端粒8-氧代鸟嘌呤在没有端粒缩短的情况下导致快速过早衰老

端粒8oxoG增加细胞质DNA

衰老和癌症的一个共同特征是微核（MN）增加，也称为衰老细胞中的细胞质染色质碎片（CCF），这可能由不同的机制引起^5,38,39.DL在暴露4天后增加了BJ和RPE FAP-TRF1细胞的MN（扩展数据图。​图3a）。3a年). 与CCF一致，来自处理细胞的MN定位于细胞质内，γH2AX、异染色质标记H3K27Me3和自噬标记p62呈阳性，53BP1和常染色质标记LSD1（赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1A）和H3K27 Ac以及线粒体呈阴性（图。2a、b和扩展数据图。​图3b3亿)³⁹.拉明B1封装共因失效⁴⁰尽管端粒损伤降低了拉明B1的整体表达（图。​（图2b第2页和扩展数据图。3b–d日)，这是衰老的标志⁵.

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图2

端粒8oxoG的产生增加了细胞质DNA。

一，BJ FAP-TRF1细胞中γH2AX、H3K27me3和肌动蛋白的图像。插图，气泡MN增大。b，BJ和RPE FAP-TRF1细胞在5分钟DL后4天的指示标记的MN阳性百分比。误差条表示由黑圈表示的独立实验数量的平均值±标准差。c（c）DL处理5分钟后4天，BJ FAP-TRF1细胞进行cGAS和γH2AX染色。d日，5分钟DL或1小时2.5 mM KBrO后4天cGAS或γH2AX阳性的MN百分比_三面板内处理c（c）.e（电子）用5或20分钟DL处理7天后，对BJ FAP-TRF1细胞进行SASP分析。浓度标准化为每个样品中的最终细胞数。数据以倍数变化的形式呈现。实际浓度见补充表1.（f）DAPI显示DL后24小时MN和染色质桥的定量。每次实验至少计数500个细胞。克，从面板量化MN（f）显示着丝粒（Cen+）或端粒（Tel+）DNA的总MN阳性百分比，以及两者（Cen+/Tel+，或仅端粒DNA（Cen–/Tel+）的阳性百分比。每个实验至少分析30 MN。对于面板d日–克，误差条表示黑色表示的独立实验数量的平均值±标准差(d日,e（电子）)或红色和蓝色(（f）,克)圆圈。面板的统计重要性d日–（f）通过双向方差分析确定，对于面板克按倍数t吨-测试（ns，不显著*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001; ****P（P） < 0.0001).小时，BJ FAP-TRF1细胞在5分钟DL后24小时的实时成像中产生MN的有丝分裂百分比。对于UTn个 = 60和DL 5分钟n个 = 从两个独立的实验中观察到64个有丝分裂。我、活细胞成像的静像。左面板，产生MN的有丝分裂（箭头）；右侧面板，一个带核泡的间期细胞（箭头所示）。

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扩展数据图3

端粒8oxoG诱导的细胞质DNA的特征。

(一)BJ和RPE FAP-TRF1细胞在染料+光照5分钟后4天或BJ在2.5 mM KBrO作用1小时后每100个细胞核中MN数量的定量_三。每个实验至少有300个细胞得分。(b)在5分钟染料+光照处理后4天，RPE FAP-TRF1细胞的代表性图像被染色为指示标记（与图。​图2b）。第2页). 比例尺=第1、3-4行的10μm，第2行的20μm。(c（c）)面板中归一化为核区域的Lamin B1和Lamin A/C信号强度的量化(b). 误差线表示所示的平均值±标准偏差n个分析的核数。通过双向方差分析进行统计分析（ns=无显著性，***p<0.0001）。(d日)量化LMNB1型染料+光照5、10或20分钟后4天，或2.5或10 mM KBrO作用1小时后，BJ FAP-TRF1细胞的mRNA_三，相对于未经处理的。(e（电子）)BJ FAP-TRF1细胞微核百分比的量化，微核显示总体核γH2AX染色，并在5分钟染料+光照或2.5 mM KBrO一小时后4天出现cGAS阳性微核_三治疗。对于面板一和d-e公司，误差条表示条形图中黑色圆圈表示的独立实验数量的平均值±标准差。通过双尾t检验确定统计显著性（面板一RPE）或单向方差分析（面板一BJ和d日-e（电子）). （ns=不显著，*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001，***p<0.0001）。(（f）)染色+光照5分钟后4天RPE FAP-TRF1细胞的代表性图像，并用FISH对着丝粒和端粒PNA进行染色。白色方框放大MN。比例尺=10μm。

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MN由细胞质DNA传感器cGAS感应，cGAS促进衰老相关分泌表型（SASP）⁴¹.DL或KBrO_三增加cGAS的MN阳性百分比（图。2c、d). 显示cGAS+MN的细胞也显示核γH2AX增加，表明它们对DNA损伤有反应（扩展数据图。​图3e）。第三版). 与未经处理的细胞相比，DL在恢复后7天增加了常见的SASP因子，包括GDF-15、FAS和IL-1β（图。​（图2e）。第二版). 10 mM KBrO阳性对照_三ETP还产生了一种强健的SASP，它不仅破坏端粒（补充表1).

检测MN是否来自染色体断裂-融合桥（BFB）周期和滞后染色体¹⁰，我们在端粒8oxoG诱导24小时后量化染色质桥。虽然MN显著增加，但染色质桥没有增加（图。​（图2f）。第2页). 此外，着丝粒DNA的MN阳性百分比下降，而着丝粒DNA的MN阴性，但端粒DNA的阳性百分比增加（图。​（图2g2克和扩展数据图。​图3f）。第3页). 因此，端粒8oxoG不会增加滞后染色体（Cen+/Tel+MN），而是增加无着丝粒片段（Cen–/Tel+MN^42,43衰老细胞可通过间期染色质起泡而非丝裂炎产生MN^39,40表达H2B-RFP的BJ FAP-TRF1细胞的活细胞成像显示，DL后24小时产生MN的有丝分裂百分比没有变化（图。​（图2h2小时和补充视频1和2). 这证实了与防护蛋白破坏不同，急性端粒8oxoG损伤不会诱导BFB⁴⁴然而，虽然难以量化，但我们观察到端粒损伤后形成MN的原核DNA起泡，这与与衰老相关的CCF形成机制一致（图。​（图2i第2页和补充视频三和4).

由于凋亡细胞诱导DNA断裂，从而形成MN，我们通过膜联蛋白V（AV）和碘丙啶（PI）染色检测细胞凋亡。而20 J m的阳性对照^–2紫外线或10 mM KBrO_三DL可诱导晚期凋亡（AV+/PI+）和死亡（AV-/PI+）细胞，但不会增加细胞死亡或凋亡（扩展数据图。4a、b). 此外，与h₂O（运行）₂阳性对照（扩展数据图。​图4c）。4c类). 总之，¹O（运行）₂端粒的诱导并不直接诱导DNA断裂或凋亡，而是以与衰老一致的方式增加细胞质DNA。

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扩展数据图4

急性端粒8oxoG不会增加细胞凋亡或DNA双链断裂。

(一)在指示的治疗4天后，BJ或RPE FAP-TRF1细胞对膜联蛋白V（AV）、碘化丙啶（PI）或两者均呈阳性的百分比。染料、光或染料+光持续5分钟KBrO_三暴露时间为一小时。误差线表示三个独立实验的平均值±标准差。采用双向方差分析进行统计分析（*p<0.05，***p<0.0001）。(b)所示处理4天后，细胞膜联蛋白V（y轴）和丙碘（x轴）染色的代表性散点图。(c（c）)琼脂糖塞中细胞的PFGE和来自未处理（UT）或从5分钟染料+光处理恢复0或24小时后的BJ和RPE FAP-TRF1细胞的基因组DNA的SybrGreen染色。1或10 mM H治疗1小时₂O（运行）₂，或40 mM KBrO_三，用作阳性对照。

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p53 DNA损伤信号触发8oxoG诱导的衰老

如果损伤广泛或未解决，DDR信号会导致细胞周期停滞和生长抑制，从而导致衰老⁵.DL在几分钟内激活了ATM/Chk2通路（图。​（图3a），3a年)，这很引人注目，因为小的基础修改与ATM激活没有标准关联^45,46DL后用ATM抑制剂（ATMi）处理细胞，部分挽救了损伤诱导的集落形成和β-半乳糖表型（图。3b、c)证实ATM在端粒8oxoG诱导衰老中的作用。肿瘤抑制因子p53位于ATM/Chk2下游，并驱动众多DNA修复因子的转录、细胞周期检查点和衰老执行⁴⁷DL后不久，p53拮抗剂MDM2被降解，导致p53蛋白稳定并诱导p21-a p53靶蛋白（图。3d，e). p53和p21的激活通过减少RB磷酸化和抑制E2F转录因子来阻止S期因子的转录，这发生在端粒8oxoG诱导后（扩展数据图。​图5a）。5a级). 与ATM激活p53对端粒8oxoG的反应一致，在DL后用ATMi处理的细胞显示出减弱的p53诱导（扩展数据图。5b、c).

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图3

8oxoG诱导衰老需要p53 DNA损伤信号。

一，5分钟DL后指定恢复时间的磷酸化ATM（pATM）和磷酸化Chk2（pChk2）的免疫印迹。b从DL中恢复7天后，RPE FAP-TRF1菌落形成。细胞仅在恢复期间与ATMi KU60019或DMSO培养。这些数字与未经处理的二甲基亚砜对照品有关。c（c），DL后4天获得的β-gal阳性BJ FAP-TRF1细胞的百分比。细胞仅在恢复期间与ATMi KU60019或DMSO培养。d日，ATM和ATR激酶引起的典型DNA损伤诱导的p53激活示意图。使用Biorender.com创建。e（电子）、未经处理的BJ FAP-TRF1细胞的免疫印迹，或用DL处理并恢复指定时间。紫外线=20焦耳米^–2中波紫外线。ETP=1小时50μM ETP。（f）mRNASeq的热图来自FAP-TRF1表达的RPE、BJ和HeLa细胞，在不治疗（NT）24小时或5分钟DL后。图中显示的是顶部改变的基因，p53靶基因为红色。每列是一个独立的复制。克从5分钟DL恢复后4天，BJ（蓝色）或RPE（红色）FAP-TRF1细胞相对于相应未处理细胞的野生型、p16ko、p53ko或p16+p53双ko细胞计数。下面的免疫印迹显示FAP-TRF1、p53、p16的表达。小时从DL中恢复7天后，RPE FAP-TRF1菌落形成。我，治疗后4天获得的β-gal阳性BJ FAP-TRF1细胞的百分比。j个，5分钟DL后24小时观察到的EdU-阳性细胞百分比（浅红色或浅蓝色）。在每个实验中，每个条件下都会对200多个细胞进行评分。对于b,c（c）、和克–j个，误差条表示黑色圆圈表示的独立实验数量的平均值±标准差。统计显著性b,c（c）和小时–j个通过双向方差分析确定克单因素方差分析（ns，不显著*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001; ****P（P） < 0.0001).

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扩展数据图5

8oxoG诱导DDR信号转导和p53激活。

(一)染色、光照或DL处理5分钟后4天，对BJ FAP-TRF1细胞磷酸化RB进行免疫印迹(b、 c（c）)BJ的免疫印迹(b)和RPE(c（c）)5分钟DL后3小时FAP-TRF1细胞。用ATMi KU55933（10μM）或KU60019（1μM）或者DMSO对细胞进行预处理和后处理。箭头表示非特定带。(d、 e（电子）)RPE基因表达变化的火山图(d日)和BJ(e（电子）)染色+光照24小时后FAP-TRF1细胞。每一个点都是一个基因，红点是显著上调或下调的。HeLa细胞无明显变化。用DEseq2进行分析。(f、 克)RPE中的基因表达分析(（f）)和BJ(克)FAP-TRF1细胞染色+光照24小时后，作为染色体位置的函数。每个点都是一个10kb的存储单元，红线表示平均值。(小时)指示治疗4天后野生型和p53ko RPE FAP-TRF1细胞计数。误差线表示三个独立实验的平均值±标准差。(我)用10 mM（RPE）或2.5 mM（BJ）KBrO处理4天后野生型和p53ko RPE及BJ FAP-TRF1细胞的计数_三. (j、 k个)p16 mRNA的qPCR分析(CDK2NA公司)和p21 mRNA(CDK1NA）在BJ FAP-TRF1细胞中，治疗4天后。对于面板i-k公司，误差条表示黑色圆圈表示的独立实验数量的平均值±标准差。通过单因素方差分析进行统计分析（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。(我)5分钟DL或20μM胡桃素后3小时，通过IF定量BJ和RPE FAP-TRF1细胞中的p53蛋白信号强度。(米)通过IF分析小组处理的细胞中每个细胞的53BP1焦点(l）用IF检测p53信号强度来确定p53的表达（+）。对于面板我和米，误差条表示所示的平均值±标准差n个从两个独立的实验中分析的核数。单因素方差分析的统计分析(我)或双向方差分析(米)（ns=不显著，***p<0.001，***p<0.0001）。

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接下来，我们检测了DL后24小时端粒8oxoG的转录反应。急性端粒8oxoG诱导后，HeLa细胞无明显变化（图。​（图3f），第3页)与缺乏增长变化一致²⁸相反，RPE和BJ FAP-TRF1细胞在端粒8oxoG后显示出显著的基因表达变化，而端粒8oG并不靠近端粒，这表明这些变化不是导致端粒损伤的伪影（图。​（图3f第3页和扩展数据图。5天–克). Hallmark基因集富集分析揭示了与衰老一致的复制和细胞周期途径的下调（补充表2)和p53通路上调，与治疗后p53靶基因上调一致（图。​（图3f第3页)⁴⁸.

p53和p16都能促进衰老并降低RB磷酸化⁴⁹然而，p16ko并没有拯救DL诱导的生长减少，而p53ko单独或与p16联合使用可以（图。​（图3g）。3克). 与野生型细胞相比，p53ko细胞的生长随着光照时间的延长而减弱（扩展数据图。​图5h）。5小时). 此外，p53缺失抑制了处理细胞中菌落形成减少、SA-β-gal增加和EdU掺入减少（图。3小时–j)，并营救了KBrO_三诱导生长减少（扩展数据图。​图5i）。第5页). 与p16ko不能挽救衰老一致，DL没有增加p16mRNA，而10 mM KBrO_三did（扩展数据图。​图5j）。5焦耳). 我们还观察到p21 mRNA的上调，这在治疗后持续了4天（图。3e、f和扩展数据图。​图5k）。5公里). 治疗后24小时，p21仅在EdU阴性、无复制和/或衰老的野生型细胞中诱导，而在p53ko细胞中未诱导（扩展数据图。​图66).

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扩展数据图6

端粒8oxoG增加非复制细胞中p53依赖性p21的表达。

(a-c公司)治疗后23小时，野生型和p53ko RPE FAP-TRF1(b)和BJ FAP-TRF1(c（c）)细胞用EdU脉冲处理1小时，然后用显微镜分析p21和EdU染色。在每种情况下，细胞被分类为EdU+或–群体，并绘制核p21信号强度图。面板中显示了典型的IF图像一，比例尺=10μm。数字n个显示了两个独立实验中针对每个条件分析的细胞数。Tukey方框图显示中位数（bar），平均数（+），25^第个至75^第个四分位范围（IQR），晶须显示25^第个或7^第个百分位±1.5x IQR。通过双向方差分析分析数据（**p<0.01，****p<0.0001）。

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考虑到p53的需求，我们推断，端粒8oxoG触发DDR的细胞更有可能激活p53，从而衰老。与此一致，与p53阴性细胞相比，DL显著增加了p53阳性细胞中的DDR因子53BP1（扩展数据图。5升，米). 作为对照，MDM2拮抗剂Nutlin诱导了更多的p53阳性细胞，但没有诱导53BP1。这些数据表明，经历了更大的端粒8oxoG诱导的DDR的细胞也显示出p53激活。总之，这些结果表明，端粒8oxoG足以触发DDR并激活p53和p21，从而导致早衰。

8oxoG促进局部端粒DDR

靶向8oxoG形成后观察到的显著DDR和p53激活可能来自端粒的局部DDR激活。我们检测了DL后24小时间期细胞中γH2AX和53BP1对端粒的补充。治疗增加了具有一个或多个DDR阳性端粒的细胞的百分比，并且显示端粒与两个DDR标记物共定位的细胞显著增加（约十倍）（图。4a–c类). 将这些数据装箱显示，显示一到三个或四个或更多DDR+端粒的细胞显著增加（扩展数据图。7a、b). 先前的研究表明，4到5个γH2AX+端粒预测人类成纤维细胞的复制性衰老⁵⁰将四个或四个以上端粒对γH2AX或53BP1阳性的细胞百分比相加，DL处理的细胞为20–30%，而未处理的细胞仅为2%（扩展数据图。​图7c）。第7页c). DL后的端粒DDR与2.5 mM KBrO后的DDR相当_三即使这种氧化剂会损坏整个细胞（图。4b、c). 此外，这种剂量的KBrO_三与5分钟DL（图。1克，小时和扩展数据图。2克，小时). 虽然4天后，含有DDR+端粒的细胞百分比下降，但这两种治疗方法的细胞百分比仍高于背景值，表明端粒DDR持续存在（扩展数据图。第7天，第5天). 这些观察结果证实了端粒是氧化损伤的热点，并表明端粒在8oxoG处理后容易发生急性和持续的DDR激活。

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图4

端粒8oxoG促进局部DDR。

一代表性IF图像显示，未经治疗24小时或5分钟DL后，BJ FAP-TRF1细胞的端粒（绿色）经telo-FISH进行γH2AX（红色）和53BP1（紫色）染色。Colocalizations面板显示53BP1和/或γH2AX与端粒之间NIS-Elements定义的交叉点。比例尺，10μm。b,c（c），BJ显示与γH2AX、53BP1或两者共定位的端粒病灶的细胞百分比的量化(b)和RPE(c（c）)5分钟DL或2.5 mM KBrO后24小时FAP-TRF1细胞_三治疗。误差条表示三个独立实验的平均值±标准差，其中每个实验的每个条件分析了50多个核。通过双向方差分析确定统计显著性（ns，不显著*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001).

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扩展数据图7

在间期和中期染色体中可见氧化损伤诱导的端粒DDR。

(a-b公司)BJ显示0、1–3或≥4个端粒病灶与γH2AX、53BP1或两者共存的细胞百分比(一)和RPE(b)FAP-TRF1细胞在没有处理后24小时或DL 5分钟。误差条表示由黑圈表示的独立实验数量的平均值±标准差，其中每个实验在每个条件下分析了50多个核。采用双向方差分析进行统计分析（*p<0.05，***p<0.001）。(c（c）)图中每个实验中端粒≥4γH2AX或53BP1阳性的细胞百分比。​图44显示并汇总。数据为三个独立实验的平均值，误差线为±标准偏差。(d、 e（电子）)BJ显示端粒病灶与γH2AX、53BP1或两者共存的细胞百分比(d日)和RPE(e（电子）)5分钟染料+光照（DL 5'）或2.5 mM KBrO后4天FAP-TRF1细胞_三治疗。误差条表示由黑圈表示的独立实验数量的平均值±标准差，其中每个实验在每个条件下分析了50多个核。采用双向方差分析进行统计分析（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.0001）。(（f）)5分钟染色+γH2AX（红色）、端粒PNA（绿色）和DNA DAPI（蓝色）光染24小时后，RPE FAP-TRF1细胞的meta-TIF染色体扩散的代表性图像。比例尺=10μm。(克)缺乏端粒染色（Telo-）或通过端粒FISH与端粒PNA（Telo+）共定位的γH2AX阳性染色单体末端的meta-TIF分析定量，如图所示(（f）). 误差条表示平均值±标准偏差n个 = 每种情况分析33个中期。(小时)通过IF和telo-FISH对位于染色单体末端（端粒）和内部（非端粒）位置的γH2AX病灶分布的meta-TIF分析进行定量，如面板所示(（f）).

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接下来，我们通过中期染色体γH2AX染色（meta-TIF）证实了端粒DDR。治疗后，γH2AX和端粒PNA（肽核酸）染色阳性的平均染色单体数为4.4个/中期，γH2AX/中期染色阳性，端粒PNA-染色阴性的平均染色单体数为0.9个/中期（扩展数据图。7f，克). 这表明大多数8oxoG诱导的DDR不是由于端粒丢失。我们还分析了γH2AX焦点在染色单体末端与内部位置的分布，因为在间期细胞中无法检测到染色体末端缺失端粒⁵¹虽然60%的γH2AX病灶位于未处理细胞的染色单体末端，与端粒作为损伤热点相一致，但在DL后这一比例增加到83%（扩展数据图。​图7h7小时).

8oxoG干扰端粒复制而不会导致缩短

接下来，我们研究了8oxoG诱导端粒DDR活化的机制。端粒8oxoG引发衰老4天，这一时间段通常不足以观察到端粒显著缩短，尤其是在端粒酶分泌细胞中（通常需要数周）。对端粒限制性片段的分析显示，DL后4天，端粒的整体长度没有变化（扩展数据图。​图8a）。第8页a). 因为一些极短的端粒可以促进衰老⁵²，我们使用端粒最短长度分析（TeSLA）来可视化最短的单个端粒。虽然我们检测到单个端粒比大量人群中的端粒短得多，但DL并没有增加端粒短或截短的百分比（扩展数据图。​图8b）。8亿). 因此，端粒缩短不需要先于氧化应激诱导的衰老。

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扩展数据图8

急性端粒8oxoG损伤不会导致端粒缩短或保护蛋白丢失。

(一)从BJ和RPE FAP-TRF1中获得的端粒限制性片段长度分析的Southern blot，在未经处理（UT）或单独染料（D）、单独光照（L）或染料+光照（DL）混合后4天恢复。(b)从BJ和RPE FAP-TRF1中获得的TeSLA，在未经处理（UT）或5分钟染色+光照后恢复4天。每个泳道都是来自相同基因组DNA库的独立PCR。最短的20个端粒的平均长度^第个下面显示了两个独立实验得出的端粒长度小于1.6kb的百分数和百分比。(c（c）)染色+光照5分钟后24小时，p53ko BJ（蓝色）和RPE（红色）FAP-TRF1细胞的双着丝粒染色体的量化定义为两个着丝粒焦点。(d日)染色+光照5分钟后4天，用telo-FISH对BJ（蓝色）和RPE（红色）FAP-TRF1细胞的端粒病灶进行定量。对于面板c-d公司，误差条表示所示的平均值±标准差n个中期数(c（c）)或焦点(d日)分析。通过单因素方差分析进行统计分析，所有p值均无显著性。(e（电子）)未经处理（UT）或10分钟染料+光照（DL 10’）后，对野生型RPE FAP-TRF1细胞中FAP-mCER-TRF1每个端粒病灶的mCER信号强度进行量化。方框图显示中位数和25^第个至75^第个四分位范围，胡须显示1^标准至99^第个百分位数。通过单因素方差分析进行统计分析，所有p值均无显著性。(f、 克)染色+光照5分钟后立即用IF和telo-FISH分析TRF2与端粒的共定位。通过γH2AX共定位鉴定DDR+端粒。BJ中γH2AX的TRF2信号强度在每个端粒病灶中被量化–或+(（f）)和RPE(克)FAP-TRF1细胞。Tukey方框图显示中位数（bar），平均数（+），25^第个至75^第个四分位范围（IQR），晶须显示25^第个或7^第个百分位±1.5x IQR。统计分析由Kruskal-Wallis完成（ns=无显著性，***p<0.001，***p<0.0001）。

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接下来，我们通过端粒末端FISH检测p53ko细胞中期染色体上的端粒完整性，以确保受损细胞能够进行有丝分裂。染色单体末端评分为显示一个端粒病灶（正常）、多个病灶（易碎）或无染色（无信号末端）（图。5a、b). DL在代表端粒丢失或检测不到的信号游离端或代表染色体融合的双着丝粒染色体中几乎没有诱导变化（图。5c、d和扩展数据图。​图8c）。8厘米). 与端粒丢失的缺乏一致，我们也观察到野生型间期细胞在DL后4天端粒病灶没有减少（扩展数据图。​图8d）。8天). 然而，DL在治疗24小时后显著增加了脆性端粒（图。5e、f).

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图5

8oxoG直接干扰端粒复制。

一,b，未经处理24小时后BJ FAP-TRF1 p53ko细胞中期染色体telo-FISH染色的代表性图像(一)或5分钟DLb，对端粒无信号末端（黄色箭头）和易碎端粒（绿色箭头）的图像进行评分。绿色病灶是端粒，粉红色病灶是CENPB着丝粒。比例尺，10μm。c（c）,d日，BJ每中期端粒无信号染色单体末端的数量(c（c）)和RPE(d日)FAP-TRF1细胞。e（电子）,（f），BJ每中期脆性端粒的数量(e（电子）)和RPE(（f）)FAP-TRF1细胞。对于c–f，误差条表示平均值±标准偏差n个 = BJ和n个 = RPE为61（UT）和63（DL 5 min），中期分析来自三个独立实验，并归一化为染色体数。双尾Mann–Whitney的统计分析（ns，不显著**P（P） < 0.01; ****P（P） < 0.0001).克，p53ko RPE FAP-TRF1细胞（Top）的MiDAS实验示意图，以及Telo PNA（绿色）和EdU染色（红色）的代表性中期扩散。箭头指向端粒MiDAS。比例尺，10μm。小时，单个染色单体（BIR）和两个染色单体的EdU事件示意图。DL处理的RPE FAP-TRF1细胞的代表性图像如下所示。我端粒MiDAS在单个染色单体（左）或两个染色单体上发生。对端粒PNA染色单体末端染色阳性（Telo+）或阴性（Telo-）的事件进行评分。误差线表示两个独立实验中51（UT）和61（DL 10 min）中期的平均值±标准差。单因素方差分析的统计分析（ns，不显著****P（P） < 0.0001).

源数据

由于庇护蛋白的破坏可以激活ATM并诱导衰老^53,54和8oxoG可以在体外破坏TRF1和TRF2的结合⁵⁵，我们检测了DL是否减少端粒处的保护蛋白。TRF2或TRF1缺失分别通过引起脱保护和融合或端粒脆性产生DDR+端粒⁵⁴TRF1缺失也会诱导生长停滞和SA-β-gal，这是p53抑制所挽救的^54,56虽然TRF1缺失不是生理性的，但这些表型与端粒8oxoG形成观察到的表型惊人地相似。然而，DL未能诱导端粒处FAP-mCER-TRF1的丢失，mCerulean病灶数量和信号强度没有变化就证明了这一点（扩展数据图。​图1d1天和​和8e）。第8页). TRF2染色显示，一般情况下，或在γH2AX阳性端粒处，TRF2没有丢失，与未融合一致（扩展数据图。8c、f、g). 因此，端粒8oxoG可诱导过早衰老，而不会导致端粒缩短、丢失或通过遮蔽素破坏而失去保护，而是诱导端粒脆性。

因为脆弱的端粒与复制应激有关^54,56,57，我们还测试了有丝分裂DNA合成（MiDAS），这可能发生在难以复制的区域，以完成DNA合成，并在有丝分裂期间通过EdU掺入检测到⁵⁸用DL处理RPE FAP-TRF1细胞，回收后用CDK1抑制剂R0-3306处理以在G2中同步，然后释放到含有EdU和秋水仙碱的培养基中以观察中期DNA合成。DL在79%的处理细胞中诱导了至少一个端粒MiDAS事件，而在未处理细胞中仅39%（图。​（图5g）。5克). 端粒MiDAS主要通过单个染色单体上的保守DNA合成发生，与断裂诱导复制（BIR）一致，而同源重组（HR）需要在两个染色单体上进行半保守合成（图。​（图5h5小时)^59,60未经处理的细胞每中期平均显示0.2–0.3个端粒MiDAS事件（单染色单体或双染色单体；中位数0），而经DL处理的细胞显示单染色单体端粒MiDSA显著增加（平均值和中位数为每中期一个）（图。​（图5i）。第5页). 这些单染色单体事件几乎完全染色为端粒PNA阳性，与BIR一致。这些数据表明，急性端粒8oxoG形成触发有丝分裂DNA合成，表明病变阻止了端粒在S期复制的完成。

细胞治疗

对于DL治疗，将细胞以适当的密度放置一夜，以进行实验。第二天，将细胞换成Optimem（Gibco）并在37°C下培养15分钟，然后再添加100 nM MG2I 15分钟。然后将细胞放置在灯箱中，并暴露在100 mW cm的高强度660 nM LED灯下^–2持续5分钟（除非另有说明）。溴酸钾_三在Optimem中以指定的浓度添加ETP 1小时。

增长分析

在细胞计数实验中，将细胞以低密度放置在6孔或6厘米的平板上过夜。按照指示处理细胞，并将其返回培养箱，并恢复指定的时间（通常为4天）。细胞从平板上分离出来，重新悬浮并在贝克曼-库尔特计数器上计数。每个实验有两到三个技术重复，均取平均值。

衰老相关β-半乳糖测定

我们根据制造商的说明（细胞信号）检测了β-gal活性。简言之，用PBS洗涤细胞，然后在室温下固定10分钟。用PBS冲洗两次后，用不含CO的X-gal染色溶液在37°C下孵育细胞过夜₂图像由尼康亮场显微镜和DS-Fi3相机采集。图像由NIS-Elements（尼康）评分。每个实验中，每个条件下至少计数300–800个细胞。

菌落形成测定

将RPE FAP-TRF1细胞放置在6cm的板中过夜。第二天用DL处理细胞，然后立即分离、计数并在六孔板中电镀三次。7–8天后，菌落固定在100%甲醇的冰上，用结晶紫溶液染色，然后手动计数。

免疫荧光和荧光原位杂交

细胞接种在盖玻片上，并按指示处理。处理和/或恢复后，用PBS清洗细胞，并用4%甲醛在室温下固定。如果在固定前提取细胞，则用冰镇CSK缓冲液（100 mM NaCl，3 mM MgCl）在冰上处理细胞₂、300 mM葡萄糖、10 mM管道pH 6.8、0.5%Triton X-100和蛋白酶抑制剂片（罗氏））。用PBS中的1%BSA冲洗固定细胞，并用0.2%PBS-Triton冲洗三次，然后用10%的正常山羊血清、1%BSA和0.1%Triton X封闭。用指示的一级抗体在4°C下培养细胞过夜。第二天，用PBS-T冲洗细胞三次，然后用二级抗体孵育，再用PBS-T再次冲洗三次。如果进行荧光原位杂交（FISH），则用4%甲醛重新固定细胞，用1%牛血清在PBS中冲洗，然后用70%、90%和100%乙醇脱水5次将端粒PNA探针稀释至1:100（PNABio），在70%甲酰胺、10 mM Tris-HCl pH 7.5、1×马来酸缓冲液、1×MgCl中制备₂缓冲并煮沸5分钟后再放回冰中。然后将盖玻片在室温下的潮湿室中杂交2小时或在4°C下过夜。细胞用70%甲酰胺和10 mM Tris-HCl（pH 7.5）洗涤两次，用PBS-T洗涤三次，然后用水冲洗，然后用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色和贴装。使用尼康Ti倒置荧光显微镜进行图像采集。使用NIS-Elements Advance Research软件算法捕获0.2μm（×60物镜）或0.5μm（x 20物镜）厚度的Z堆叠，并对图像进行去卷积。对于MN分析，每个实验至少分析30 MN。

为了检测EdU掺入，根据制造商的说明（Thermo）在二次抗体洗涤后进行Click化学。

实时细胞成像

用H2B-mCherry（pCSII-EF）感染BJ FAP-TRF1细胞，然后在MoFlo Astrios上筛选mCherry-阳性细胞。为了成像，细胞被镀在聚乙烯上-d日-赖氨酸（0.5 mg ml^–1)处理过的玻璃基板（Cellvis P06-1.5H-N）。治疗后，在尼康TiE上每4分钟用37°C的加湿室在×20条件下对细胞进行mCherry信号和DIC成像。每个孔被成像16次（4×4），并使用图像配准将图像拼接在一起。

有丝分裂事件采用人工评分。跟踪每个分裂细胞的延时；如果MN在有丝分裂后出现并持续超过两帧，则得分为MN+。

中期价差

用0.05μg ml培养细胞制备染色体扩散^–1用胰蛋白酶收割前，先用秋水仙素浸泡2小时。将细胞与75 mM KCl在37°C下孵育8分钟，并在甲醇和冰醋酸（3:1）中固定。细胞落在清洗过的载玻片上并干燥过夜，然后在4%甲醛中固定。在37°C下用RNaseA和胃蛋白酶处理载玻片，然后脱水。如上所述进行FISH，除端粒探针外，还包括一个CENPB（PNABio）探针。数量被标准化为每个细胞46条染色体。

琼脂糖塞中细胞的脉冲场凝胶电泳

如前所述，检测到双标记DNA断裂（DSB）。简单地说，细胞通过胰蛋白酶化收集，用PBS洗涤并计数。共有500000个细胞被嵌入0.75%的干净切割琼脂糖中，并在50°C下用蛋白酶K消化过夜之前凝固。将塞子清洗四次，持续1小时，然后装入1%琼脂糖凝胶。用0.5×TBE在14°C下以两块程序运行凝胶；块1：12小时，初始0.1秒，最终30秒，6伏厘米^–1; 块2:12小时0.1秒初始，5秒最终，3.8 V cm^–1然后在50°C下干燥凝胶2小时，然后用SYBR Green染色并在台风上成像。

XRCC1招募与分析

将RPE FAP-TRF1细胞接种在盖玻片上，使其在第二天融合约70%。然后使用不含抗生素的培养基在Optimem（Gibco）中转染pEYFP-XRCC1（1µg）和6µl Fugene 6（Promega）。24小时后，用DL处理细胞10分钟，然后立即进行CSK提取，然后固定。清洗后，在没有DAPI的情况下安装细胞。仅对YFP阳性细胞进行成像，并使用CFP通道标记端粒（FAP-mCER-TRF1）。

端粒DNA中8oxoG的检测

处理后，立即将细胞刮到冰上，用抗氧化剂100 mM的丁基羟基甲苯（Sigma；DMSO溶剂）和甲磺酸去铁胺（Sigma:水溶剂）分离DNA，如前所述²⁸用FPG处理DNA（NEB，1.3 Uμg DNA^–1)然后用南非兰特我和Hinf公司我过夜了。如前所述，在进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）和Southern blotting之前，在37°C下用2U S1核酸酶处理15分钟，将FPG敏感位点转化为DSB²⁸.

图像采集和分析

所有免疫荧光（IF）图像均在配备Orca Fusion cMOS相机或CoolSNAP HQ2 CCD的Nikon Ti倒置荧光显微镜上采集。为每个图像获取Z堆栈，并使用盲迭代方法和NIS-Elements AR软件进行去卷积。

对于共定位，将去卷积图像转换为Max-IP并转换为新文档。NIS AR中的物体计数功能用于设置在整个实验过程中保持的焦点阈值。二元函数用于确定确定感兴趣区域（ROI）（DAPI染色核）中两个或三个通道的交点。对于全核信号强度，ROI上使用了自动测量功能。

蛋白质印迹

用胰蛋白酶从平板中收集细胞，洗涤，然后用补充有PMSF（1nM）、1×罗氏蛋白酶和磷酸酶抑制剂以及苯甲酸酶（Sigma目录号E8263；1:500）的RIPA缓冲液（Santa Cruz）在冰上裂解15分钟，然后在37°C下孵育10分钟，然后在14000下离心克在4°C下保持15分钟。使用BCA分析（Pierce）测定蛋白质浓度，在转移到聚偏二氟乙烯膜（GE Healthcare）之前，在4–12%（或OGG1ko blot的12%）双三凝胶（Thermo）上电泳10–30μg蛋白质。在5%的牛奶中封闭膜，并用一级和二级辣根过氧化物酶抗体进行印迹。通过增强化学发光检测和X射线胶片检测信号。

逆转录qPCR

使用Qiagen RNeasy Plus Mini试剂盒从细胞中提取RNA；使用高容量RNA-to-cDNA试剂盒（Thermo）将500-1000 ng RNA转化为cDNA。cDNA（50 ng）采用1×Taqman探针和Taqman通用PCR试剂盒（Thermo）进行实时qPCR。使用增量-增量-Ct方法分析数据。

流式细胞术

为了分析细胞凋亡，按照指示处理细胞，并允许其恢复4天。收集漂浮细胞，然后用胰蛋白酶收集附着细胞并结合。离心和洗涤后，用Alexa Flour 488 annexin V和1µg ml培养细胞^–1PI在1×膜联蛋白结合缓冲液中黑暗放置15分钟（Thermo）。在额外的结合缓冲液中重新悬浮后，使用FL1和FL3在Accuri C6（Beckman）上分析细胞。

对于细胞周期分析，在处理23小时后，用20µM EdU对细胞进行脉冲处理，并再培养一小时（Thermo）。用胰蛋白酶收集细胞，用PBS中的1%BSA洗涤，然后用Click-IT固定剂D固定。用PBS中的1%BSA洗涤后，用1×组分E透化细胞15分钟，然后用Alexa Flour 488叠氮化物进行Click化学30分钟用1×组分E清洗细胞，然后在500µl FxCycle PI/RNase（Thermo）中再次悬浮15分钟，然后在Accuri C6上进行分析。对细胞与碎片和单线进行标准门控。

海马分析

OCR是使用SeahorseXF96细胞外通量分析仪（Seahorse Bioscience）测量的，基本上如前所述⁸¹处理和恢复指定时间后，将细胞接种在XF96细胞培养板中，接种量为8×10⁴在Cell-Tak细胞和组织粘合剂存在的情况下，每孔的细胞数。然后清洗细胞，用无碳酸氢盐培养基替换生长培养基。此后，细胞在37°C培养箱中无一氧化碳培养60分钟₂然后进行同步OCR测量。

分泌蛋白分析

按照指示处理细胞，并恢复7天。收集培养基并通过离心法将碎片颗粒化10分钟。培养基在−80°C下保存，直至准备好进行分析。使用多重ELISA（Luminex）评估指示分析物的浓度。每个样品分析两次，并分析空白培养基样品的背景水平。在沿标准曲线测定浓度后，根据收获时存在的细胞数量调整值。

批量RNA-seq

使用Qiagen RNeasy Mini Plus试剂盒制备RNA；将1μg总RNA送往Genewiz进行文库制备和测序。RNA完整性数>9的RNA在cDNA合成前被polyA选择并片段化。连接适配器，PCR富集，然后在HiSeq 2×150上以配对模式测序。每个样本被测序到至少3000万个读数。

使用Salmon（v.0.7.2）对HG19 refseq转录本注释对mRNAseq数据中基因表达的三次测量进行量化⁸²通过对未经治疗和治疗（“DL”）的转录亚型和基因计数矩阵进行求和，获得独特的基因，并用DEseq2进行分析，以获得折叠变化和P（P）每个基因的价值得分⁸³差异表达基因定义为＞0.5log₂FC，–日志₁₀(P（P）) > 10⁴在所有三个细胞系中都是可量化的（“expressed”，>10计数）。为了确定端粒附近的染色体区域（可能受到FAP系统的氧化应激）中的基因表达是否发生改变，我们将基因按其起始位点与染色体末端的距离进行组合，并对与染色体末端给定距离的基因进行平均。我们使用FGSEA和Hallmark基因集进行基因集富集⁸⁴.

端粒限制性片段分析

如前所述进行端粒限制片段（TRF）分析²⁸简而言之，根据制造商的说明，使用Qiagen Tip-20或100从细胞中提取基因组DNA。DNA被消化Hinf公司我和南非兰特我在PFGE前过夜。干燥凝胶后，用SYBR Green（Thermo）检测分子量阶梯，然后用³²如前所述进行P标记端粒探针。

端粒最短长度测定

TeSLA分析如前所述进行，但有一些修改⁸⁵基因组DNA（50 ng）与TeSLA-T寡核苷酸连接，然后用Cvi公司全部创建5’AT悬挑。DNA被进一步消化英国足协我，Nde公司我和Mse女士I（NEB）生成5′TA悬挑。脱磷酸后，连接AT和TA适配器，然后用AP和TeSLA-TP引物进行PCR（每个样品四个）。PCR产物在电泳前使用Genejet PCR纯化试剂盒进行清洗。如前所述，使用凝胶内杂交干燥凝胶后检测到端粒片段²⁸.

中期IF

对于中期IF（Meta-TIF），通过胰蛋白酶化收集细胞，用PBS洗涤，计数并离心。然后，将200000个细胞在37°C的0.2%氯化钾和柠檬酸钠中膨胀5分钟，并将细胞离心到载玻片上（10分钟，2000转/分，中等加速度）。细胞在PBS中固定4%的甲醛，然后按照上述方法进行IF/FISH处理。

有丝分裂DNA合成的检测

处理后16小时，将细胞与7μM Cdk1抑制剂RO3306（Millipore）孵育24小时。用PBS洗涤细胞，然后将其释放到含有20µM EdU和colcemid的培养基中1小时通过有丝分裂振荡采集前h。如上所述制备中期扩散，并在FISH染色后使用Click-iT EdU Alexa Fluor 594成像试剂盒（ThermoFisher）进行EdU染色。

抗体

GFP（Abcam目录号ab6556）、TRF1（Abcam-目录号ab10579）、GAPDH（Santa Cruz目录号sc-47724）、OGG1（Abcam-目录号ab124741）、Actin-Cell-Signaling目录号3700）、Lamin B1 Abcam目录号ab16048）、Lamin-C（Cell-Sgnaling目录编号4777）、γH2AX（Santa Cruz目录编号sc-517348）、53BP1（Novous目录号NB100-304）、，TRF2（Novous目录编号NB110-57130）、MDM2（Cell Signaling目录编号86934）、p53（Santa Cruz目录编号sc-126）、p21（Cell信令目录编号2947）、p16（Proteintech目录编号10883-1-AP）、pRB S807/811（Cell-Signaling目录号8516）、pCHK2 T68（Cell信号目录号2197，pATM S 1981（Abcam目录号ab81292），CHK1（细胞信号目录号2360），H3K27me3（细胞信号目录号9733），H3K27Ac（细胞信号目录号8173），LSD1（细胞信号目录号2184），cGAS（细胞信号目录号66546），p62（细胞信号目录号39749）。

化学试剂

溴酸钾KBrO3（Sigma目录号309087；CAS:7758-01-2）、叠氮化钠NaN3（Fisher Chemical目录号S227I；CAS:26628-22-8）、ATMi KU60019（Selleckchem目录号S1570）、Cdk1抑制剂IV、RO-3306（Millipore目录号217699）、ETP（Cell Signaling目录号2200；CAS 33419-42-0）、阿菲地考林（Santa Cruz目录号sc-201535；CAS 38966-21-1）。

重组DNA

pLentiCRISPR v2 gRNA，OGG1靶向序列（外显子4:GCTACGAGTCATATG），pLentiCRISPR v 2 gRNA p53靶向序列。pEYFP-XRCC1质粒（来自M.Otterlei（NTNU，挪威））。

统计和再现性

生物和技术复制品的数量在图例和方法除RNA-seq数据外，所有统计分析均在Graphpad Prism 9中进行。没有使用统计方法预先确定样本量。在图的源数据中，罕见的异常值显示为蓝色，由Graphpad确定。6b、c和扩展数据图。​图2a2a个被省略。在实验和结果评估期间，研究人员并没有盲目地进行分配。

试剂和资源共享联系人

有关试剂的更多信息和要求，请直接联系首席联系人P.L.O.，并由其完成(plo4@pitt.edu).

这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）F32AG067710-01和K99ES033771（给R.P.B.）、R35ES030396和R01CA207342（给P.L.O.）以及R01EB017268（给M.P.B.）和R35ES031638（给B.V.H.）的资助。这项工作得到了格伦老化生物机制研究奖（给P.L.O.）的支持。该项目还得到了UPMC希尔曼癌症中心创新癌症研究博士后奖学金（R.P.B.）的支持。我们感谢R.O'Sullivan、E.Foukerel、A.Gurkar和K.Aird仔细阅读手稿。我们还感谢S.Sanford对艺术作品的帮助。该项目使用了UPMC希尔曼癌症中心细胞测定设施和癌症蛋白质组设施的Luminex核心实验室，部分获得了P30CA047904奖项的支持。