基于细胞分类的细胞周期小规模ChIP测序协议
关联数据
摘要
图形摘要
亮点
• 药物不用于在不同细胞周期阶段阻滞细胞 • 该方案适用于少量ChIP-seq染色质 • 该方案可用于分离额外的细胞周期阶段 • 该方案可适用于任何循环细胞和其他组蛋白修饰
开始之前
优化超声波
时间：2天到几周
注： 虽然我们用未分类的细胞优化了超声处理，但分类的细胞更容易进行超声处理，并且可能需要更少的超声处理时间（少约5分钟）。 由于排序的时间和价格（尤其是使用工具时），我们不使用排序的单元格进行优化，但可以决定这样做。
1 一个15厘米的板细胞 2 板，以便在48小时（～1×10）时获得70%的合流 7 每个板的电池）。 2 将最终浓度为1%的甲醛添加到培养基中，旋转混合并在37°C下培养13分钟。
关键： 甲醛应新鲜打开，有毒，请戴上手套并妥善处理。
三。 添加最终浓度为0.125 M的1.25 M pH值为2.5的甘氨酸，以停止交联，旋转混合并至少孵育2分钟。
注： 淬火期间，介质应变成亮黄色。
注： 低pH值可以提高甘氨酸的功效。
4 取出培养基，用冷的1×PBS清洗细胞。 5 用带有1×PBS的提升器收集细胞，并转移到锥形管中。 在4°C、100 g的温度下离心2分钟。
注： 使用电池升降器代替刮刀，这样可以减少电池损坏。
6 将细胞重新悬浮在1 mL细胞裂解缓冲液中，该缓冲液中新加入蛋白酶抑制剂（不含EDTA的鸡尾酒片）。 在冰上培养5分钟，并在4°C下以100 g离心2分钟。 7 通过抽吸或移液将上清液丢弃，并将细胞重新悬浮在300μL新加入蛋白酶抑制剂的核溶解缓冲液中（不含EDTA的鸡尾酒片）。 这对应于～1×10 7 总共个单元格。
注： 核溶解缓冲液的量可以根据细胞的数量进行调节。
8 超声处理：我们使用QSonica Q800R系统，冷却机打开。将300μL染色质转移到0.5 mL薄壁PCR管中。 振幅为70%的声波15 s开启45 s关闭20 min 总开启时间 。
注： 我们使用了0.5 ml薄壁PCR管（品牌781312），但任何等效的（薄壁）都可以。
注： 我们发现这种声波仪最适合DNA声波，但可以使用等效的浴声波仪，并且需要适应声波时间和振幅。
注： 如果你不知道你的细胞需要多少超声，超声10分钟，从试管中取出几微升，再加上5分钟，取出几微克，以此类推，直到40分钟的超声时间，然后按照下面的步骤测试所有这些时间。
注： 不要过度超声，大小不会进一步减小，但染色质会开始改变，ChIP的效率会降低。
注： 浴缸永远不会变热。
9 将3μL染色质和1μL蛋白酶K添加到65μL洗脱缓冲液中，在65°C下在台式热混合器中孵育4-16小时，以1000 rpm振荡。 10 添加65μL苯酚/氯仿/异戊醇25:24:1，涡旋，在20000 g、18°C–25°C下离心1分钟。 11
注： 使用一种只有一种跟踪颜色的DNA负载染料，这种颜色是高分子的，以避免使用与预期染色质大小相同的染料，因为它会隐藏染色质。
关键资源表
材料和设备
抗体
缓冲器
注： 添加ddH 2 O至～200 mL，用HCl调节pH至2.5，添加剩余的ddH 2 O至250 mL。
关键： 氯化锂和脱氧胆酸钠有毒，尤其是挥发性粉末。请在通风橱中戴手套处理。
分步方法细节
单元格排序
时间：3天到几周
1 种子2.5×10 6 四个15厘米RPE 2 放置48小时。
注： 收获时，细胞需要达到～70%的汇合。
2
注： 培养时间需要根据细胞的生长速度进行调整（例如HEK293T为30分钟）。
注： Hoechst对某些细胞有毒性，如果细胞看起来不同，则在培养后会产生毒性( 即。， 四舍五入）应使用较少的Hoechst。
三。 轻敲平板的侧面，抖掉松散附着的有丝分裂细胞。 将培养基收集在50 mL锥形中并离心，以使细胞在有丝分裂中形成颗粒，从而减少粘附。 将旋转培养基转移到另一个试管中，因为它将在步骤5和9中使用，留下足够的培养基，以确保不吸入颗粒有丝分裂细胞。 4 用1×PBS冲洗细胞，每15 cm添加2.5 mL胰蛋白酶 2 板。
注： 单细胞悬浮液对分选至关重要。
5 从第3步开始，将细胞重新悬浮在旋转培养基中4个15 cm 2 平板使用36毫升培养基，转移到含有有丝分裂细胞颗粒的50毫升锥形管中。 6 通过向培养基（最终1%）中添加1mL 37%甲醛，将细胞交联，在37°C下培养13分钟。
注： 甲醛应新鲜打开，有毒，请戴上手套并妥善处理。
7 加入3.7 mL甘氨酸1.25 M pH 2.5（最终0.125 M），停止固定，在18°C–25°C下培养至少2分钟。
注： 介质应变成亮黄色。
8 离心细胞，用1×PBS清洗细胞颗粒，然后再次离心。 9 从步骤3开始，将细胞颗粒重新悬浮在2mL旋转培养基中。
注： 当细胞重新悬浮在含有Hoechst的原始培养基中时，尤其是当分选步骤需要数小时时，分选步骤更有效。
10 将细胞放在冰上直到分类。
注： 固定细胞在分类之前可以在冰上保存几个小时。
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注： 可以使用任何带有激光的分拣机来读取Hoechst。 存放和收集细胞的容器取决于分拣机。
注： 在步骤14中，将所有细胞分为四个部分，并根据细胞数量调整裂解体积。
注： 所需的细胞数量取决于获得的染色质的产量以及实验人员想用染色质处理的IP数量。 有必要将几种分类合并在一起。
12 将细胞转移到15 mL锥形管中，并在4°C、1000 g下离心15分钟。 13 在补充有新鲜蛋白酶抑制剂的200μL细胞裂解缓冲液（不含EDTA的鸡尾酒片）中裂解细胞，在冰上孵育5分钟，在4°C下以2000 g离心5分钟。 14 去除上清液，将颗粒重新悬浮在核溶解缓冲液中，并辅以新鲜蛋白酶抑制剂（不含EDTA的鸡尾酒片），根据颗粒大小进行调整。 对于估计体积，我们使用10μL用于300000个细胞，25μL用于100万个细胞，60μL用于400万个细胞。
暂停点： 保持在−80°C（未分离的染色质将稳定多年）。
超声波处理
时间：1天
15 打开QSonica Q800R冷却器。 将染色质转移到0.5 mL薄壁PCR管中。 根据优化步骤中确定的时间进行超声波检测。
注： 分选后的细胞更容易进行超声检测，因此，它们可能需要更少的超声检测时间。 不要过度发音，因为ChIP的效率会降低。 大小不会进一步减小，但染色质会开始改变。
注： 超声波浴永远不会变热。
注： 步骤16-18是可选的，但建议使用。 虽然超声效率应始终保持不变，但我们建议在进行免疫沉淀步骤之前，每次检查超声以确保该步骤正常工作。 在这些步骤中，将剩余的染色质储存在−80°C。
16 将3μL染色质和1μL蛋白酶K添加到65μL洗脱缓冲液中，在65°C的台式热混合器中以1000 rpm的速度振荡培养4–16小时。 17 加入65μL苯酚/氯仿/异戊醇25:24:1，涡旋，在18°C–25°C下全速离心1分钟。 18
注： 使用只有一种高分子追踪颜色的DNA负载染料，避免使用与预期染色质大小相同的染料，因为它隐藏了染色质。
注： 不同细胞周期阶段的细胞超声效率是相同的。
19 将经超声处理的染色质转移到1.5 mL试管中，在4°C、20000 g下离心10分钟，以清除碎片。将上清液转移到干净的试管中，留下任何潜在的颗粒。
注： 冷染色质（刚刚解冻或放在冰上）可能会出现一些SDS沉淀物，这些沉淀物将在离心过程中粒化。 在继续执行步骤19之前，将染色质在18°C–25°C下放置几分钟，以使SDS回到溶液中。
注： 我们建议将染色质保存在低结合DNA管中，但常规管也可以。
注： 预期染色质浓度（来自Nanodrop的DNA浓度）为300–1000纳克/μL。 故障排除5 。
暂停点： 将染色质保持在−80°C（染色质将稳定数年，等分，以避免过多的冷冻/解冻循环，这将恶化染色质）。
免疫沉淀
时间：2天
20 用抗体预先结合珠子。 在200μL试管中：添加100μL稀释IP缓冲液，并辅以新鲜蛋白酶抑制剂（不含EDTA的鸡尾酒片）、2.5μL蛋白a或G磁珠（在稀释IP缓冲溶液中预洗并再次悬浮，兔多克隆蛋白a和鼠单克隆抗体G），以及0.2μG抗体。 在4°C下旋转培养6小时。
注： PCR带管在这一步很有用，因为它们更容易操作，并且允许在这一步骤和后续步骤中同时旋转多个管。
注： 孵化时间可以延长。
注： 抗体的数量可能因疗效而异。
21 将染色质集中在1.5 mL试管中：每个IP包括在10μL核溶解缓冲液中加入0.5μg染色质，并添加新鲜蛋白酶抑制剂（不含EDTA的鸡尾酒片），还包括0.5μg用于输入的染色质（如果使用此方法生成基线输入序列图）和0.5μg的用于移液误差。
注： 5 IPs+输入+移液误差示例：5×0.5+0.5+0.5=2.5μg染色质在5×10+10+10=70μL核溶解缓冲液中。 注意，染色质的体积将扣除核溶解缓冲液的体积：如果2.5μg染色质代表5μL，则需要65μL核溶解缓冲。
注： 每个IP的染色质数量可能不同，我们对一些抗体使用了1μg（见材料部分）。
注： 染色质浓度基于纳米液滴上的DNA浓度。
22 取10μL混合染色质（在前一步的核溶解缓冲液中稀释）。 这将作为输入，在4°C下保存，直到再次使用。 23 预清除步骤。 使用稀释的IP缓冲液，并辅以新鲜蛋白酶抑制剂（不含EDTA的鸡尾酒片）（根据IP条件，低triton或高triton），将剩余的混合染色质调至100μL/IP。
注： 当蛋白A或G磁珠被用于IP抗体时，蛋白A琼脂糖被用于IP。 如果使用蛋白G作为IP，可以选择使用蛋白G琼脂糖，但这不会改善预磨损。
24 快速旋转带有珠状物/抗体的试管（从步骤20开始），并在去除上清液之前将其放置在磁性支架上。 每个试管中加入100μL预分离的染色质，在4°C下旋转培养12–16小时。 25 继续清洗。 快速旋转后，将试管放在磁铁上，并去除上清液。 每次清洗时，添加100μL缓冲液，彻底旋涡，快速旋转，放在磁性架上，然后取下缓冲液。 进行6次清洗：两次稀释IP缓冲液，一次TSE缓冲液，1次LiCl缓冲液，2次TE缓冲液。 所有清洗均在18°C–25°C下进行。 故障排除6 。 26 洗脱。 最后一次清洗后，向珠子中添加50μL洗脱缓冲液，转移到1.5 mL试管中，添加1μL RNAseA 100μg/μL，并在台式热混合器中以1000 rpm的速度摇晃，在37°C下培养30分钟。 添加1μL蛋白酶K（10 mg/mL），并在台式热混合器中以1000 rpm的速度摇晃，在37°C下培养1小时。 如果将混合染色质保持在4°C用于输入制剂，则添加40μL洗脱缓冲液，并按照本步骤中的IP进行操作。
注： 如果将IP汇集在一起（参见材料部分），则应在该步骤中使用50μL洗脱缓冲液对所有IP进行洗脱。
注： 洗脱缓冲液应少于一个月。
27 去交叉链接。 从珠子（快速旋转和磁架）中取出样品，并在台式热混合器中以1000 rpm的速度在65°C下培养4小时。 28 DNA纯化。 将125μL Agencourt AMPure XP添加到去交联IP和输入中，在18°C–25°C温度下培养10分钟，然后将其放置在磁铁上并去除上清液。
注： 为了知道珠子何时干燥，我们建议在光线下查看。 珠子不再发亮时是干的。 但是，不要等待超过需要的时间。 如果珠子干得太干（磁铁上的污迹看起来像是“开裂”），回收效率就会降低（参见 图3 ).
暂停点： 将DNA保持在−20°C。 DNA已准备好用于文库制备或qPCR。
文库测序准备
时间：1-2天 秒
29 使用Qubit dsDNA HS分析试剂盒量化每个ChIP DNA。 我们每个文库准备使用1ng DNA（如果浓度低于检测阈值，则使用整个IP）。 将每个DNA放在96孔板的孔中，用H使体积达到50μL 2 O。 30 进行端部修复（上述Illumina PDF第11页）。 31 腺苷酸3′末端（上述Illumina PDF第14页）。 32 配体适配器（上面列出的Illumina PDF第16页）。 33 直接进入富集DNA片段步骤（上面列出的Illumina PDF第25页） 省略 纯化结扎产物（我们在PCR步骤后使用不同的方法纯化）和 在第5步停止 （上述Illumina PDF第27页）。
注： 我们通常进行13个PCR周期。
注： 我们在PCR后不执行洗涤步骤，这一步骤被使用AMPure珠进行双面SPRI纯化所取代，如下所述。
34 在50μL PCR反应中加入30μL AMPure珠粒，在18°C–25°C下孵育10分钟。 35 将管子放在磁性支架上。 保留 样品：将77μL样品转移到新的微孔中。 丢弃珠子。 36 添加12μL AMPure珠，在18°C–25°C下培养10分钟。 37 将板放在磁性支架上。 放弃 样品：取下80μL样品并丢弃。 保留珠子。 38 将平板放在磁性支架上进行两次清洗：添加200μL新鲜制备的80%EtOH，取出、重复并干燥珠子（如前所述，不要太多）。 39 将珠子重新悬浮在17.5μL再悬浮缓冲液中，在18°C–25°C下培养1分钟。 40 将板放在磁性支架上。 将每个库的15μL转移到最终板中。 41 使用TapeStation或生物分析仪验证库，然后继续测序。
注： 典型的TapeStation结果如所示 图4 。
注： 文库的产量应至少为1000 ng/mL。 故障排除7 。