛋白含量进行量化²⁷简单地说，使用Masson的三色设置对三色图像进行反褶积。确定为胶原纤维的绿色成分用于170/215的阈值，以避免细胞核并聚焦于胶原纤维。测量并绘制积分密度，作为胶原蛋白含量的测量。

血液和血清研究

安乐死时从腋动脉采集的全血和如上所述采集的血清¹⁹血糖水平由血糖仪测定（True Metrix Air，Nipro Diagnostics，佛罗里达州劳德代尔堡）。根据制造商的说明（研发，MDD为0.159 ng/ml和1.6 pg/ml），采用Quantikine ELISA评估血清中戊四氮-2（小鼠急性期反应蛋白）和IL-6的水平。

统计分析

数据表示为平均值±标准平均误差（SEM）。为了检测3个或更多组之间的显著变化，如果p值<0.05，则使用单向方差分析（ANOVA）并进行事后检验（Tukey/LSD）以解释多重比较。采用非参数Mann-Whitney检验检测两组间的显著变化。所有统计分析均使用GraphPad Prism（版本：9.0.0）软件进行，统计显著性为双侧p<0.05。

一次性吸入高剂量LPS后肺细胞浸润的正常稳态恢复趋势

还通过流式细胞术对肺组织进行肺细胞群处理。LPS暴露后48小时，肺细胞总数增加并达到峰值，1周时恢复到正常值（图2A） ●●●●。高剂量LPS暴露随着时间的推移调节了肺巨噬细胞和单核细胞数量（图2B、 C）。即，肺泡巨噬细胞（CD11c）数量减少⁺CD11b型^洛)5、24、48和72小时，1周时恢复正常水平。活化/渗出巨噬细胞（CD11c⁺11亿加元^你好)24小时时显著高于基线水平（p=0.03），48至72小时时进一步升高，并在暴露后1周保持升高。LPS暴露后24小时，过渡期单核细胞/巨噬细胞数量增加（CD11c^整数CD11b型^你好)24h时达到峰值，72h和1周时继续增加。肺Ly6G⁺中性粒细胞在LPS暴露后5小时增加，48小时保持升高，1周时恢复到基线值（图2D） ●●●●。肺淋巴细胞（包括CD4+T细胞、CD8+T细胞，CD19+B细胞和NK细胞）的数量在48小时-72小时时增加，在1周时降至基线值（图2E） ●●●●。

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图2

一次性吸入高剂量LPS后，随着时间的推移，肺细胞浸润的正常稳态恢复趋势。去除碎片、双重细胞和活体CD45+细胞门控后，通过流式细胞术测定肺细胞数量（%人口乘以总肺细胞）。线形图用SEM条描述了总肺细胞随时间的平均值(A类)和肺单核细胞/巨噬细胞亚群(B类). (C类)肺单核细胞/巨噬细胞亚群的门控策略：1：肺泡巨噬细胞CD11c⁺CD11b型^洛，2：活化巨噬细胞CD11c⁺CD11b型^你好，3：转化单核细胞/巨噬细胞CD11ci^纳特CD11b型^你好，4：单核细胞CD11b^你好CD11c公司^-排除中性粒细胞后。(D类)赖氨酸6G⁺中性粒细胞，以及(E类)淋巴细胞群显示。N=24只小鼠（4只/时间点）。与生理盐水/基线相比，统计显著性表示为*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

共同地，这些研究描述了一次性接触高浓度LPS后一周内肺部细胞和介质人群的暴露后时间过程，并证明约48小时是研究肺细胞和介质反应的最佳时间点单核细胞/巨噬细胞亚群除外。由于高浓度LPS（100μg）诱导过度的肺部炎症反应，体重减轻接近体重的20%，因此滴注一次较低浓度的LPS（即100 ng和10μg），并在暴露后2周测量终点。这些修改后的剂量研究使我们能够了解脂多糖诱导的肺单核巨噬细胞数量是否会恢复到基线/正常水平。然而，即使在暴露于改良的高剂量LPS（10μg）后2周，肺巨噬细胞（CD11c）仍被激活⁺CD11b型^你好)，过渡型肺单核细胞/巨噬细胞（CD11c^整数CD11b型^你好)和肺单核细胞（CD11c^-CD11b型⁺)与生理盐水对照组相比仍显著升高（表​（表1）。1). 与生理盐水对照组相比，接触10μg LPS 2周后血糖水平也显著升高，但不是100 ng（表​（表1）。1). 在治疗后2周，LPS 10μg和盐水治疗组的BALF细胞、肺中性粒细胞或肺淋巴细胞数量没有显著差异（p>0.05）（表​（表11和数据未显示）。

肺给药rIL-10治疗促进一次性LPS暴露后全身和气道炎症事件的恢复

在这些研究中，我们试图确定用肺递送的rIL-10（1μg）治疗是否会加快LPS诱导炎症的恢复。使用改良的高剂量LPS（10μg）和暴露后2天的最佳时间点，在一次性LPS暴露后5、24和48小时，气管内滴注三种剂量的rIL-10或载体（实验设计示意图，图三A） ●●●●。rIL-10治疗显著降低了第2天LPS诱导的体重减轻（69%差异，p=0.0003，图三B、 C）。与溶媒对照组相比，rIL-10治疗组的血糖水平相应升高（图三D） ●●●●。rIL-10治疗后，小鼠急性期反应蛋白、五肽-2和IL-6的血清水平均显著降低（图三E、 F）。相反，各组BALF室中的总细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞的数量没有差异（图三G和数据未显示）。然而，rIL-10治疗降低了包括TNF-α、IL-6、CXCL1和CXCL2在内的气道炎症标记物，这一发现对TNF-β和IL-6尤其重要（图三H） ●●●●。在肺组织匀浆中测定了这些相同的炎症标记物，并显示出类似的趋势（图三一） ●●●●。即，rIL-10治疗几乎消除了肺TNF-α和IL-6的检测，并降低了CXCL1和CXCL2的水平。与IL-10给药一致，BALF和肺匀浆中IL-10水平均升高（图三J） ●●●●。

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图3

注射rIL10治疗可加速一次性LPS暴露后全身和气道炎症事件的恢复。(A类)实验设计示意图（使用BioRender.com创建）。(B类)线形图描述了重量随时间变化的SEM条形平均值。散点图描述了第3天与基线相比，各治疗组之间体重变化百分比的SEM条平均值(C类)，血糖水平(D类)，血清戊状腺素-2水平(E类)、血清IL-6水平(F类). 支气管肺泡灌洗液（BALF）中的细胞总流入量(克). ELISA法测定BALF气道炎症标志物水平(H（H）)和肺匀浆(我)BALF和肺匀浆IL-10水平(J型). 从2次实验运行中得到的N=7（载体）和N=8（rIL-10）小鼠/组。统计显著性用星号表示（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001）。

一次性高剂量LPS暴露后的rIL10治疗可调节特定的肺单核细胞/巨噬细胞数量

在这些小鼠中，还对肺组织进行了处理，以通过流式细胞术测定特定的肺细胞浸润。首先，与溶媒对照组相比，经rIL-10治疗的LPS暴露后，肺细胞总数减少（图4A） ●●●●。在检测的4个单核细胞/巨噬细胞亚群中，招募的、过渡的CD11c显著减少^整数CD11b型^你好与LPS暴露后的溶媒对照组相比，接受rIL-10治疗的小鼠的单核细胞/巨噬细胞亚群（图4B–D）。这一点可以从这两个百分比的下降中看出（图4C） 和数字（图4D） 其中CD11c^整数CD11b型^你好细胞。活化巨噬细胞（CD11c）的百分比增加，但数量没有增加⁺CD11b型^你好)和单核细胞（CD11c^-CD11b型^你好). 肺泡巨噬细胞（CD11c）无差异⁺CD11b型^洛)组之间。相应地，通过免疫组化染色，治疗组之间肺切片的小鼠巨噬细胞CD68标记物（也被认为是清道夫受体）的表达也没有显著差异（平均值±SEM，积分密度；LPS+车：5.86×10⁴ ± 1.81 × 10⁴，N=7只小鼠/组；和LPS+rIL-10:11.96×10⁴ ± 3.10 × 10⁴，N=8只小鼠/组；p=0.19）。

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图4

一次性LPS暴露后的灌注rIL10治疗可调节特定的肺单核细胞/巨噬细胞数量。(A类)散点图描述了LPS（10μg）暴露后，载体与rIL-10治疗组的总肺细胞的平均值（SE条）。(B类)治疗组之间肺巨噬细胞/单核细胞亚群闸门的代表性图像：1：肺泡巨噬细胞CD11c⁺CD11b型^洛，2：活化巨噬细胞CD11c⁺CD11b型^你好，3：转化单核细胞/巨噬细胞CD11ci^纳特CD11b型^你好，4：单核细胞CD11b^你好CD11c公司^-排除碎片、双倍体、死细胞、CD45后^-细胞和中性粒细胞（补充图¹). 活CD45中单核细胞/巨噬细胞亚群的百分比⁺散点图描绘肺细胞(C类). 然后将该百分比乘以计数的肺细胞总数，以表示这些亚群的数量(D类). 从2次实验运行中得到的N=7（载体）和N=8（rIL-10）小鼠/组。统计显著性用星号表示（**p<0.01，***p<0.001）。

一次性高剂量LPS暴露后rIL-10治疗对中性粒细胞和淋巴细胞肺细胞群的调节作用

肺输送的rIL-10也降低了百分比（图5A） 和编号（图5B） Ly6G的⁺LPS暴露后肺中性粒细胞与溶媒对照组的比较。对于淋巴细胞亚群，rIL-10治疗导致CD4+T细胞的百分比（而非数量）增加，CD8+T细胞数量（而非百分比）减少，NK细胞的百分比或数量没有差异（图5A、 B）。然而，CD19的百分比和数量都有所增加⁺rIL-10治疗后的B细胞（图5A、 B）。

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图5

一次性接触LPS后，肺给予rIL10治疗，调节中性粒细胞和淋巴细胞肺细胞数量。A、 散点图用SE条表示活CD45中性粒细胞和淋巴细胞的百分比平均值⁺肺细胞。其次，中性粒细胞和淋巴细胞肺细胞百分比乘以总肺细胞(B）补充图中描述的选通策略¹两次实验中，N=7（载体）和N=8（rIL-10）只小鼠/组。统计显著性用星号表示（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

肺输送的rIL-10治疗可减少肺组织病理学、CCR2+炎性单核细胞/巨噬细胞和MPO+中性粒细胞

通过显微镜观察，与溶媒对照组相比，用rIL-10治疗的小鼠中，LPS诱导的急性细支气管和肺泡炎症也有所减少（图6A） ●●●●。病理学家在不了解治疗条件的情况下，通过半定量评估证实了这种组织病理学观察（图6B） 与rIL-10治疗后总肺细胞减少相对应（图4). 基于证明特定LPS诱导招募的单核巨噬细胞（CD11c）减少的研究^整数CD11b型^你好)流式细胞术研究表明，rIL-10治疗的亚群（图4)，对肺切片进行CCR2表达染色（图6C） ●●●●。CCR2是一种主要存在于单核细胞源性巨噬细胞上的趋化因子受体，对单核细胞来源的巨噬细胞从外周血到受损组织的追踪非常重要。通过共焦显微镜，CCR2⁺与溶媒对照组相比，rIL-10治疗组小鼠的炎性单核巨噬细胞数量减少（图6C、 D）。肺组织MPO⁺与溶媒对照组相比，rIL-10治疗组小鼠的中性粒细胞也减少（图6E、 F），与流式细胞术研究一致（图5).

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图6

在一次性高剂量LPS暴露后，rIL-10治疗可减少肺部炎症、CCR2+炎性单核细胞和MPO+中性粒细胞。治疗组和假手术组（生理盐水对照组）的代表性H&E染色肺切片图像(A类)半定量肺部炎症评分(B类)如图所示。CCR2染色肺组织的共焦图像⁺炎性单核细胞/巨噬细胞（绿色）(C类)和髓过氧化物酶（MPO）⁺中性粒细胞（红色）(E类)细胞核DAPI染色（蓝色）和CCR2积分密度(D类)和MPO(F类)每只小鼠定量。每个鼠标每个部分的单个值平均为8到10个图像。统计显著性与假手术（####p<0.0001）。星号（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。线刻度为100μm。

肺给药rIL-10治疗可降低LPS诱导的三色染色肺胶原和肺波形蛋白表达。

与假手术组相比，通过三色染色测量的LPS+载体处理的小鼠中的胶原含量增加，并且在LPS暴露后48小时，肺递送的rIL-10治疗显著降低了这种反应（图7A、 B）。此外，与假小鼠相比，LPS暴露后，波形蛋白（一种可归因于间充质细胞（即成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞）和巨噬细胞表达的细胞外基质蛋白）的表达也显著增加，并且这种LPS诱导的波形蛋白表达也随着IL-10治疗而降低（图7C、 D）。这些数据支持LPS暴露后肺递送IL-10治疗可减少原发性纤维化过程以加快康复。

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图7

在一次性高剂量LPS暴露后，rIL-10治疗可降低肺胶原蛋白和波形蛋白的表达。治疗组和假手术组（生理盐水对照组）的代表性Masson三色肺切片图像(A类)用去卷积三色图像的积分密度作为胶原蛋白含量的测量(B类)如图所示。波形蛋白染色肺组织的共焦图像（绿色）(C类)细胞核DAPI染色（蓝色）和波形蛋白积分密度(D类)每只小鼠定量。每个鼠标每个部分的单个值平均为8到10个图像。统计显著性与假手术（####p<0.0001）。星号（****p<0.001）。线刻度为100μm。

作者感谢病理学和微生物学系组织科学设施（内布拉斯加州大学医学中心，美国东北部奥马哈）的成员在组织处理和染色方面提供的帮助。我们感谢内布拉斯加州大学医学中心流式细胞术研究核心设施的Victoria B.Smith、Holly Britton和Craig Semerad对流式细胞仪研究的帮助。原理图创建自www.BioRender.com网站我们也感谢Lisa Chudomelka提供的手稿提交帮助。