多形性胶质母细胞瘤冠状病毒受体的综合致癌特征
,1,2 ,1,2 ,三 ,4 ,4 ,4 ,4 ,1,2和
4,* 陈安静（Anjing Chen）
1山东大学齐鲁医院神经外科、齐鲁医学院医学院、山东大学脑与脑启发科学研究所
2山东省脑功能重塑重点实验室和济南微生态生物医学山东实验室，济南，中国
赵文国
1齐鲁医院神经外科、奇洛医学院医学院、山东大学脑与脑启发科学研究所，中国济南
2山东省脑功能重塑重点实验室和济南微生态生物医学山东实验室，济南，中国
李小龙
三麻省理工学院（MIT）麻省总医院拉贡研究所（MGH）和美国马萨诸塞州剑桥哈佛大学
孙光裕
4山东大学齐鲁医学院医学集成与实践中心诊断系，济南，中国
马兆银
4山东大学齐鲁医学院医学集成与实践中心诊断系，济南，中国
凌玉鹏
4山东大学齐鲁医学院医学集成与实践中心诊断系，济南，中国
中阳市
4山东大学齐鲁医学院医学集成与实践中心诊断系，济南，中国
李新刚
1山东大学齐鲁医院神经外科、齐鲁医学院医学院、山东大学脑与脑启发科学研究所
2山东省脑功能重塑重点实验室和济南微生态生物医学山东实验室，济南，中国
杰燕
4山东大学齐鲁医学院医学集成与实践中心诊断系，济南，中国
1山东大学齐鲁医院神经外科、齐鲁医学院医学院、山东大学脑与脑启发科学研究所
2山东省脑功能重塑重点实验室和济南微生态生物医学山东实验室，济南，中国
三麻省理工学院（MIT）麻省总医院拉贡研究所（MGH）和美国马萨诸塞州剑桥哈佛大学
4山东大学齐鲁医学院医学集成与实践中心诊断系，济南，中国
通讯作者。 编辑：William J.Liu，中国国家病毒病预防控制研究所
审核：新西兰梅西大学吴宝军；Na Wang，美国约翰霍普金斯大学；Raja Gopal Reddy Mooli，美国匹兹堡大学
这篇文章被提交给《免疫学前沿》杂志的疫苗和分子治疗部分
2021年12月21日收到；2022年3月9日验收。
这是一篇根据知识共享署名许可证（CC BY）条款发布的开放存取文章。允许在其他论坛上使用、分发或复制，但前提是原创作者和版权所有人得到了认可，并且根据公认的学术惯例引用了本期刊中的原始出版物。不允许使用、分发或复制不符合这些条款的内容。
- 补充资料
补充图1：根据UALCAN程序，GBM患者不同亚群中冠状病毒受体的表达模式。显示受体相对表达的方框图（A）年龄：21～40岁（n=12），41～60岁（n=67），61～80岁（n/69），81～100岁（n/7）；b性别：男性（n=101）和女性（n=54）；和（C）种族：白种人（n=139）、非洲裔美国人（n=10）和亚洲人（n=5）。GBM，胶质母细胞瘤*，P（P）<0.05; **,P（P）<0.01; ***,P（P）<0.001.
GUID:425AA9A5-B5FC-48DC-B059-7501309C7BA3
补充图2：CGGA数据集和多变量Cox分析中的Kaplan-Meier生存曲线。（A）Kaplan–Meier生存曲线。红色表示高表达，蓝色表示低表达。（B）CGGA数据库中冠状病毒受体表达和一些临床病理变量之间的多变量Cox分析的森林图（n=216）。
GUID:7B5253B2-3395-432A-8553-BD066240A7EA
补充图3：通过ZDOCK算法将SARS-CoV-2 RBD（从6M0J分离）与ANPEP（4FYQ）和ENPEP（4 KX7）对接。（A）结合自由能（kcal-mol-1），结合亲和力Kd（千克）与SARS-CoV-2 RBD复合体中ANPEP和ENPEP的Top 1预测的埋藏界面面积。（B）SARS-CoV-2 RBD与ENPEP对接模型。RBD表面的结合位点用粉红色表示，ENPEP表面的结合部位用绿色表示（左）。两种蛋白质氨基酸界面上的氢键用绿线表示（右）。
GUID:E52EB9FF-5FD2-4F23-BA78-3D8FC63B0E21
- 数据可用性声明
根据合理要求，可从相应作者处获得支持本研究结果的数据。
摘要
SARS-CoV-2感染引起的新型冠状病毒疫情使卫生系统，特别是老年癌症患者，承受着巨大的压力。多形性胶质母细胞瘤（GBM）是一种恶性脑肿瘤，在老年人中发病率越来越高，因此GBM患者是新冠肺炎疫情期间的弱势人群。累积的研究表明SARS-CoV-2可能直接侵入大脑通过冠状病毒受体。然而，人们对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型感染在GBM临床发展中的作用知之甚少。在这里，我们利用生物信息学和实验方法探讨了六种冠状病毒受体（ACE2、DPP4、ANPEP、AXL、TMPRSS2和ENPEP）在GBM中的致癌作用。我们发现，与正常脑组织相比，GBM中ANPEP和ENPEP的mRNA和蛋白质水平均显著增加。Kaplan-Meier生存曲线和Cox回归分析表明ANPEP公司和欧洲政治公众人物协会与不良预后和生存率相关。此外，所有受体与单核细胞的免疫浸润水平呈正相关。此外，我们在新冠肺炎和冠状病毒受体（GBM中的相关基因）之间鉴定了245个基因，并对其蛋白-蛋白质相互作用网络、功能信号通路和分子过程进行了深入分析。我们的工作首次探索了冠状病毒受体与GBM的相关性，并建议ANPEP和ENPEP作为GBM的潜在治疗靶点，而不考虑新冠肺炎。
关键词：SARS-CoV-2、GBM、ACE2、ANPEP、ENPEP
介绍
由人类严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒肺炎是当今最严重的肺炎，正威胁着全球公共卫生和经济(1,2). 截至2021年11月11日，在188个国家和地区已确认251584730例新冠肺炎病例和5075809例死亡(https://coronavirus.jhu.edu/map.html).
新冠肺炎以发热、干咳、腹泻和头痛为主要症状，在全球范围内发病率和死亡率都很高(三). 虽然肺部是感染的主要器官，但目前的研究表明，SARS-CoV-2可能直接侵入中枢神经系统（CNS）区域，导致神经症状，如头晕、嗅觉、味觉、肌肉协调丧失或中断、自主呼吸控制、嗜睡、抑郁和焦虑(4–9). 214例住院新型冠状病毒肺炎患者的病例系列显示，78例（38.4%）和更常见（45.5%）的严重感染患者有神经系统表现，即急性脑血管事件和意识障碍(5). 新冠肺炎患者尸检结果显示脑组织充血水肿，脑脊液标本中检测到SARS-CoV-2 RNA(10). 此外，一项人群水平的观察研究报告称，老年人和癌症患者对病毒感染的易感性增加(11). 全国新冠肺炎分析表明，20%的新冠肺炎死亡病例患有活动性癌症(12). 对3019名感染新型冠状病毒肺炎的癌症患者的15项研究进行的荟萃分析表明，总死亡率为22.4%(13). 多形性胶质母细胞瘤（GBM）是一种生长迅速、侵袭性脑肿瘤，在老年人群中发病率增加(14). 因此，GBM可被视为新冠肺炎大流行期间最易感染的疾病(15). 特别是，法国41名受SARS-CoV-2感染的弥漫性胶质瘤患者的队列显示，16名患者（39%）在中位延迟13天后死亡，这高于一般人群和非癌症人群，尽管研究人员声称死亡率被高估了，但由于多种限制，应谨慎对待(16).
传统上，有效的病毒进入是SARS-CoV-2感染的第一道防线，并决定了感染器官的范围。众所周知，冠状病毒进入靶组织需要：1）冠状病毒棘突（S）蛋白与细胞受体的结合，这有助于病毒粘附到细胞表面；和2）通过细胞蛋白酶启动S蛋白，进行S蛋白裂解以融合细胞膜(17–19). 越来越多的研究提供了大量证据，证明以下冠状病毒受体在冠状病毒细胞进入中发挥重要作用：血管紧张素转换酶2（ACE2）(20–24)是一种I型跨膜蛋白，是SARS-CoV-2的关键决定因子细胞受体(20–25); TMPRSS2被鉴定为II型跨膜丝氨酸蛋白酶，用于启动SARS-CoV-2的S蛋白(26–29); 二肽基肽酶4（DPP4），也称为CD26，是一种跨膜糖蛋白，是中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）的受体，与SARS-CoV-2在系统发育上相关(30,31). 最近的研究表明，当病毒进入呼吸道细胞时，新冠肺炎S蛋白的S1结构域可能与DPP4相互作用(32–36); 丙氨酸氨基肽酶（ANPEP），也称为CD13，是人类冠状病毒-229E的受体(37). ANPEP和ACE2之间的相关性表明ANPEP与SARS-CoV-2细胞进入相关(38,39); 根据串联亲和纯化（TAP）-质谱分析，酪氨酸蛋白激酶受体UFO（AXL）与SARS-CoV-2的S蛋白特异性相互作用，其在HEK293T细胞中的过度表达促进病毒进入(40); 谷氨酰氨肽酶（ENPEP）是一种II型完整膜蛋白，根据与ACE2的共表达，它被确定为SARS-CoV-2的候选共受体，尽管它与病毒感染的关系没有得到坚定的支持(38,41). 迄今为止，在一名新冠肺炎患者切除的胶质瘤组织中，检测到GBM中ACE2的表达高于GBM邻近组织(42). ACE2和其他冠状病毒受体与GBM致病性的关系尚需探讨，以更好地了解SARS-CoV-2感染如何影响GBM患者的临床特征。在这项研究中，我们通过生物信息学和实验方法研究了六种冠状病毒受体在正常大脑和GBM组织中的表达谱。我们还利用各种web服务进行了冠状病毒表达与预后和免疫过滤之间的相关性分析。此外，为了探索冠状病毒受体在GBM和新冠肺炎中的潜在分子机制，分析了新冠肺炎和GBM中冠状病毒受体相关基因之间的蛋白-蛋白相互作用网络、功能信号通路和共同基因调控的分子过程。
材料和方法
蛋白质表达分析
GBM临床组织芯片（HBraG090PG01）购自Outdo Biotech Co.，Ltd.（中国上海）（正常脑，n=3；GBM，n=25）。免疫组织化学（IHC）方法如下：切片在二甲苯中脱蜡，在酒精中复水，然后与5%牛血清白蛋白孵育以阻断非特异性抗原结合。然后，在4°C下隔夜用抗ACE2（ab108252，1:6400）、TMPRSS2（ab92323；1:4000）、DPP4（ab215711；1:400）、AXL（ab219651；1:500）、ANPEP（ab108310；1:1600）和ENPEP（ab155991；1:100）的一级抗体（Abcam，Cambridge，USA）对切片进行检测然后与兔IgG二级抗体（ZSGB-BIO，中国北京）在37°C下孵育120分钟。切片用二氨基联苯胺染色，苏木精复染。Aipathwell（Servicebio）根据细胞质染色强度（无染色=0；弱染色=1，中等染色=2，强染色=3）和H-score（H-score=∑（I×I）=弱强度区域百分比×1）+（中等强度区域百分比x 2）计算IHC基蛋白表达得分+（强烈度区百分比×3）。此外，从人类蛋白质图谱数据库中提取了正常大脑皮层的代表性免疫组织化学图像。
生存分析
使用R语言进行Kaplan–Meier生存曲线和Cox回归分析，以评估受体表达与临床结果的相关性。根据受体表达中位数，将患者分为高表达组和低表达组。对数秩检验用于计算受体表达引起的存活差异的显著性。使用CGGA（中国胶质瘤基因组图谱）对GBM患者的受体表达和临床特征进行单变量和多变量Cox分析(网址：http://www.cgga.org.cn/).
免疫渗透率和亚型分析
利用肿瘤免疫评估资源（TIMER2.0）的“免疫基因”模块研究了冠状病毒受体与GBM（n=153）中单核细胞、树突状细胞（DC）、自然杀伤（NK）细胞和嗜酸性粒细胞浸润水平之间的关联功能热图表(http://timer.cistrome.org/)该平台包含TCGA患者的免疫浸润数据。红色表示显著的正关联，蓝色表示显著的负关联，灰色表示不显著的结果。
结果
SARS-CoV-2在中枢神经系统（CNS）和癌症中的研究综述
据报道，新冠肺炎患者经常表现出神经系统症状，即头痛、头晕、抑郁、嗜睡、嗅觉和味觉受损、肌肉协调和自主呼吸控制丧失(4–9,44,45) (). 从新冠肺炎患者尸检组织中积累的证据表明，SARS-CoV-2 RNA在脑组织、皮层神经元、额叶组织神经和毛细血管内皮细胞、嗅神经、直回和脑干中检测到(46–49). 人脑类器官也表现出SARS-CoV-2的神经侵袭能力(50,51). 然而，SARS-CoV-2如何直接感染中枢神经系统（CNS）尚不清楚。
表1
| 新型冠状病毒肺炎在中枢神经系统（CNS）中的表达 | 新冠肺炎与癌症 |
|---|
| 临床症状 | 头痛、头晕、嗅觉丧失或中断（嗅觉丧失/嗅觉障碍）、味觉丧失（味觉丧失/味觉障碍），肌肉协调丧失（共济失调），自主呼吸控制丧失，嗜睡，抑郁
和焦虑(4–9,44,45) | 在患有肺癌、胃肠道癌、乳腺癌、血液癌或转移癌的新型冠状病毒肺炎患者中，胸闷患病率较高、死亡率较高、ICU入住率较高、至少出现一种严重或危重症状的比率较高(55,56); 癌症患者中病毒相关淋巴减少增加(57). |
| 病毒检测 | 脑组织中检测到SARS-CoV2(46)，皮层神经元(47)额叶组织中的神经和毛细血管内皮细胞(48)COVID-19患者尸检组织中的嗅神经、直回和脑干(49). SARS-CoV-2的神经侵袭能力也在人脑器官中测定(50,51). | 癌症患者病毒脱落时间延长和病毒载量增加(57,58). |
| 受体表达 | ACE2在黑质和脑室、梨状皮质、神经元和一些非神经元细胞（颞中回和扣带回后皮质的星形胶质细胞和少突胶质细胞）中表达(52–54); TMPRSS2存在于神经血管单位的少突胶质前体细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞中(53,54). DPP4和ANPEP分布于神经血管单位的星形胶质细胞和小胶质细胞(54). | 肝细胞癌中ACE2下调(59)，非小细胞肺癌（NSCLC）(60)，乳腺肿瘤(61)，胰腺导管腺癌(62)，和胆囊癌(63); ACE2和TMPRSS2在大肠肿瘤中均上调(64)和肺癌(65). TMPRSS2在头颈癌中下调(66). |
已经证实SARS-CoV-2通过其S蛋白与ACE2结合到宿主细胞(20–25)随后，ACE2的精氨酸和赖氨酸残基被TMPRSS2裂解，这是病毒进入细胞前启动S蛋白的重要步骤(26–29). 除了ACE2公司和TMPRSS2型，其他一些分子也被建议参与SARS-CoV-2细胞的进入，例如DPP4（DPP4）,ANPEP公司,AXL公司、和欧洲政治公众人物协会(30–41).ACE2公司在中枢神经系统中检测到，即黑质和脑室、梨状皮质、神经元和一些非神经元细胞（颞中回和扣带回后皮质的星形胶质细胞和少突胶质细胞）(52–54). TMPRSS2存在于神经血管单位的少突胶质前体细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞中(53,54). DPP4和ANPEP分布于神经血管单位的星形胶质细胞和小胶质细胞() (54).
患有肺癌、胃肠道癌、乳腺癌、血液癌或转移癌的新型冠状病毒肺炎患者的死亡率、ICU入院率以及至少一种严重或危重症状（如胸闷）较高(55,56). 同时，在癌症患者中也观察到病毒相关淋巴减少增加、病毒脱落延长和病毒载量增加(57,58). 然而，与正常组织相比，肝细胞癌中已发现ACE2下调(59)，非小细胞肺癌（NSCLC）(60)，乳腺肿瘤(61)，胰腺导管腺癌(62)和胆囊癌(63)而ACE2和TMPRSS2在大肠肿瘤中上调(64)和肺癌(65). 头颈癌患者的TMPRSS2降低(66). 迄今为止，对一例COVID-19患者手术切除的胶质瘤组织进行免疫组织化学染色，结果表明，ACE2在GBM中的表达高于GBM邻近组织(42)，但关于其他冠状病毒受体是否在GBM中表达尚不清楚(). 为了了解GBM中SARS-CoV-2的发病机制和发展，我们随后使用各种网络程序进行了生物信息学分析，以确定GBM中ACE2、DPP4、ANPEP、AXL、TMPRSS2和ENPEP的致癌特征。
冠状病毒受体在正常脑组织/区域的表达模式
我们首先使用人类蛋白图谱（HPA）数据集分析了冠状病毒受体mRNA在人类大脑不同区域的表达模式，即大脑皮层、嗅觉区、海马结构、杏仁核、基底神经节、丘脑、下丘脑、中脑、脑桥和髓质以及小脑。如所示，人类ACE2公司在所有检测到的区域中都可以忽略表达。人类DPP4（DPP4）在大脑皮层检测到，在其他区域几乎没有分布。人类安培普分布于一些区域，即大脑皮层、嗅觉区、杏仁核、中脑、脑桥、髓质和小脑。人类AXL公司在所有检测到的区域都高表达，而人类TMPRSS2型在测试区域中可忽略地表达。人类欧洲政治公众人物协会分布于大脑皮层、海马结构、基底神经节、脑桥和髓质等多个区域。
此外，从HPA数据库中提取大脑皮层中这些冠状病毒受体表达的免疫组织化学分析如下：ACE2和TMPRSS2蛋白在大脑皮层中可以忽略不计；DPP4存在于胶质细胞和神经元细胞中；在内皮细胞中观察到ANPEP；AXL和ENPEP存在于内皮细胞和神经细胞中().
冠状病毒受体在GBM中的表达谱
我们进一步分析了GBM中冠状病毒受体的表达，以剖析其致癌作用。公共数据库中可用的RNA表达数据是从细胞系、正常和肿瘤样本中提取的。首先，GEO图谱GDS4468显示了以下胶质母细胞瘤细胞系（LN018、LN215、LN229、LN319和BS149）中受体的表达谱：人类ACE2公司,AXL公司、和TMPRSS2型在这五种细胞系中广泛表达；同时，人类DPP4（DPP4）,ANPEP公司、和欧洲政治公众人物协会在BS149中高度分布，其次是LN018、LN215、LN229和LN319(). 其次，我们使用UALCAN程序分析了GBM数据集中冠状病毒受体基因的表达。ACE2公司,DPP4（DPP4）,ANPEP公司、和欧洲政治公众人物协会在GBM患者样本中显著上调，而AXL公司和TMPRSS2型正常和GBM样本之间具有可比性(). 为了验证这些观察结果，我们进行了免疫组织化学分析，以确定病理性GBM组织芯片中冠状病毒受体蛋白的表达。如所示与正常人相比，GBM患者的ANPEP和ENPEP蛋白显著增加。可能由于样本量小，在正常和肿瘤患者之间没有观察到ACE2、DPP4、AXL和TMPRSS2蛋白的显著差异。
多形性胶质母细胞瘤（GBM）中冠状病毒受体的表达模式。（A）来自GDS4468的胶质母细胞瘤细胞系LN018、LN215、LN229、LN319和BS149（复发性胶质母细胞癌）中的CoV受体mRNA。（B）UALCAN程序从TCGA数据库中提取的正常（n=5）和GBM（n=156）组织之间的冠状病毒受体mRNA。（C）正常（n=3）和GBM（n=27）组织芯片中受体的代表性免疫组织化学图像。（D）组织学评分。平均值+SEM。对正常人进行显著性比较。比例尺=50μm*P<0.05**P<0.01***P<0.001****P<0.0001，NS：无显著性P>0.05。
第三，我们分析了冠状病毒受体的表达与临床特征的关系(
图S1
). 对于年龄ACE2公司和DPP4（DPP4）在60岁以下患者中增加。的级别ANPEP公司和欧洲政治公众人物协会不同年龄组间差异显著，在60～80岁时达到高峰。然而AXL公司和TMPRSS2型不同年龄组患者之间无显著差异。对于性别，所有六种受体的表达水平在男性和女性之间没有显著差异。对于种族，ACE2、DPP4、TMPRSS2和ENPEP的水平在三个种族中具有可比性。然而，亚洲人的AXL水平高于高加索人，而亚洲人的ANPEP水平低于高加索人。
GBM中冠状病毒受体的生存分析
为了评估冠状病毒受体表达水平是否与GBM的肿瘤预后相关，利用TCGA和CGGA数据生成了Kaplan–Meier生存曲线。如所示，高水平的ANEP和AXL与TCGA样本的不良预后显著相关，而在CGGA病例中发现了高水平的ANEP和ENPEP与不良预后的相关性(
图S2A
). 此外，使用Cox比例风险回归模型进行单变量和多变量分析，以评估每个冠状病毒受体表达和其他临床病理因素对生存率的影响。如所示单因素分析显示ANPEP（危险比：1.447；P（P）<0.001）、DPP4（危险比：1.399；P（P）<0.001）和ENPEP（危害比：1.399；P（P）<0.001）是生存率的负预测因子。此外，受体表达和其他临床病理变量的多元分析显示：ENPEP（危险比：1.243；P（P）<0.001），PRS类型（危险比：1.974；P（P）<0.001），等级（危害比：2.688；P（P）<0.001）和年龄（危险比：1.227；P（P）=0.043）是生存率的负预测因子；DPP4（危害比：0.883；P（P）=0.043），化疗（危险比：0.660；P（P）<0.001），IDH_突变（危险比：0.567；P（P）<0.001）和1p19q_codeling（危险比：0.387；P（P）<0.001）是生存率的积极预测因素(
图S2B
). 总的来说，Kaplan–Meier生存曲线表明ANPEP、AXL和ENPEP的高表达与预后不良相关，进一步的多变量分析表明ENPEP高表达可能是生存的负预测因子。
GBM冠状病毒受体的预后和生存分析。（A）TCGA数据库中的Kaplan–Meier生存曲线。红色表示高表达，蓝色表示低表达（n=168）。（B）CGGA数据库中单变量Cox比例风险回归模型的森林图（n=216）。
冠状病毒受体与GBM免疫浸润的关系
肿瘤过滤免疫细胞是肿瘤微环境重要组成部分的独立预测因子，与肿瘤的发生、发展或转移密切相关(67). 因此，我们接下来研究了GBM不同免疫亚型中冠状病毒受体和免疫浸润水平之间的关系。根据TCGA数据集基于基因表达的研究中显示的GBM关键生存相关免疫细胞，选择了单核细胞、DC、NK细胞和嗜酸性粒细胞(68). 如所示ACE2表达与单核细胞免疫浸润呈正相关。在某些算法中，DPP4与单核细胞、树突状细胞和NK细胞呈正相关，而与嗜酸性粒细胞呈负相关。ANPEP表达水平与单核细胞、树突状细胞和静止NK细胞呈正相关，与单核、活化树突状公司和NK细胞的某些算法呈负相关。AXL表达水平与单核细胞、树突状细胞和NK细胞浸润水平呈正相关。TMPRSS2与单核细胞呈显著正相关，与DC和NK细胞呈负相关。与单核细胞和树突状细胞某些算法中ENPEP表达水平的负相关相比，单核细胞、树突状公司和NK细胞与ENPEP的表达水平显著正相关。这些发现强烈表明冠状病毒受体在GBM的免疫浸润中起着重要作用。
TIMER2.0的GBM中不同细胞类型的冠状病毒受体表达与免疫浸润水平之间相关性的功能热图表。（A）单核细胞。（B）DC。（C）NK细胞。（D）嗜酸性粒细胞。n=153。GBM，胶质母细胞瘤。
GBM中冠状病毒受体相关基因的富集分析
为了进一步研究冠状病毒受体在GBM肿瘤发生中的分子机制，我们利用TCGA数据集中的GBM肿瘤和GTEx数据集中的正常脑样本的组合，获得了与冠状病毒接收器相关的前100个基因。冠状病毒受体之间的交叉分析显示如下：1个共同基因ACE2公司组和AXL公司组(ZFP36L1型); 9个共同基因DPP4（DPP4）和TMPRSS2型; 12个共同基因DPP4（DPP4）和AXL公司; 16个共同基因DPP4（DPP4）和ANPEP公司; 3个共同基因ANPEP公司和TMPRSS2型().
GBM冠状病毒受体相关基因富集分析。（A）根据E Venn图对不同受体组中前100个受体相关基因与GBM的交叉分析。（B）基于总受体相关基因的KEGG富集途径分析气泡图。（C）黄色模块中所有基因的cnet图，描述了基因的链接和最重要的信号通路。（D）GBM中与冠状病毒受体相关基因相关的功能和分子过程。
此外，我们结合每个冠状病毒受体的前100个相关基因进行KEGG和GO富集分析。KEGG通路的富集表明，这些基因在GBM肿瘤发病过程中与以下通路高度相关：PI3K−Akt信号通路、局部粘附、蛋白质消化和吸收、细胞因子-细胞因子受体相互作用、癌症中的蛋白聚糖等(). cnet图显示了GBM中冠状病毒受体相关基因与功能信号通路的关系(). 此外，对生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）的GO富集分析表明，GBM中的冠状病毒受体相关基因与膜受体功能相关的基因术语有关，即信号转导、膜整体成分和受体结合().
冠状病毒受体相关基因在GBM和COVID-19中的应用
为了探讨新型冠状病毒肺炎（COVID-19）与GBM冠状病毒受体相关基因之间的潜在关系，使用维恩图进行交叉分析。如所示在GBM的冠状病毒受体相关基因和COVID-19之间发现了245个共同基因。为了进一步剖析疾病的深度并预测表型-基因型关联，通过STING和Cytoscape软件鉴定了与冠状病毒接收器直接相互作用的蛋白，结果显示有30个基因在GBM中表达冠状病毒受体可以相互作用，例如ACE2与TMPRSS2、DPP4、ANPEP或ENPEP的结合；DPP4与TMPRSS2、ANPEP或ENPEP的结合；以及ANPEP与ENPEP的绑定。AXL可以与许多基因结合，但不能与冠状病毒受体结合。FN1基因可被四种冠状病毒受体识别，即ACE2、DPP4、ANPEP和AXL。KEGG通路富集分析表明，245个常见基因与癌症中的蛋白聚糖、PI3K−Akt信号通路、癌症中的通路、局部粘附和细胞因子-细胞因子受体相互作用高度相关(). 此外，GO富集分析表明，245个共同基因参与了信号转导相关基因项，即蛋白质结合、膜的组成成分和信号转导().
GBM中COVID-19相关基因和冠状病毒受体相关基因的富集分析。（A）对从比较毒理学数据库（CTD）下载的7230个COVID-19基因与GBM中每个受体前100个相关基因进行交叉分析。在GBM中共鉴定出245个共同基因与冠状病毒受体相关基因。（B）对245个常见基因与冠状病毒受体的直接相互作用蛋白进行层次聚类分析。颜色键表示由同系物的选定参数和STRING程序的实验确定的交互作用计算的综合得分。红色、黄色和蓝色分别表示高、中、低的综合得分。（C）常见基因KEGG富集途径分析气泡图。（D）常见基因GO功能和分子过程的气泡图。
讨论
病毒是如何进入大脑的？
病例分析中，38.4%的患者和45.5%的重症患者SARS-CoV-2感染有神经系统表现，通常伴有头痛、头晕、意识障碍、嗅觉和味觉障碍(5,44,45). 值得注意的是，SARS-CoV-2 RNA已在许多不同的脑组织中检测到，即皮层神经元、额叶组织、嗅神经和脑干(46–49)和脑脊液标本(10). 然而，病毒如何影响大脑还不清楚。累积的研究提供了以下假设来解释这些病毒在大脑中的入侵：（1）通过嗅觉途径(69,70)，（2）从迷走神经逆行至脑干髓质心肺中枢(49)以及（3）通过血脑屏障（BBB）和血脑脊液屏障（BCSFB）的血行途径(71). 因此，相邻内皮细胞之间的紧密连接形成了血脑屏障的基本结构，血脑屏障在限制病毒的细胞旁运输中起着关键作用，因此被认为是冠状病毒进入中枢神经系统的主要途径(71).
有趣的是，在两项研究中，ACE2和TMPRSS2这两种广泛接受的SARS-CoV-2细胞进入受体在人脑内皮细胞中相对较低(52,72)，这与中显示的结果一致然而，在人脑的嗅觉区和内皮细胞中检测到冠状病毒受体ANEPE、AXL和ENPEP(和)表明SARS-CoV-2细胞进入人脑可能需要这三个受体，而不是依赖ACE2和TMPRSS2。
ANPEP和ENPEP水平升高与GBM进展的关系
大多数研究集中于抗癌治疗的免疫抑制作用，这导致癌症患者对新冠肺炎的易感性增加。然而，越来越多的论文提供了证据表明病毒可以直接与肿瘤相互作用，例如冠状病毒受体ACE2的上调(73–76)，严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型相关淋巴细胞减少症增加，病毒脱落时间延长，病毒载量增加(57,58). 因此，SARS-CoV-2增加癌症敏感性和严重性的机制尚不清楚。
GBM组织芯片的免疫组织化学染色显示，GBM中ANPEP和ENPEP的蛋白水平显著升高()，尽管mRNA水平ACE2公司,DPP4（DPP4）,ANPEP公司、和欧洲政治公众人物协会根据UALCAN服务器在GBM中上调(). 事实上，复发性胶质母细胞瘤产生的BS149细胞系比其他四种胶质母细胞癌细胞系（LN018、LN215、LN229和LN319）更恶性，并且DPP4、ANPEP和ENPEP的mRNA水平更高()进一步证实了ANPEP和ENPEP在GBM中的潜在致癌作用。此外，ANPEP与ENPEP水平随年龄增长显著上调，并在60–80岁时达到峰值(
图S1A
)这与70至79岁之间GBM的发病高峰相一致(77). Kaplan-Meier生存曲线和Cox回归分析表明，ANPEP和ENPEP的高表达与预后不良相关，ENPEP是生存的负预测因子。此外，与ANPEP和ENPEP直接相互作用的蛋白是FN1、CALR、PDGFRB、CD68、CD63、NRP1、SDC1和SERPINA1，它们都参与GBM的进展() (78–85). 所有这些发现都表明，ANPEP和ENPEP水平的增加与GBM进展相关。
ZDOCK研究SARS-CoV-2与ANPEP或ENPEP的潜在相互作用
蛋白质和蛋白质相互作用网络表明ANPEP、ACE2、DPP4和ENPEP可以形成蛋白质复合物()表明ANPEP和ENPEP可能直接参与SARS-CoV-2的脑通讯，类似于ACE2，尽管没有数据支持ANPEP或ENPEP作为SARS-CoV 2的受体。为了预测SARS-CoV-2与ANPEP或ENPEP的潜在分子相互作用，我们通过刚体计算对接程序ZDOCK Server进行了对接模拟。选择Top1预测进行以下分析(
补充图3
). SARS-CoV-2 RBD与ENPEP的络合物的△G值为−16.7 kcal mol−1Kd值为5.20E−13，埋藏界面面积为2544 Au 2，高于ANPEP复合物中的观察值。这些值表明，ENPEP与RBD的亲和力可能高于ANPEP。然而，这些计算对接程序的刚体假设将明显地限制精度和可靠性(86). 特别是，ENPEP或ANPEP与其他病毒尖峰蛋白的已知同源蛋白-蛋白质相互作用数量有限。因此，需要进一步的实验来验证ANPEP或ENPEP是否能够真正绑定到SARS-CoV-2 RBD。
此外，由于免疫反应对SARS-CoV-2感染至关重要，ANPEP和ENPEP介导的免疫学方面不容忽视。我们的分析表明，ANPEP和ENPEP的表达与巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞和NK细胞的免疫浸润高度相关()提示ANPEP和ENPEP通过调节SARS-CoV-2感染GBM期间的免疫浸润，在细胞免疫中发挥重要作用。事实上，ANPEP表达增加是神经退行性疾病炎症的标志，而ANPEP活性受损已被研究为抗炎治疗的靶点(87,88).
总的来说，GBM中六种受体的表达模式和存活分析表明，ANEP和ENPEP的上调与GBM的低存活率有关。ANEP和ENPEP在血脑屏障内皮细胞中的分布为严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型细胞进入大脑提供了场所，ANPEP或ENPEP通过蛋白质-蛋白质对接与RBD的潜在结合为SARS-CoV-2感染提供了工具，这反过来又增加了GBM对SARS-CoV-2的敏感性(和
补充图3
). 因此，生存率低、GBM感染SARS-CoV-2的风险增加以及高免疫浸润的重叠可能导致GBM患者感染SARS-CoV-2的严重程度。法国一个队列中GBM-SARS-CoV-2的39%死亡率支持这一可能的结论() (16). 本研究揭示了新冠肺炎和GBM之间的关系。我们探索了冠状病毒受体与GBM的关系，并确定ANPEP和ENPEP是新冠肺炎和GBM的潜在生物标志物和疗法。
GBM中ANPEP和ENPEP对冠状病毒感染的调节模型。先前的研究将ACE2和TMPRSS2描述为SARS-CoV和SARS-CoV-2的受体或共受体；SARS-CoV-2的AXL；MERS-CoV的DPP4；人类冠状病毒-229E的ANPEP；DPP4、ENPEP和AENPEP是SARS-CoV-2的候选受体。ANPEP和ENPEP分布在血脑屏障的内皮细胞中，冠状病毒通过该屏障进入中枢神经系统。ANPEP或ENPEP与SARS-CoV-2 RBD的蛋白质对接分析，结合GBM中ANPEP和ENPEP的上调可能导致GBM对SARS-CoV-2的敏感性增加。GBM中高水平的ANPEP和ENPEP与低存活率和高免疫浸润有关。GBM风险增加与SARS-CoV-2重叠、生存率低和免疫浸润高可能导致GBM患者感染SARS-CoV-2的严重程度。
数据可用性声明
根据合理要求，可从相应作者处获得支持本研究结果的数据。
道德声明
上海奥多生物技术公司伦理委员会审查并批准了涉及人类参与者的研究。根据国家立法和机构要求，本研究不需要书面知情同意书。
作者贡献
JY和AC设计了这项研究。AC、WZ、XLL、GS、ZM、LP、ZS、XGL和JY进行了实验并分析了这项工作的数据。JY和AC撰写了手稿。列出的所有作者都对这部作品做出了实质性、直接和智力上的贡献，并批准出版。
利益冲突
作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。
出版商备注
本文中表达的所有声明仅为作者的声明，不一定代表其附属组织的声明，也不一定代表出版商、编辑和审稿人的声明。本文中可能评估的任何产品，或其制造商可能提出的索赔，都不受出版商的保证或认可。
致谢
本研究得到了山东大学齐鲁青年奖学金、山东省自然科学基金（ZR2021QH198）、中国博士后科学基金（2018M642666和2020T130371）、泰山学者专项基金（tsqn201909173和ts20110814）的支持，山东大学临床研究中心（2020SDUCRCB002）和济南微生态生物医学山东实验室研究项目（JNL-2022003A）。我们感谢张水军和闫柴提出的宝贵建议。
补充材料
本文的补充材料可以在以下网站上找到：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2022.840785/full#补充-材料
补充图1
根据UALCAN程序，GBM患者不同亚群中冠状病毒受体的表达模式。显示受体相对表达的方框图（A）年龄：21～40岁（n=12），41～60岁（n=67），61～80岁（n/69），81～100岁（n/7）；b性别：男性（n=101）和女性（n=54）；和（C）种族：白种人（n=139）、非洲裔美国人（n=10）和亚洲人（n=5）。GBM，胶质母细胞瘤*，P（P）<0.05; **,P（P）<0.01; ***,P（P）<0.001.
补充图2
CGGA数据集和多变量Cox分析中的Kaplan-Meier生存曲线。（A）Kaplan–Meier生存曲线。红色表示高表达，蓝色表示低表达。（B）CGGA数据库中冠状病毒受体表达和一些临床病理变量之间的多变量Cox分析的森林图（n=216）。
补充图3
通过ZDOCK算法将SARS-CoV-2 RBD（从6M0J分离）与ANPEP（4FYQ）和ENPEP（4 KX7）对接。（A）结合自由能（kcal-mol-1），结合亲和力Kd（千克）与SARS-CoV-2 RBD复合体中ANPEP和ENPEP的Top 1预测的埋藏界面面积。（B）SARS-CoV-2 RBD与ENPEP对接模型。RBD表面的结合位点用粉红色表示，ENPEP表面的结合部位用绿色表示（左）。两种蛋白质氨基酸界面上的氢键用绿线表示（右）。
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