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实验临床癌症研究杂志。2022; 41: 71.
2022年2月21日在线发布。 数字对象标识：10.1186/s13046-021-02237-6
PMCID公司：邮编8862589
PMID：35189958

circCUL2通过激活MyD88依赖性NF-κB信号通路诱导胰腺导管腺癌的炎症CAF表型

郑尚友,#1,2 胡崇辉,#1,三 林洪曹,#4,5 李国林,#6 夏仁鹏,1,三，7 张翔（音）,4,5 丹·苏,1 李志华,通讯作者5,8 周泉波,通讯作者4,5和陈如富通讯作者1,2,三，9
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补充资料
数据可用性声明

摘要

背景

胰腺导管腺癌（PDAC）的特征是癌细胞簇被致密的促结缔组织增生基质包围。然而，对于胰腺肿瘤微环境中基质细胞的异质性知之甚少。

方法

我们通过高通量测序对原代成纤维细胞进行了circRNA分析，并通过qRT-PCR检测PDAC组织中的circCUL2水平。随后，我们通过ELISA、流式细胞术、集落形成和跨阱分析，以及体内异种移植模型，研究了circCUL2对炎性癌相关成纤维细胞（iCAF）激活、异质性和原癌活性的影响。circCUL2对miR-203a-3p/MyD88/IL6的调节作用通过RNA下拉、FISH和荧光素酶报告基因测定来检测。

结果

我们发现circCUL2在癌相关成纤维细胞（CAF）中特异表达，但在癌细胞中不表达。此外，肿瘤组织中circCUL2的富集与PDAC患者预后不良显著相关。正常成纤维细胞（NFs）中circCUL2表达上调诱导iCAF表型，然后iCAF通过IL6分泌促进PDAC进展。此外，circCUL2转导的NFs在体内促进PDAC细胞的肿瘤发生和转移，而PDAC细胞被抗IL6抗体阻断。从机制上讲，circCUL2作为ceRNA发挥作用，并调节miR-203a-3p/MyD88/NF-κB/IL6轴，从而进一步激活胰腺癌细胞中的STAT3信号通路，诱导PDAC进展。

结论

我们发现，circCUL2/miR-203a-5p/MyD88/NF-κB/IL6轴有助于诱导iCAF，并为PDAC进展建立了独特的成纤维细胞生态位，这有助于制定策略，选择性靶向PDAC中促肿瘤CAF。

补充信息

在线版本包含补充材料，请访问10.1186/s13046-021-02237-6。

关键词：circCUL2、炎症性CAF、胰腺导管腺癌、MyD88、NF-κB

背景

胰腺导管腺癌（PDAC）是人类恶性肿瘤中预后最差的一种[1]，对治疗反应差，组织学特征是由密集的促结缔组织增生基质包围的癌细胞簇[2]. 组织基质在肿瘤进展过程中发生转化，癌细胞和基质之间的相互作用为肿瘤的成功发展创造了良好的肿瘤微环境（TME）[三]. 以往解构促结缔组织增生间质的努力均未成功，这反映了TME的多面性，但通过探索更具生物整合性的靶点来重塑PDAC中的TME，可以实现突破。

长期以来，人们认为癌相关成纤维细胞（CAF）通过在肿瘤细胞周围形成广泛的细胞外基质并分泌营养因子，从而形成原癌性生态位，从而对基质的恶性变化起到最重要的作用[4]. CAF通常呈纺锤形，对一些活化的成纤维细胞标记物呈阳性，如成纤维细胞活化蛋白（FAP）、α-平滑肌肌动蛋白和血小板衍生生长因子（PDGF）受体-α（PDGFRα）[5,6]. FAP是用于评估癌症治疗对CAF抑制效果的第一个靶点。使用西布曲单抗（一种人源化单克隆抗体）靶向结直肠癌患者CAF的II期临床试验的不利结果阻止了对该抑制剂的进一步研究[7]. 另一项II期试验也报告了同样令人失望的结果，该试验显示FAP小分子抑制剂（talabostat）与吉西他滨联合治疗晚期PDAC的疗效有限[8]. 面对抑制CAF的失败尝试，提出了一种更激进的方法，即通过基因删除激活的成纤维细胞，这实际上导致了更具侵略性的表型和更糟糕的总体生存率（OS），这表明基质-肿瘤相互作用的困惑[9–11]并强调迫切需要开发PDAC中基质的组成和功能。

CAF由胰腺星状细胞（PSC）、静止的常驻成纤维细胞和骨髓源性间充质干细胞（MSCs）通过激活多种信号通路而衍生而来。PSCs的激活被认为是PDAC肿瘤发生的早期事件[12,13]. 最近，与CAF起源的多样性类似，CAF命运和功能的异质性也引起了极大关注，并表明有可能以CAF亚群为靶点来控制恶性肿瘤。研究人员发现了两种CAF表型，根据α-SMA的表达水平分为肌纤维母细胞CAF（myCAF）和炎症CAF（iCAF）[14]. myCAFs以强烈的α-SMA表达为特征，主要位于TME的腺周区域，并通过与癌细胞的直接近端相互作用诱导结缔组织增生。相反，iCAF中的αSMA水平显著降低，iCAFs通过一组细胞因子和趋化因子在促进肿瘤进展中起着关键作用[14]. 因此，Giulia等人发现iCAF受到IL1的刺激，并通过JAK/STAT激活和IL6分泌提供了原癌生态位，myCAF/iCAF比率的改变可能对PDAC的进展有不同的影响[15]. 随后，确定了第三种CAF亚型，以MHC II类分子表达为特征，具有向CD4+T细胞呈递抗原的能力[16]，表明CAFs的表型和功能多样性仍远未阐明。

环状RNA（circRNAs）是一类有趣的非编码RNA，因为它们是通过一种称为反剪接的非经典剪接事件产生的，并且具有共价闭合结构和抗核酸外切酶的特性[17]. circRNAs作为microRNA（miRNA）或蛋白质海绵，调节蛋白质功能或转化为肽，具有多种生物功能[18]. circRNAs在肿瘤发生中具有潜在作用，并在不同类型的肿瘤中充当致癌基因或肿瘤抑制因子[19]，包括PDAC[20,21]. 然而，在PDAC的TME背景下，circRNAs还没有被阐明。在这里，我们证明了成纤维细胞中circCUL2表达上调介导了正常组织相关成纤维细胞（NFs）向iCAF的转化，并通过诱导MYD88依赖性NF-kb信号通路导致PDAC中CAF异质性。这些发现有助于开发选择性靶向支持肿瘤生长的CAF的策略。

方法

患者和临床样本

收集了161例PDAC患者的肿瘤样本，这些患者于2012年至2020年间在中山纪念医院和广东省人民医院接受了手术切除。没有一名患者在手术前接受过放疗、化疗、免疫疗法或靶向治疗。采用美国癌症联合委员会第8版肿瘤结节转移（TNM）系统确定肿瘤分期。登记患者的临床特征如表所示1总生存率（OS）是指从随机化日期到死亡日期或最后一次随访评估（2020年12月）的时间间隔，无病生存率（DFS）是指随机化时间到首次无病失败事件发生日期之间的时间间隔。所有患者均提供了知情同意书，所有相关程序均经指定医院伦理委员会批准后执行。

表1

PDAC患者circCUL2表达水平与临床病理特征的相关性

特点N个案例circCUL2表达水平
低高p值 一
病例总数1618180
性别0.529
男性874641
女性743539
年龄，平均值±标准差，年b条60.10 ± 9.2958.46 ± 7.960.232
区别0.061
嗯1174
中等885038
可怜的622438
TNM阶段（AJCC） c（c）<0.001***
我31256
二1035053
三27621
淋巴结转移<0.001***
否定614813
积极的1003367
旁侵犯0.641
否定21129
积极的1406971
长期吸烟d日0.093
不1416774
是的20146
高脂肪饮食0.269
不1387266
是的23914
慢性胰腺炎0.831
不1356768
是的261412
缩写：SD=标准偏差；TNM=肿瘤淋巴结转移；美国癌症联合委员会。一缺口试验（年龄除外），*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。b条未配对t试验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。c（c）患者根据第8版AJCC癌症TNM分类进行分期。d日长期吸烟（持续时间≥29年）。

原代细胞分离培养

从胰腺导管癌和相应的非癌组织中分离出癌相关成纤维细胞（CAF）和原代正常成纤维细胞。在中山纪念医院和广东省人民医院的知情同意下，收集了新分离的手术切除标本。为了分离CAF，将癌样本切割（0.5 cm三)使用无菌手术刀从PDAC组织的核心部分取出。部分分离标本用于组织学检查以确认诊断，剩余组织用胶原酶消化介质（DMEM/F12、胶原酶消化125单位/mg、胰岛素10 mg/mL、氢化可的松0.5 mg/mL、青霉素100 U/mL和链霉素100 mg/mL）切碎并分离[22]. 样品消化30分钟，然后在10%FBS/DMEM中淬火。然后将分离的组织在37°C下在6厘米的培养皿上培养10分钟，无需摇动。将富含基质细胞的上清液收集在新管中，并在250 g下离心5分钟。为了分离NF，使用了类似的解剖病理学技术，从原发性PDAC肿瘤肿块远端至少3cm的区域提取新鲜分离的正常邻近胰腺组织[23]. 所有样本均取自手术切除，而非手术内活检。原代成纤维细胞在37°C的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM，GBICO）中培养，其中含有15%胎牛血清（FBS，GIBCO）和1%青霉素/链霉素，在含5%CO的湿空气中培养2.

对于人类PDAC细胞系培养，PANC-1和MiaPaCa-2购自美国型培养物收集中心（ATCC，Manassas，VA）。然后在37°C和5%CO条件下，在补充有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养细胞2.

流式细胞术分析

为了鉴定成纤维细胞群，使用CD31-FITC（4220516，BD Biosciences，美国）、CD45-PE/Cy7（561868，BD bioscience，美国）和CD326（EPCAM）-PE（2088498，Invitrogen，美国。PDGFRα（3174，CST）和α-SMA（ab32575，Abcam）用于区分iCAF和myCAF。

RNA分离和定量实时PCR（qRT-PCR）

使用TRIzol（美国Life）分离总RNA，并使用PrimeScript RT试剂盒（日本塔卡拉DRR037A）进行反转录。然后，使用TB Green Premix Ex TaqTM试剂盒（RR820A，日本塔卡拉），以GAPDH或U6作为内部对照，在Light Cycler 480检测系统（瑞士罗氏）上通过qRT-PCR扩增cDNA。第2个-∆∆CT方法用于计算细胞内相对基因表达水平。

对于组织中的表达，首先通过∆CT方法将水平归一化为GAPDH表达。为了分析circCUL2、miR-203a-3p、IL6和Myd88的临床意义，将161例PDAC患者的组织分为低表达组和高表达组。这些基因的标准化表达水平（∆CT）小于或等于中位数的样本被归类为低表达组，而水平大于中位数的则被归类为高表达组。

对于绝对定量，1×106NFs和CAFs细胞用于拷贝数分析。通过参考标准的10倍梯度稀释进行绝对定量。基于标准物的测量循环阈值（CT）值和已知的标准物浓度，我们建立了对数（拷贝数）和CT值的标准曲线。标准曲线用于推断NFs和CAF中circCUL2和miR-203-3p的分子数。

补充表S中列出了所有引物1.

核糖核酸酶R消化和放线菌素D测定

对于RNase R消化测定，使用或不使用5U/µg RNase R（RNR07250，Epicenter Technologies）处理NFs和CAFs的总RNA，并在37℃下孵育30分钟。对于放线菌素D分析，或总RNA用2µg/mL放线菌素D（美国西格玛公司）处理0 h、4 h、8 h、12 h和24 h。用qRT-PCR检测circCUL2和CUL2的表达水平。实验进行了三次。

质粒构建和转染

circCUL2由IGE（中国广州）克隆到pCD-ciR载体中。IGE（中国广州）合成了circCUL2、MyD88 3'非翻译区（UTR）和突变荧光素酶报告子的荧光素素酶报告质粒。siRNA和miRNA模拟物或抑制剂购自IGE（中国广州）。根据制造商的方案，使用Lipofectamine 3000（Invitrogen，美国）转染质粒和寡核苷酸。补充表S提供了寡核苷酸的靶向序列2.

来自人类NF和CAF的条件培养基

转染后，NFs和匹配的CAF分别在相同密度的25mL培养瓶中培养。48小时后收集上清液并离心至去除的细胞颗粒，然后将条件培养基（CM）储存在-80°C或与PANC-1或MiaPaCa-2孵育48小时。

5-乙炔基-20-脱氧尿苷（EdU）测定

根据制造商的说明，使用BeyoClick EdU-555检测试剂盒（Beyotime，中国上海）通过EdU测定法测量细胞增殖。将具有指定处理的PDAC细胞接种到24孔板中，然后用50µM EdU培养2小时。然后用4%多聚甲醛固定细胞，并依次用阿波罗反应鸡尾酒和Hoechst 33342密封。所有图像都是用荧光显微镜拍摄的。

集落形成分析

500个经指定处理的PDAC细胞接种到6孔板中并培养2周。然后将菌落在4%多聚甲醛中固定20分钟，然后用0.1%结晶紫染色。然后人工计数菌落。进行了三个不同的独立实验。

伤口愈合分析

将经过指定处理的PDAC细胞接种到24孔板中。24小时后，用20µl移液管尖端打伤每口井。用倒置显微镜在0和36小时的时间点拍摄细胞迁移。进行了三个不同的独立实验。

Transwell分析

在装有或不装有Matrigel（美国纽约州Matrigel-BD biosciences）的顶部培养箱中，用200µl无血清培养基培养预处理细胞。将600µl完整培养基添加到底部隔间。孵育18小时后，去除顶室上表面的细胞，将侵入细胞固定并用结晶紫染色。用光学显微镜计数并捕获入侵细胞的数量。进行了三个不同的独立实验。

细胞因子阵列

根据制造商的说明，使用蛋白质组分析器人类XL细胞因子阵列试剂盒（R&D Systems，ARY022B，USA）评估成纤维细胞分泌的细胞因子。简言之，400µl所示NF培养基与阵列膜孵育过夜。然后，添加检测抗体鸡尾酒和链霉亲和素HRP。扫描X光片上的细胞因子点。

酶联免疫吸附试验

根据制造商的说明，使用人IL6 ELISA试剂盒（SEKH-0013，Solarbio，中国）测定细胞因子的浓度。简而言之，将100µl指定的NF培养基与平板在37℃下培养90分钟。然后依次加入检测抗体、链霉亲和素HRP和TMB。使用SPARK 10 M分光光度计（奥地利帝肯）在450 nm处测量每个孔的吸光度。

Western印迹

使用RIPA裂解缓冲液（中国CWBIO）从细胞中提取蛋白质，然后使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶并转移到聚偏二氟乙烯膜。相应的一级抗体包括MyD88（1:1000，4283，CST）、STAT3（1:1000、9139，CST添加到膜中。使用HRP结合的二级抗体。免疫反应带由ECL检测系统（德国密理博）检测并由Chemi XT4拍摄。

细胞质和核RNA的分离

根据制造商的说明，使用NE-PER核和细胞质提取试剂（美国Thermo Scientific）分离CAF的细胞质和核RNA。然后，用qRT-PCR测定细胞质和细胞核的比率。U6为核对照，GAPDH为细胞质对照。

荧光原位杂交（FISH）

根据制造商的说明，使用原位杂交试剂盒（中国广州基因制药公司）进行FISH。将FAM标记的circCUL2和Cy3标记的hsa-miR-203a-3p探针（中国广州基因制药公司）与细胞在37℃下杂交过夜。所有图像均由共焦显微镜捕获。补充表S中提供了探针的目标序列2.

RNA下拉分析

生物素化探针由IGE（中国广州）合成。约1×107收集并裂解CAF和NF，然后用生物素化探针或寡聚探针在4℃培养过夜。添加链霉亲和素磁珠（Invitrogen，美国），然后培养3小时。通过TRIzol分离RNA载体并进行qRT-PCR分析。

荧光素酶报告试验

将circCUL2/MyD88野生型或突变质粒和miR-203a-3p模拟物共同转染到CAF细胞中。然后将转染的细胞接种到96个平板中，并根据制造商的说明，通过双荧光素酶报告分析系统（美国Promega）测定荧光素素酶活性。

动物实验

动物实验按照华南理工大学动物实验研究伦理委员会批准的指南进行。从华南理工大学购买4至5周龄BALB/c裸鼠。

对于肺转移模型，100µL 5×10悬浮液6将PBS中稳定表达荧光素酶（luc-PANC-1/luc-MiaPaCa-2）的PANC-1细胞或MiaPaCa-2注入BALB/c裸鼠尾静脉。将小鼠随机分为三组，分别注射luc-PANC-1或luc-MiaPaCa-2，条件培养基孵育（1）用空载体转导48小时的NFs，（2）用circCUL2载体转导的NFs 48小时，（3）在IL6中和抗体（50 ng/mL，MAB206，R&D）存在下，用circCUL2载体转导NFs 48小时。30天后，用体内成像系统（IVIS Lumina XR系列III）对小鼠进行成像。切除肺组织，通过苏木精-伊红（HE）染色检查转移灶。

对于原位模型，小鼠被随机分为三组：（1）每三天用PBS处理一次的luc-tumor细胞/空载体转导NFs，（2每三天一次。用氯胺酮（100 mg/kg）和甲苯噻嗪（10 mg/kg）麻醉BALB/c裸鼠。左侧肋下切口1cm暴露胰腺，并用50µL的luc肿瘤细胞/指示的NFs悬浮液（1:1，1×106)在PBS中注射30-G针头。原位植入术后，用单丝缝合缝合切口。30天后，用体内成像系统（IVIS Lumina XR Series III）对小鼠进行成像，以评估原发肿瘤的大小和转移。

对于患者来源的异种移植物（PDX）小鼠模型，将从3名患者获得的新鲜PDAC样品切成小块，然后植入4周龄NSG小鼠（F1）的皮下。从F1小鼠中取出异种移植物，切成小块，然后再植于其他小鼠（F2）。当肿瘤达到1500毫米左右时三将其切除，再次切成小块，然后再植于其他小鼠（F3）。异种移植后7天达到约100 mm三，F3小鼠被随机分为三组（每组5只），并分别给予：（1）体内优化si-Control（50 mg/kg，RiboBio，补充表S2)每三天静脉注射一次，持续3周；（2） 体内优化的si-circCUL2（50 mg/kg，RiboBio，补充表S2)每3天静脉注射一次，持续3周；（3） 针对IL6的中和抗体。肿瘤体积（长×宽2/2） 每6天监测一次。

转录组测序

按照制造商的程序，使用TRIzol（美国Life）分离和纯化总RNA。经过安捷伦2100生物分析仪（美国安捷伦）和纳米光度计（德国Implen）的质量检查，从1µg总RNA中去除了核糖体RNA。按照制造商的协议，使用VAHTS通用V6 RNA-seq Illumina文库制备试剂盒（中国Vazyme）构建lncRNA文库。根据广州华银健康医疗集团有限公司（中国广州）供应商推荐的方案，在Illumina Novaseq 6000（美国Illuminia公司）上以150PE模式对每个库进行测序。

统计分析

使用GraphPad Prism 8.0将所有实验数据表示为平均值±标准偏差（SD）。参数变量之间的差异通过Student t检验或单因素方差分析（ANOVA）确定，非参数变量通过Mann-Whitney U检验确定。生存率的统计意义通过Kaplan-Meier分析和log-rank检验进行评估，相关分析通过双边Pearson相关进行。通过cox回归对相对风险进行多元分析。相关分析采用双边皮尔逊相关检验。以p<0.05作为统计学意义的指标。

结果

人CAF和PDAC组织中circCUL2的鉴定及其临床意义

为了确定成纤维细胞激活中的关键circRNAs，我们首先从人类胰腺癌和配对正常胰腺组织中分离出CAF和NFs。NFs和CAF的特征通过形态学、western blotting、免疫荧光和流式细胞术进行了确认（图S1A-D）。接下来，我们对五个CAF和三个配对NF（GSE172096）进行了下一代测序，并在CAF中鉴定了50个上调的circRNA（图1A）。qRT–PCR分析证实，circCUL2（hsa_circ_0000234）是前30位候选基因中上调最多的circRNA（补充表S三)与NF相比，在CAF中显著上调约4倍（图1B） ●●●●。根据circBase，circCUL2由CUL2基因的外显子2、3和4生成，长度为339nt(http://www.circbase.org/). 对circRNADb数据库的分析预测，circCUL2的蛋白质编码潜力相对较低。我们通过Sanger测序（图1C）。此外，凝胶电泳显示circCUL2只能通过不同的引物从cDNA中扩增，而不能从基因组DNA中扩增（图1D） ●●●●。核糖核酸酶R和放线菌素D处理表明，circCUL2对核糖核酶R的抗性更强，降解速率低于CUL2 mRNA（图1E-F）。

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CAFs中circRNA circCUL2的鉴定。 A类与NF相比，集群热图显示CAF中上调的circRNAs。选择折叠变化>2和p<0.05的circRNAs作为显著差异。 B类qRT-PCR分析20对CAF和匹配NF中的circCUL2。C类显示circCUL2的基因组位置和剪接模式的示意图。通过sanger测序证实了circCUL2的后拼接连接（红色箭头）。 D类用收敛和发散引物扩增NFs和CAF的cDNA和gDNA。GAPDH作为阴性对照。 E类qRT-PCR分析RNase R处理的NF和CAF中的circCUL2和linear CUL2F类qRT-PCR分析在指定时间点用放线菌素D处理的NF和CAF中的circCUL2和linear CUL2。 克通过RNA FISH检测circCUL2在胰腺癌组织中的定位。CK19显示癌细胞。比例尺，50μm。 H（H）与配对NAT相比，161例PDAC组织中circCUL2的相对表达。我-JcircCUL2表达水平与LN状态的相关性分析(我)和肿瘤分期(J型).K（K）-L（左）circCUL2表达水平与OS相关性的Kaplan-Meier分析(K（K）)和DFS(L（左）)PDAC患者。以circCUL2表达的中位数作为截止值。（M）PDAC组织和正常组织中circCUL2的ROC曲线分析。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。**p<0.01和***p<0.001（双尾学生t检验）

临床PDAC组织中circCUL2的RNA FISH显示，circCUR2位于基质中，而不是癌细胞中（图1G） ●●●●。因此，circCUL2在基质中的表达与在整个肿瘤组织中的表达相同。然后，我们分析了161例PDAC患者队列中circCUL2的表达水平。PDAC组织中circCUL2的表达显著高于配对正常邻近组织（NAT）（图1H）。基于circCUL2水平的临床病理参数分析显示，circCUR2的高表达与淋巴结转移和临床晚期呈正相关（图1I-J；表1). 此外，Kaplan-Meier分析表明，高circCUL2水平的PDAC患者的OS和DFS较差（图1K-L）。此外，多变量分析显示，circCUL2水平和长期吸烟与OS和DFS独立相关（表2和​和3）。三). 受试者操作特征（ROC）曲线分析表明，circCUL2具有临床诊断价值（图1M）。总之，我们的发现表明，circCUL2作为一种稳定的circRNA，可能与PDAC进展有关。

表2

PDAC患者总生存率（OS）的单变量和多变量分析（n=161）

变量特点单变量分析多元分析
人力资源 95%置信区间 p值 人力资源 95%置信区间 p值
年龄 <60（参考）
≥ 601.0300.745-1.4250.857
性别 男（参考）
女性0.8850.640-1.2250.459
区别 井（参考）
中等1.8771.084-3.2510.0591.9960.951-4.1910.068
可怜的2.4461.434-4.1740.007**2.3311.075-5.0550.032*
TNM阶段 I（参考）
二1.1780.786-1.7650.4390.8260.524-1.3040.413
三1.9261.069-3.4700.011*1.1160.607-2.0520.723
淋巴结转移 一 阴性（参考）
积极的1.7311.251-2.395<0.001***
旁侵犯 阴性（参考）
积极的1.5540.999-2.4180.087
长期吸烟 b条 否（参考）
是的1.7440.970-3.1360.018*2.1021.271-3.4760.004**
高脂肪饮食 否（参考）
是的1.3430.818-2.2030.191
慢性胰腺炎 否（参考）
是的1.4590.892-2.3870.081
circCUL2表达式 低（参考）
高2.2221.575-3.133<0.001***2.3741.645-3.426<0.001***
缩写：HR=危害比；95%置信区间=95%置信区间；TNM=肿瘤淋巴结转移；ref=参考。一由于淋巴结转移包括在TNM阶段，所以我们没有将其纳入多变量分析。b条长期吸烟（持续时间≥29年）。Cox回归分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

表3

PDAC患者无病生存率（DFS）的单变量和多变量分析（n=161）

变量特点单变量分析多元分析
人力资源 95%置信区间 p值 人力资源 95%置信区间 p值
年龄 <60（参考）
≥ 601.1250.820-1.5450.461
性别 男性（参考）
女性0.8740.637-1.2000.402
区别 井（参考）
中等1.8781.112-3.1710.047*1.6880.862-3.3060.127
可怜的2.1311.251-3.6300.020*1.8240.903-3.6880.094
TNM阶段 I（参考）
二1.2790.867-1.8860.2360.9960.642-1.5440.986
三1.7440.980-3.1040.032*1.1420.629-2.0750.662
淋巴结转移 一 阴性（参考）
积极的1.6271.185-2.2340.002**
旁侵犯 阴性（参考）
积极的1.2690.824-1.9550.310
长期吸烟 b条 否（参考）
是的1.7880.989-3.2320.013*2.1511.305-3.5450.003**
高脂肪饮食 否（参考）
是的1.3950.845-2.3040.136
慢性胰腺炎 否（参考）
是的1.4710.899-2.4070.073
circCUL2表达式 低（参考）
高1.9821.418-2.771<0.001***2.0731.460-2.942<0.001***
缩写：HR=危害比；95%置信区间=95%置信区间；TNM=肿瘤淋巴结转移；ref=参考。一由于淋巴结转移包括在TNM阶段，所以我们没有将其纳入多变量分析。b条长期吸烟（持续时间≥29年）。Cox回归分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

circCUL2对诱导和维持CAF原癌特性至关重要

为了研究circCUL2是否影响CAF的原癌活性，我们构建了circCUR2过表达载体pcDNA3.1-circCUL2和两个靶向circCUL2后拼接连接的siRNA。将pcDNA3.1-circCUL2载体成功转染到NFs中，而不增加circCUL2亲本基因的mRNA和蛋白表达（图S2A-B）。将这两个siRNAs转染到CAF中，以在不改变CUL2 mRNA和蛋白表达的情况下敲除circCUL2（图S2A-B）。EdU分析和集落形成分析表明，来自circCUL2转导NFs的条件培养基显著增强了PANC-1细胞和MiaPaCa-2细胞的增殖和克隆能力（图2A、，2C和图S2C、，2E） ●●●●。来自圆形CUL2-沉默CAF的条件培养基产生了相反的效果（图2B和D以及图S2D、，2F）。此外，伤口愈合试验和转导实验表明，来自circCUL2转导NFs的条件培养基显著增加了PANC-1细胞和MiaPaCa-2细胞的迁移和侵袭能力（图2E、G和图S2G、，2I） ，在沉默circCUL2后显著降低（图2F、，2H和图S2H、，2J）。此外，细胞活性和凋亡分析表明，来自circCUL2转导NFs的条件培养基显著增强了PDAC细胞的吉西他滨抵抗，而沉默circCUL2后会再次产生吉西他宾抵抗（图S3A-D）。这些实验表明，circCUL2转导的NFs显示出CAF的原癌特性，而circCUL2-silenced CAF则失去了其原癌特性。

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circCUL2对于维持体外CAF的促肿瘤活性至关重要。 A类-B类EdU分析用来自circCUL2-过表达NFs或circCUL2-沉默CAF的条件培养液处理的PANC-1细胞的增殖。比例尺：100μm。 C类-D类用条件培养基circCUL2过表达NFs或circCUL2沉默CAFs处理的PANC-1细胞中的集落形成测定。 E类-F类用条件培养基circCUL2-过表达NFs或circCUL2-沉默CAF处理的PANC-1细胞的划痕伤口愈合试验。比例尺：100μm。 克-H（H）Transwell分析用条件培养基circCUL2-过表达NFs或circCUL2-沉默CAF处理的PANC-1细胞的迁移和侵袭。比例尺：100μm。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。**p<0.01和***p<0.001（双尾学生t检验）

circCUL2-转导的NFs显示iCAF表型并通过IL6促进PDAC进展

为了阐明circCUL2如何赋予NFs原癌特性，我们对NFs和circCUL2转导的NFs进行了mRNA测序（GSE172272，图S4A） ●●●●。KEGG和基因集富集分析（GSEA）显示了circCUL2转导NFs中炎症的明显富集特征，这与奥赫隆德等人确定的iCAF亚型一致（图三A-B，图S4B-C）[14]. 此外，qRT-PCR显示iCAF标记（IL6、TNFα和IL1α）的表达，而不是myCAF标记物（Acta2和Axin2）的表达在circCUL2转导的NFs中诱导（图三C-D）。流式细胞术分析表明，iCAF表面标记物PDGFRα在circCUL2转导的NFs中过度表达，而myCAF标记物α-SMA的表达没有改变（图三E） ●●●●。

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circCUL2通过IL6调节CAF的表型可塑性并促进PDAC进展A类成纤维细胞受影响特征的基因集富集分析（GSEA）（circCUL2与对照）。B类对照组circCUL2过度表达NF中炎症CAF（iCAF）信号的GSEA图。C类-D类qRT-PCR分析iCAF标记物（IL6、TNF-α和IL1α）和myCAF标记（Acta2和Axin2）在circCUL2过表达NFs中的表达。E类流式细胞术分析circCUL2过度表达NFs中PDGFRα和α-SMA的表达。 F类-H（H）circCUL2-过表达NFs和对照的代表性细胞因子阵列（n=3）。箭头表示细胞因子有显著变化，qRT-PCR和ELISA进一步证实了这些变化。我-L（左）EdU分析(我)，菌落形成(J型)、划伤愈合分析(K（K）)和transwell分析(L（左）)条件培养基circCUL2-过表达NFs或抗IL6处理的PANC-1细胞。比例尺，100μm。 M（M）PANC-1细胞中STAT3和p-STAT3的western blot分析。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。**p<0.01和***p<0.001（双尾学生t检验）

此外，我们进行了细胞因子阵列以比较NF和circCUL2转导NF的细胞因子谱。结果表明，circCUL2转导的NFs大量分泌细胞因子，qRT-PCR和ELISA进一步证实了这一点（图三F-H）。其中IL6增幅最大。EdU、集落形成、伤口愈合和transwell分析表明，用IL6中和抗体处理来自circCUL2转导NF的条件培养基，可在体外大大消除circCUL2转导NFs的原癌活性。与这些发现一致，circCUL2转导的NFs中的拮抗剂IL6几乎完全消除了它们对促进肿瘤细胞增殖和侵袭的作用（图三I-L，图S4D-G）。因为p-STAT3是IL6最常见的目标[13,24]，我们进行了western blotting，发现在PANC-1细胞和MiaPaCa-2细胞中，用来自circCUL2转导NFs的条件培养基处理后，p-STAT3表达上调（图三M，图S4H） ●●●●。这些结果表明，circCUL2激活NF进入iCAF亚型，并通过显著增强IL6分泌促进PDAC的进展。

circCUL2-转导的NFs在体内促进PDAC细胞的肿瘤发生和转移

为了确定circCUL2转导的NFs在体内PDAC细胞肿瘤发生和转移中的作用，我们构建了两种不同的小鼠模型：肺转移模型和原位异种移植模型。为了构建肺转移模型，在与空载体或circCUL2转导的NF体外共培养48小时后收集luc-PANC-1细胞或luc-MiaPaCa-2细胞。活体荧光成像结果显示，与对照组相比，circCUL2组的肺部荧光强度显著增加（图4A-B，图S5A-B）。此外，与对照组相比，circCUL2组的肺转移灶更多，转移发生率更高（图4C-D，图S5C-D）。值得注意的是，将针对IL6的中和抗体添加到circCUL2转导的NFs和肿瘤细胞的共培养系统中可以抑制癌细胞转移（图4A-D，图S5A-D）。对于原位异种移植模型，将luc-PANC-1细胞或luc-MiaPaCa-2细胞与空载体或circCUL2转导的NF共同注射到小鼠胰腺中（图S5E）。结果表明，与对照细胞相比，circCUL2转导的NFs显著增加了肿瘤发生率（图4E-F，图S5F-G）。此外，circCUL2组的腹部转移率高于对照组（图4G-H，图S5H-I），而抗IL6抗体治疗显著抑制肿瘤生长和腹部转移（图4E-H，图S5F-I）。

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circCUL2-过表达NFs促进体内PDAC进展。 A类尾静脉注射用条件培养基处理的luc-PANC-1细胞4周后小鼠肺组织的代表性生物发光图像、肺和HE染色（每组n=8）。比例尺，100μm。 B类各组的相对发光强度。 C类每肺转移结节数的直方图分析。 D类各组肺转移率（卡方检验）。 E类-F类显示了第30天的代表性生物发光图像和发光强度的直方图分析（n=6）。 克计算指定组的腹部转移率（卡方检验）。 H（H）各组尸检原位模型的代表性图像。红色箭头表示原发肿瘤；S、 脾脏；T、 原发性肿瘤；M、 转移。 我来自5只小鼠中2名患者的PDX图像。 (J型)指示组肿瘤生长曲线（n=5）。 K（K）治疗前后小鼠PDX中circCUL2水平的qRT-PCR分析。 L（左）PDGFRα和IL6的IHC代表性图像。比例尺，100μm。数据表示为平均值±SD。**p<0.01和***p<0.001（双尾学生t检验）

为了模拟PDAC患者的真实肿瘤微环境，我们建立了PDX模型，并使用IL6中和抗体或体内优化的si-circCUL2进行治疗（图S5J-L）。我们发现用si-circCUL2和抗IL6抗体治疗显著降低PDX生长（图4I-J）。qRT-PCR和IHC分析表明，si-circCUL2处理显著抑制了circCUL2和IL6水平。（图4K-L）。总之，这些结果表明，circCUL2通过激活iCAF表型和IL6的产生，在PDAC肿瘤发生和转移中发挥重要作用。

circCUL2在成纤维细胞中充当miR-203a-3p海绵

鉴于circRNAs的功能通常与其亚细胞定位相关，我们接下来进行FISH和亚细胞分馏分析以确定circCUL2在CAF中的定位。结果表明，circCUL2主要分布在细胞质中，这表明circCUR2可能起到miRNA海绵的作用（图5A-B）。为了探索与circCUL2结合的潜在miRNA，使用了circInteractome，它预测了13个miRNA（图5C）。在这些候选miRNAs中，只有miR-203a-3p在NF和CAF中被circCUL2富集（图5D-E）。RNA折叠(网址：http://rna.tbi.univie.ac.at/)用于预测circCUL2和miR-203a-3p之间的结合位点（图5F），双荧光素酶报告分析进一步证实miR-203a-3p与circCUL2结合。测定结果显示，与miR-NC组相比，miR-203a-3p模拟物显著降低了circCUL2野生型（circCUL2-wt）组的萤光素酶活性，但对circCUL2突变体（circCUL2-mut）组的萤光素酶活性没有影响（图5G-H）。因此，生物素标记的miRNA下拉分析验证了circCUL2和miR-203a-3p的吸收（图5一） ●●●●。此外，miRNA下拉分析表明，miR-203a-3p不能与线性CUL2结合，并且miR-203a-3p不影响线性CUL2的mRNA和蛋白质水平（图S6A-C）。此外，FISH分析显示circCUL2和miR-203a-3p在细胞质中共定位（图5J）。为了支持circCUL2可以作为ceRNA来海绵miR-203a-3p，在NF和CAF中通过绝对定量检测circCUL2和miR-203a-3p的拷贝数，两者的数量级相同（图S6D-E）。这些结果表明，circCUL2具有miR-203a-3p海绵的功能。

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circCUL2是miR-203a-3p的海绵。 A类FISH检测CAFs中circCUL2的亚细胞定位。比例尺，50μm。 B类qRT-PCR检测CAF细胞质和细胞核中circCUL2的表达。GAPDH和U6 RNA分别用作细胞质和核RNA标记。 C类CircInteractome预测的circCUL2潜在靶miRNAs的示意图。 D类-E类对NF和CAF中富含生物素标记的circCUL2探针的指示miRNAs进行qRT-PCR分析。 F类RNAlifold预测的circCUL2的二级结构图和可能与miR-203a-3p结合的位点。 克-H（H）荧光素酶报告子分析用于检测与miR-203a-3p模拟物共转染的circCUL2-WT和circCUL2-mut（miR-203a-3p结合位点突变）荧光素酶报告子的荧光素素酶活性。N.S.，无显著差异。 我NFs和CAF中富含生物素标记miR-203a-3p探针的circCUL2的qRT-PCR分析。J型FISH检测CAF中circCUL2和miR-203a-3p的亚细胞定位。比例尺，50μm。数据表示为平均值±SD。**p<0.01和***p<0.001

为了验证miR-203a-3p的生物学功能，我们将miR-203a-3p抑制剂转染到NFs中，并将miR-03a-3p模拟物转染到CAF中。克隆形成和跨阱分析表明，用miR-203a-3p敲除NFs的条件培养基培养可促进PANC-1细胞和MiaPaCa-2细胞的增殖和迁移能力，而用miR-205a-3p过度表达CAF的条件培养液培养可抑制增殖和迁移（图6A-B，图S7A-B）。此外，miR-203a-3p抑制剂增加了IL6的生成，而其模拟物减少了IL6（图6C-D）。

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MyD88是miR-203a-3p的直接下游靶基因。 A类-B类用来自miR-203a-3p沉默NFs或miR-203a-3p过表达CAF的条件培养基处理的PANC-1细胞的集落形成和跨孔分析。比例尺：100μm。C类-D类ELISA检测从miR-203a-3p沉默NF或miR-203a-3p过度表达CAF中检测条件培养基的IL6水平。 E类miR-203a-3p潜在下游靶基因的Venn分析，由miRTarbase、miRWalk和Tarbase预测。 F类-克对指定NF和CAF中筛选的miR-203a-3p下游靶基因进行qRT-PCR分析。 H（H）荧光素酶报告子分析用于检测与miR-203a-3p模拟物共转染的MyD88野生型（MyD88-wt）和miR-203a-3p结合位点突变的MyD86（MyD88-mut）荧光素酶报告子的荧光素素酶活性。N.S.，无显著差异。 我-J型在NFs中circCUL2过表达或miR-203a-3p沉默，或在CAFs中circCUL2沉默或miR-203a-3p过表达后MyD88、p65、pp65、IKBα和p-IKBα表达的蛋白质印迹分析。GAPDH作为加载控制。数据表示为平均值±SD。**p<0.01和***p<0.001

MyD88是miR-203a-3p的下游靶点

miRNAs通过与mRNA的3'UTR相互作用调节基因表达[25]. 通过miRTarBase、miRWalk和TarBase预测miR-203a-3p的下游靶基因，并基于NCBI数据库通过功能分析筛选出6个候选基因进行进一步验证（图6E） ●●●●。qRT-PCR显示只有MyD88受到circCUL2和miR-203a-3p的调节（图6F-G）。我们发现MyD88的3'UTR含有与miR-203a-3p互补的特定序列（图6H）。荧光素酶分析表明，miR-203a-3p模拟物显著降低了MyD88 3'UTR-野生型（MyD88-wt）报告子的荧光素酶活性，但没有降低MyD88 3’UTR-突变（MyD88-mut）报告子（图6H）。MyD88在NF-κB信号转导中起关键作用[26]. Western blot分析表明，过度表达circCUL2或沉默miR-203a-3p显著增加NFs中MyD88及其下游信号转导子NF-κB的水平，而沉默circCUL2或过度表达miR-203a-3p在CAF中的作用相反（图6I-J）。这些结果表明MyD88是miR-203a-3p的下游靶点。

circCUL2通过MyD88/NF-κB/IL6轴促进增殖和迁移

为了阐明circCUL2是否通过海绵miR-203a-3p增强了MyD88的表达，我们通过在NFs中联合转染circCUR2过表达质粒和miR-203a-3p模拟物或在miR-203a3p抑制剂存在下沉默circCUL2来进行拯救试验。Western blot分析表明，miR-203a-3p模拟物消除了circCUL2过度表达对NFs中MyD88、pp65和p-IkBα表达的促进作用，而miR-203a-3p抑制剂逆转了CAF中circCUL2沉默的抑制作用（图7A-B）。此外，ELISA显示miR-203a-3p模拟物显著逆转了circCUL2上调诱导的NFs中IL6分泌的增加，而miR-203a-3p抑制剂显著逆转了CIRCUL2抑制诱导的CAF中IL6释放的减少（图7C-D）。类似地，集落形成和跨阱分析显示，miR-203a-3p模拟物显著逆转了NFs中circCUL2过度表达诱导的细胞增殖和迁移增加，而miR-203a-3p抑制剂逆转了circCUL2缺失诱导的细胞增生和迁移抑制（图7E-F，图S8A-B）。

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circCUL2通过MyD88/NF-κB/IL6轴促进增殖和迁移。A类-D类联合转染NFs中的circCUL2过表达质粒和miR-203a-3p模拟物或CAF中的ciRCUL2-siRNA和miR-205-3p抑制剂，检测MyD88、p65、pp65、IKBα和p-IKBα的蛋白水平以及IL6的分泌水平E类-F类将NFs共转染的circCUL2过表达质粒与miR-203a-3p模拟物或CAF共转染circCUL2-siRNA和miR-203-3p抑制剂的条件培养液处理PANC-1细胞48小时。通过集落形成和跨阱实验检测PANC-1的增殖和迁移能力。 克-J型在NFs中联合转染circCUL2过表达质粒和MyD88 siRNA，或在CAF中转染ciRCUL2-siRNA和MyD88-过表达质粒，检测MyD88、p65、pp65、IKBα和p-IKBα的蛋白水平以及IL6的分泌水平K（K）-L（左）将NFs与MyD88 siRNA共转染的circCUL2过表达质粒或CAFs与MyD 88过表达质粒共转染circCUL2 siRNA的条件培养液处理PANC-1细胞48 h。通过集落形成和跨阱实验检测PANC-1的增殖和迁移能力。数据表示为平均值±SD。**p＜0.01***p<0.001

接下来，我们进一步测试MyD88/NF-κB通路是否参与circCUL2介导的PDAC进展。Western blot分析表明，强制表达circCUL2明显增加了p-65和p-IkBα的蛋白水平，而NFs中MyD88的抑制逆转了这种作用（图7G） ●●●●。类似地，circCUL2沉默显著降低了p-65和p-IkBα的蛋白表达，并且这种作用被CAFs中MyD88的过表达所逆转（图7H）。此外，ELISA显示，MyD88沉默强烈逆转了circCUL2上调诱导的NF中IL6分泌的增加，而MyD88过度表达显著逆转了ciRCUL2抑制诱导的CAF中IL6释放的减少（图7I-J）。因此，集落形成和t分析表明，MyD88沉默可显著逆转NFs中circCUL2过度表达诱导的细胞增殖和迁移增加，而MyD88过度表达可逆转circCUL2缺失诱导的细胞增生和迁移抑制（图7K-L，图S8C-D）。总之，我们的数据表明，circCUL2通过miR-203a-3p/MyD88/NF-κB/IL6轴促进PDAC的增殖和迁移。

PDAC患者circCUL2/miR-203a-3p/MyD88/IL6轴的临床意义

由于circCUL2在CAF中调节miR-203a-3p/MyD88/IL6轴并促进PDAC细胞的进展，我们接下来分析了161例PDAC患者队列中该调节轴的临床相关性，发现PDAC组织中miR-203a-3p的表达低于NAT（图8A）。miR-203a-3p的低表达与淋巴结转移和临床晚期呈正相关（图8B-C）。Kaplan-Meier分析表明，miR-203a-3p的低表达导致较差的OS和DFS（图8D-E）。同样，PDAC组织中MyD88表达上调，MyD88高表达与淋巴结转移和临床晚期呈正相关（图8F-H）。Kaplan-Meier分析表明，MyD88的高表达导致OS和DFS较差（图8I-J）。此外，circCUL2与miR-203a-3p呈负相关，与MyD88呈正相关（图S9A-B）。此外，IL6在PDAC组织中表达上调，并与淋巴结转移和临床晚期相关（图8K-M）。Kaplan-Meier分析显示IL6的高表达伴随着较短的OS和DFS（图8N-O）。此外，IL6与circCUL2呈正相关，与miR-203a-3p呈负相关（图S9C-D）。

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PDAC中circCUL2/miR-203a-3p/IL6轴的临床意义。A类,F类,K（K）miR-203a-3p的相对表达(A类)，MyD88型(F类)和IL6(克)161例PDAC组织与配对NAT比较B类-C类,克-H（H）,L（左）-M（M）miR-203a-3p之间的关联分析(B类-C类)，MyD88型(克-H（H）)和IL6(L（左）-M（M）)161例PDAC组织的表达水平、LN状态和肿瘤分期。 (D类-E类,我-J型,N个-O（运行）)miR-203a-3p相关性的Kaplan-Meier分析(D类-E类)，MyD88型(我-J型)和IL6(N个-O（运行）)161例PDAC患者的表达水平和OS或DFS。miR-203a-3p、MyD88和IL6表达的中位数用作截止值。 P（P）该模型揭示了circCUL2通过miR-203a-3p/MyD88/NF-κB通路激活iCAF表型和IL6生成促进PDAC恶性进展的机制。数据表示为平均值±标准差。*p<0.05和***p<0.001

总之，我们的数据支持一个模型，其中circCUL2通过miR-203a-3p/MYD88/NF-kB信号激活iCAF产生IL6，在PDAC进展中发挥重要作用（图8P） ●●●●。

讨论

由于高通量测序技术和生物信息学的发展，circRNAs在非编码RNA领域引起了越来越多的关注，并被发现和报道为各种生物过程的关键调节因子，包括多种癌症[27,28]. 目前，许多研究揭示了circRNAs在胰腺癌进展中的作用[29]. 最近，我们的团队报告称，circBFAR通过miR-34b-5p/MET/Akt轴促进PDAC的进展，而circNFIB1通过miR-486-5p/PIK3R1/VEGF-C轴抑制胰腺癌的淋巴管生成和淋巴转移[20,21]. 然而，对于circRNAs在PDAC TME中的作用和潜在机制知之甚少。在此，我们鉴定了原代分离的成纤维细胞中差异表达的circRNAs，并证明circCUL2在iCAF中高度表达，并且其在肿瘤组织中的富集与PDAC患者的预后相关。NFs中circCUL2的过度表达将细胞推向iCAF表型，然后iCAF通过分泌IL6促进PDAC的进展。从机制上讲，circCUL2作为ceRNA发挥作用，并调节miR-203a-3p/MyD88/NF-κB/IL6轴，从而进一步激活胰腺癌细胞中的STAT3信号通路，诱导PDAC的进展。关于circCUL2在胃肠道肿瘤中的作用，发现circCUR2促进肝癌的恶性肿瘤和转移[30]然而，最近有研究表明，它可能在胃癌中起到肿瘤抑制和顺铂敏感性介导的作用[31]. 我们的研究发现，circCUL2可以通过激活iCAF促进胰腺癌的铂耐药性，这与最近在胃癌中发现的结论不一致[31]. 这些发现表明，在TME复杂性的背景下，circCUL2在不同组织中的表达和生物功能具有异质性。据我们所知，这是第一份报告，深入了解了iCAF在PDAC中的circRNA-介导的表型转变的生物学意义，并强调circCUL2可能成为支持肿瘤生长的iCAF的新治疗靶点。

多年来，人们对胰腺癌细胞的遗传和表观遗传修饰机制进行了深入的研究，而复杂的TME尚不清楚。最近，circRNAs引起了极大的关注，其改变TME的潜在癌症相关机制正在逐渐被揭示。Zou等人通过对其中一种研究最多的circRNAs CDR1as进行全面的生物信息学分析表明，CDR1as可能在肿瘤组织的基质细胞和免疫细胞浸润中发挥特殊作用，并可以通过改变TME促进癌症进展[32]. 最近，Kristensen等人报告说，CDR1as在体内结肠癌细胞中无法检测到，但在肿瘤基质细胞中大量表达，这突出了空间解析TME中circRNAs表达模式的重要性[33]. 为了开发选择性靶向促肿瘤CAF的治疗方案，需要确定控制PDAC中CAF命运和功能的具体机制。我们首次探索了人PDAC组织原代成纤维细胞中circRNAs的潜在参与。根据新一代测序对人类PDAC邻近正常组织原发性CAF和NF中的circRNA进行分析，我们重点研究了circCUL2，气孔中高水平的circCUL2与淋巴结转移和晚期临床分期呈正相关，与OS和DFS独立相关。目前，许多研究表明，肿瘤基因表达与预后之间的相关性很少提供原位数据来评估靶基因表达的潜在肿瘤内异质性。尤其是PDAC，其成纤维细胞占肿瘤总量的90%[34]circRNAs在基质细胞中的表达模式还远未阐明。我们的研究首次将CAF中circRNA的表达与PDAC患者的预后联系起来，结果表明基质细胞中基因表达的异质性在肿瘤进展中也起着关键作用，这表明靶向TME中的circRNA有可能改善治疗结果。

对于circCUL2在成纤维细胞中的关键作用，我们的获得和丧失功能实验表明，circCUL2对维持CAF原癌特性至关重要，并且circCUR2向NFs的转导足以诱导以炎症表型为特征的独特CAF亚型。我们对NFs和circCUL2转导NFs中mRNA-seq的GSEA研究表明，炎症反应和IL6/JAK/STAT3信号的特征均显著增强。此外，qRT-PCR和流式细胞术检测均证实iCAF标记物（IL6、TNFα、IL1α和PDGFRα）激活，但myCAF标记（Acta2、Axin2和α-SMA）未激活。此外，细胞因子阵列和ELISA也证实了由circCUL2转导的NFs大量分泌的一组炎症细胞因子。有趣的是，我们的数据揭示了circCUL2过度表达的显著负富集和肌发生的特征。与Biffi等人的最新研究一致，IL1R1表达导致NF-κB/LIF/JAK/STAT活化和iCAF形成[15,35]. 此外，JAK抑制或肿瘤分泌的TGF-β显著增加了治疗肿瘤中myCAF/iCAF的比率，进一步证实了iCAFs和myCAFs是相互转换的细胞状态，而不是分化的终点[15]. 考虑到circCUL2诱导的级联反应在NF-κB/IL6信号通路激活中的关键作用，靶向circCUL2可能会将iCAF转化为更为肌纤维母细胞状态，这一状态先前被认为可以抑制肿瘤进展。

越来越多的报道表明，circRNAs总是作为有效的miRNA海绵来调节miRNA靶基因的表达。在我们的研究中，miR-203a-5p被选为circCUL2的候选靶miRNA，并且circCUL2/miR-203a-5p的相互作用通过FISH、RNA下拉和荧光素酶报告基因测定得到证实。有趣的是，一些研究确定miR-203为基质硬度重表达转录物[36–38]高硬度ECM导致TME中miR-203水平较低，增加乳腺癌风险[38]这表明miR-203在介导癌细胞与基质之间的串扰中起着关键作用。我们的研究首次证明了miR-203在NFs中的表达下调导致iCAF状态的激活和转变，并揭示了miR-203在基质细胞中介导的特异性信号转导。

三个数据库的预测结果交叉后，确定MyD88为miR-203a-3p的下游靶点，并通过qRT-PCR、荧光素酶分析和3'UTR突变实验进行了进一步验证。MyD88在NF-κB信号转导中起关键作用，并参与肿瘤诱导的细胞内和外炎症[39]. 大量研究表明，衔接蛋白MyD88通过作用于Toll样受体（TLR）下游或IL1家族，参与致癌，包括皮肤癌、肝癌、胰腺癌和结肠癌[39]. 最近，Biffi等人证明了IL1家族诱导的信号级联，导致NF-κB/JAK/STAT激活以产生iCAF，IL1受体拮抗剂可能是体内靶向iCAF的有效策略[15]. MyD88信号传导通常与IL1家族相关，它介导一种促炎症反馈机制，参与与癌基因激活、细胞转化和衰老相关的内在炎症[40]. 与这些发现一致，我们的研究强调了MyD88在激活NF-κB/IL6信号级联以介导iCAF的转变中的关键作用。尽管癌细胞中大量的细胞因子，如CCL18和IL1b，可能通过激活CAF亚群中的IKK启动NF-kB信号[41,42]TME中的大量反馈回路导致针对炎症因子的治疗策略失败。我们的研究表明了一种更有意义的策略，即通过circCUL2内源性拮抗MYD88。

作为一种经典的促炎途径，NF-κB信号传导被认为是癌症进展的标志和潜在的治疗靶点。近年来，NF-κB信号在介导癌细胞与基质相互作用中的作用逐渐被揭示[41]. 在肿瘤发生的早期癌前阶段，静止的成纤维细胞被激活以表达促炎基因特征，从而以NF-κB依赖的方式促进癌症进展[41]. 近70%的PDAC病例显示NF-κB激活[43]，多项研究表明，NF-κB的激活是iCAF形成所必需的[14–16]. 我们的研究提供了新的结果，即成纤维细胞中circCUL2表达的上调增加了MyD88的表达，MyD88是NF-kb通路上游的关键受体，从而促进了TME中各种促炎因子在生成iCAF中的作用。

在我们的研究中，我们发现IL6是circCUL2的关键下游介质。circCUL2诱导的iCAF通过增加IL6的分泌和进一步激活胰腺癌细胞中STAT3信号通路，促进PDAC的肿瘤发生和转移。先前的研究表明，iCAF分泌的IL6参与了PDAC小鼠细胞的增殖和侵袭[15,44]. 我们首次报道了circCUL2在促进IL6相关iCAF表型的发展中发挥关键作用。令人印象深刻的是，CAF分泌的IL6在胰腺癌中介导免疫抑制作用已逐渐被阐明。最近，Thomas等人证明IL6阻断剂通过促进辅助T细胞分化和增加CD8+T细胞向PDAC肿瘤小鼠的浸润来增强抗PD-L1治疗的疗效[45]. IL6还可以通过促进巨噬细胞和髓源性抑制细胞的分化以及驱动1型常规树突状细胞的凋亡来促进免疫抑制[46–48]. 由于circCUL2有助于胰腺癌iCAF表型的发展和细胞因子IL6的富集，因此需要进一步探索其在胰腺癌免疫抑制中的作用。IL6下游的信号转导包括STAT3、MAPK和PI3K致癌途径[13,49,50]. Marina等人发现IL6/Stat3通路被强烈激活，并有助于胰腺上皮内瘤变进展和PDAC的发展[13]. Zhang等人报告称，IL6能够通过激活MAPK信号级联，与Kras协同促进胰腺癌前病变的进展[51]. 我们的数据强调，IL6/STAT3通路是PDAC中iCAF原癌特性的关键介导者，但我们不排除其他通路的参与，因为这些下游信号通路形成一个复杂的调节网络以诱导协同效应[52]. 虽然最近的研究强调IL6/STAT3途径的作用[53]该网络中的其他信号通路，包括MAPK和PI3K，仍需进一步研究。

对于PDAC患者circCUL2/miR-203a-3p/MyD88/IL6轴的临床意义，我们发现肿瘤组织中circCUL2、MyD88和IL6的高表达与胰腺癌患者预后不良相关，而miR-203a-3G的高表达表明PDAC患者的OS和DFS更好。通过对circCUL2/miR-203a-3p/IL6轴进行相关分析，发现circCUR2与IL6（R=0.42，P<0.001）或MyD88（R=0.44，P<0.001。R值表明这些相关性不强（|R|<0.60）[54]这意味着基于p值的显著性可能得到大量样本的支持。这项研究的一个局限性是，基因的RNA水平是在组织样本中检测到的，而不是相应的原代成纤维细胞，这可能会影响相关性分析结果的准确性。原代分离细胞中的基因表达相关性分析可能为circCUL2/miR-203a-3p/MyD88/IL6轴的预后价值提供更有力的证据。组织中circCUL2的RNA表达水平可以在一定程度上区分胰腺癌组织和正常组织。通过检测胰腺癌患者和健康人血清中circCUL2的表达水平，可以进一步探讨circCUL2的临床翻译价值。

结论

总之，我们的观察结果表明，circCUL2在iCAFs中高度表达，并且其在肿瘤组织中的富集与PDAC患者的预后相关。circCUL2作为ceRNA发挥作用，调节miR-203a-3p/MyD88/NF-κb/IL6轴，诱导NFs转化为iCAF，从而进一步激活胰腺癌细胞中的STAT3信号通路，诱导PDAC的进展。这是首次报道揭示了circRNA-介导的iCAF表型转变的生物学过程，并为PDAC的进展建立了独特的成纤维细胞生态位。可能需要发现circCUL2/MyD88/NF-κb信号通路在激活和维持TME iCAF中的作用，以制定合理的策略，选择性地靶向PDAC中促肿瘤CAF。

补充信息

附加文件1。（19K，docx）

附加文件2。（18K，docx）

附加文件4。 （20K，docx）

附加文件5： 图S2。circCU2L siRNA和过度表达载体的特异性，与图。​图2。2（A）qRT-PCR分析转染circCUL2 siRNA和NF和CAF中过度表达载体后circCUL2和CUL2的表达。（B） Western bolt分析转染circCUL2载体的NFs和转染cickCUL2 siRNA的CAF中的CUL2。（C-D）EdU分析用来自circCUL2-over-expression NFs或circCUL-signing CAF的条件培养基处理的MiaPaCa-2细胞的增殖。比例尺：100μm。（E-F）用来自circCUL2-过表达NFs或circCUL2-沉默CAF的条件培养基处理的MiaPaCa-2细胞中的集落形成分析。（G-H）用来自circCUL2-过表达NFs或circCUL2-沉默CAF的条件培养基处理的MiaPaCa-2细胞的划痕伤口愈合试验。比例尺：100μm。（I-J）Transwell分析用来自circCUL2-过表达NFs或circCUL2-沉默CAF的条件培养基处理的MiaPaCa-2细胞的迁移和侵袭。比例尺：100μm。数据表示为平均值±SD。**p<0.01和***p<0.001。（12M，tif）

附加文件7： 图S4circCUL2激活iCAF表型，与图。​图3。三（A）circCUL2转导的NFs和空载体转导的NFs中不同表达基因的火山图。p<0.05和fold-change>2筛选不同表达基因。灰点表示基因没有显著差异表达，红点表示基因显著上调，绿色表示基因显著下调。（B） 在circCUL2转导的NFs中与癌症相关的不同表达基因的KEGG通路的富集。（C） 与对照组相比，circCUL2过表达NFs中炎症CAF（iCAF）和肌成纤维细胞样CAF（myCAF）特征的GSEA图。用来自circCUL2-过表达NFs或抗IL6的条件培养基处理的MiaPaCa-2细胞的（D-G）EdU分析（D）、集落形成（E）、划痕伤口愈合分析（F）和穿孔分析（G）。比例尺，100μm。（H） MiaPaCa-2细胞中STAT3和p-STAT3的western blot分析。数据表示为平均值±SD。***p<0.001（540万tif）

附加文件8： 图S5circCUL2-过表达NFs促进体内PDAC进展，与图。​图4。4（A）尾静脉注射用条件培养基处理的luc-MiaPaCa-2细胞4周后小鼠肺组织的代表性生物发光图像、肺和HE染色，如图所示（每组n=8）。比例尺，100μm。（B） 各组的相对发光强度。（C） 每肺转移结节数的直方图分析。（D） 各组肺转移率（卡方检验）。（E） 原位异种移植模型设计示意图。简而言之，将luc-PANC-1细胞或MiaPaCa-2与空载体或circCUL2转导的NF联合注射。注射后3天，每隔3天用IL6中和抗体（2mg/kg）治疗小鼠。植入后30天，通过体内成像系统检测原发肿瘤和转移瘤。（F-G）显示了第30天的代表性生物发光图像和每个生物发光强度的直方图分析（n=6）。（H） 计算指定组的腹部转移率（卡方检验）。（一） 各组尸检原位模型的代表性图像。红色箭头表示原发肿瘤；S、 脾脏；T、 原发肿瘤；M、 转移。（J） PDX小鼠治疗时间表示意图。箭头表示不同的治疗时间点。不同PDX肿瘤中circCUL2和IL6表达的（K-L）qPCR和Western blot分析。（740万tif）

附加文件9： 图S6circCUL2是miR-203a-3p的海绵，与图。​图5.（A）5（A）对NF和CAF中富含生物素标记miR-203a-3p探针的CUL2 mRNA进行qRT-PCR分析。（B-C）用miR-203a-3p抑制剂转染的NF链或用miR-203a-3p模拟物转染的CAFs中CUL2的qRT-PCR和蛋白质印迹分析。（D） 显示了circCUL2和miR-203a-3p拷贝数分析的标准曲线。（E） 每个NF和CAF的平均circCUL2和miR-203a-3p拷贝数。数据表示为平均值±标准偏差，无显著性。（814K，tif）

附加文件10： 图S7miR-203a-3p对于维持体外CAF的促肿瘤活性至关重要，如图6（A-B）用来自miR-203a-3p沉默NFs或miR-203a-3p过度表达CAF的条件培养基处理的MiaPaCa-2细胞的集落形成和跨阱分析。比例尺：100μm。数据表示为平均值±SD。***p<0.001。（2.2M，tif）

附加文件11： 图S8circCUL2通过MyD88/NF-κB/IL6轴促进增殖和迁移，如图7（A-B）用来自NFs与miR-203a-3p模拟物共转染的circCUL2过表达质粒的条件培养基或CAFs共转染的circCUL2 siRNA和miR-203-3p抑制剂处理MiaPaCa-2细胞48小时。通过集落形成和transwell测定检测MiaPaCa-2的增殖和迁移能力。（C-D）MiaPaCa-2细胞用NFs与MyD88 siRNA共转染的circCUL2过表达质粒或CAFs与MyD 88过表达质粒共转染circCUL2-siRNA和MyD88的条件培养液处理48 h。通过克隆形成和转染分析检测MiaPaCa-2的增殖和迁移能力。数据表示为平均值±SD。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。（820万tif）

附加文件12： 图S9PDAC中circCUL2/miR-203a-3p/IL6轴的临床意义，与图。​图8。8161例PDAC患者circCUL2与miR-203a-3p的相关性分析。（B） 161例PDAC患者circCUL2与MyD88的相关性分析。（C） 161例PDAC患者circCUL2与IL6的相关性分析。（D） 161例PDAC患者miR-203a-3p与IL6的相关性分析。（718K，tif）

致谢

不适用。

缩写

个人数字助理胰腺导管腺癌
非金融机构正常成纤维细胞
CAF公司癌相关成纤维细胞
国际CAF炎症性癌相关成纤维细胞
我的CAF肌纤维母细胞癌相关成纤维细胞
环核糖核酸圆形RNAs
液态氮淋巴结
天然气正常邻近组织
操作系统总体生存率
DFS公司无病生存
鱼类荧光原位杂交

作者的贡献

陈若飞、周庆斌和李志浩构思了该项目的构思，协调了研究并修改了手稿。郑SY、胡CH、林HC和李GL进行了大部分实验。Xia RP、Zhang X和Su D收集了临床样本和信息。所有作者都批准了手稿的最终版本。

基金

本研究得到了国家自然科学基金（批准号81871945、82072639、81672395、81802419）、广东省科学技术厅（批准号2021A1515011089）、中国广州市科学技术计划（批准号201803010049）、，国家重点研发计划（批准号：2017YFC1308600）、广东省人民医院“登封计划”专项资金（KJ012019509，DFJH2020027）。

数据和材料的可用性

本研究中使用的数据集可根据合理要求从相应作者处获得。

声明

道德批准和参与同意

这项研究得到了孙中山纪念医院伦理委员会和广东省人民医院的批准。动物实验按照华南理工大学动物实验研究伦理委员会批准的指南进行。

出版同意书

所有作者都同意在《分子癌症》杂志上发表手稿。

竞争性利益

作者声明没有潜在的利益冲突。

脚注

出版商备注

Springer Nature在公布的地图和机构关联中的管辖权主张方面保持中立。

郑尚友（Shangyou Zheng）、胡崇辉（Chonghui Hu）、林洪曹（Hongcao Lin）和李国林（Guolin Li）为这项工作做出了同等贡献。

参与者信息

李志华，moc.361@tcodhzl.

周泉波，moc.621@obnauqhz.

陈如富，nc.ude.usys.liam@ufurnehc公司.

工具书类

1Siegel RL、Miller KD、Fuchs HE、Jemal A.癌症统计。2021.加州癌症临床杂志。2021;71(1):7-33. [公共医学]
2Hosein AN、Brekken RA、Maitra A.胰腺癌基质：治疗靶向策略的更新。Nat Rev胃肠肝素。2020;17(8):487–505. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
三。Ho WJ，Jaffee EM，Zheng L.胰腺癌的肿瘤微环境-临床挑战和机遇。Nat Rev临床肿瘤学。2020;17(9):527–40. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
4Sahai E、Astsatov I、Cukierman E、DeNardo DG、Egeblad M、Evans RM等。促进我们对癌相关成纤维细胞理解的框架。Nat Rev癌症。2020;20(3):174–86. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
5Shiga K、Hara M、Nagasaki T、Sato T、Takahashi H、Takeyama H。癌相关成纤维细胞：其特征及其在肿瘤生长中的作用。癌症（巴塞尔）2015;7(4):2443–58. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
6Djurec M、Graña O、Lee a、TrouléK、Espinet E、Cabras L等。Saa3是胰腺肿瘤中癌相关成纤维细胞促肿瘤特性的关键介体。美国国家科学院院刊。2018;115（6） ：E1147-56。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
7Hofheinz RD、Al-Batran SE、Hartmann F、Hartung G、Jäger D、Renner C等。人源化单克隆抗体靶向基质抗原：西布曲单抗在转移性结直肠癌患者中的早期II期试验。翁科洛吉。2003;26(1):44–8.[公共医学][谷歌学者]
8Nugent FW、Cunningham C、Barve MA、Fisher W、Patel H、Meiri E等。四期胰腺癌中他拉波他汀/吉西他滨的二期研究。临床肿瘤学杂志。2007
9奥兹德米尔·BC、彭切瓦·霍恩·T、卡斯滕斯·JL、郑X、吴CC、辛普森·TR等。癌相关成纤维细胞和纤维化的耗竭诱导免疫抑制并加速胰腺癌，降低生存率。癌细胞。2015;28(6):831–3.[公共医学][谷歌学者]
10Rhim AD、Oberstein PE、Thomas DH、Mirek ET、Palermo CF、Sastra SA等。基质元素起到抑制而非支持胰腺导管腺癌的作用。癌细胞。2014;25(6):735–47. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
11Lee JJ，Perera RM，Wang H，Wu DC，Liu XS，Han S，等。Hedgehog信号的基质反应抑制胰腺癌进展。美国国家科学院院刊。2014;111（30）：E3091-100。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
12Fukuda A、Wang SC、Morris JT、Folias AE、Liou A、Kim GE等。Stat3和MMP7参与胰腺导管腺癌的发生和发展。癌细胞。2011;19(4):441–55. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
13.Lesina M、Kurkowski MU、Ludes K、Rose-John S、Treiber M、Klöppel G等。IL-6转运激活Stat3/Socs3促进胰腺上皮内瘤变的进展和胰腺癌的发展。癌细胞。2011;19(4):456–69.[公共医学][谷歌学者]
14Oh hlund D、Handly-Santana A、Biffi G、Elyada E、Almeida AS、Ponz-Sarvise M等。胰腺癌中炎性成纤维细胞和肌成纤维细胞的不同群体。《实验医学杂志》。2017;214(3):579–96. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
15Biffi G、Oni TE、Spielman B、Hao Y、Elyada E、Park Y等。转化生长因子β拮抗IL1诱导的JAK/STAT信号传导，形成胰腺导管腺癌CAF异质性。癌症发现。2019;9(2):282–301. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
16Elyada E、Bolisetty M、Laise P、Flynn WF、Courtois ET、Burkhart RA等。胰腺导管腺癌的跨物种单细胞分析揭示了抗原呈递癌相关成纤维细胞。癌症发现。2019;9(8):1102–23. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
17Kristensen LS、Andersen MS、Stagsted L、Ebbesen KK、Hansen TB、Kjems J.环状RNA的生物发生、生物学和表征。Nat Rev基因。2019;20(11):675–91.[公共医学][谷歌学者]
18Wilusz JE。环状RNA的360°视图：从生物发生到功能。Wiley Interdiscip Rev RNA。2018;9（4） ：e1478。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
19Goodall GJ，维克拉马辛格VO。癌症中的RNA。Nat Rev癌症。2021;21(1):22–36.[公共医学][谷歌学者]
20郭X，周Q，苏德，罗Y，傅Z，黄磊，等。环状RNA circBFAR通过miR-34b-5p/MET/Akt轴促进胰腺导管腺癌的进展。摩尔癌症。2020;19(1):83. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
21孔毅，李毅，罗毅，朱健，郑和，高波，等。circNFIB1通过miR-486-5p/PIK3R1/VEGF-C轴抑制胰腺癌淋巴管生成和淋巴转移。摩尔癌症。2020;19(1):82. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
22Ligorio M、Sil S、Malagon-Lopez J、Nieman LT、Misale S、Di Pilato M等。基质微环境塑造胰腺癌的瘤内结构。单元格。2019;178(1):160–75. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
23.崔毅，田美，宗美，滕美，陈毅，陆杰，等。胰腺导管腺癌与正常邻近胰腺组织和胰腺良性囊腺瘤的蛋白质组学比较。胰腺学。2009;9(1-2):89–98.[公共医学][谷歌学者]
24Zhang Y，Bharadwaj U，Logsdon CD，Chen C，Yao Q，Li M.ZIP4通过锌指转录因子CREB激活IL-6/STAT3通路调节胰腺癌细胞生长。临床癌症研究。2010;16(5):1423–30. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
25Bartel博士。MicroRNAs：目标识别和调节功能。单元格。2009;136(2):215–33. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
26Naugler WE、Sakurai T、Kim S、Maeda S、Kim K、Elsharkawy AM等。MyD88依赖性IL-6产生的性别差异导致肝癌的性别差异。科学。2007;317(5834):121–4.[公共医学][谷歌学者]
27Li J，Yang J，Zhou P，Le Y，Zhow C，Wang S，等。癌症中的环状RNA：对起源、性质、功能和含义的新见解。美国癌症研究杂志。2015;5(2):472–80. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
28Santer L，Bär C，Thum T.环状RNA：一类具有治疗前景的新型功能性RNA分子。分子热学。2019;27(8):1350–63. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
29Mortoglou M，Tabin ZK，Arisan ED，Kocher HM，Uysal Onganer P.胰腺导管腺癌中的非编码RNA：更好诊断和治疗的新方法。Transl Oncol公司。2021;14(7):101090. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
30孟杰，陈仕，韩建新，钱波，王晓瑞，钟伟林，等。Twist1通过Cul2环状RNA调节波形蛋白促进肝癌EMT。癌症研究。2018;78(15):4150–62.[公共医学][谷歌学者]
31Peng L，Sang H，Wei S，Li Y，Jin D，Zhu X，et al.circCUL2通过miR-142-3p/ROCK2调节自噬激活，调节胃癌恶性转化和顺铂抵抗。摩尔癌症。2020;19(1):156. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
32邹勇，郑S，邓X，杨A，谢X，汤H，等。环状RNA CDR1as/ciRS-7在调节肿瘤微环境中的作用：一项泛癌分析。生物分子。2019;9(9).[PMC免费文章][公共医学]
33.Kristensen LS、Ebbesen KK、Sokol M、Jakobsen T、Korsgaard U、Eriksen AC等。癌症中假定癌基因ciRS-7的空间表达分析重塑了微RNA海绵理论。国家公社。2020;11(1):4551. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
34Karagiannis GS、Poutahidis T、Erdman SE、Kirsch R、Riddell RH、Diamandis EP。癌相关成纤维细胞通过旁分泌和对癌组织施加机械压力来推动转移的进展。摩尔癌症研究。2012;10(11):1403–18. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
35Ling J，Chiao PJ。一石二鸟：胰腺导管腺癌和癌相关成纤维细胞IL1α信号通路的治疗靶向性。癌症发现。2019;9(2):173–5.[公共医学][谷歌学者]
36Le LT、Cazares O、Mouw JK、Chatterjee S、Macias H、Moran A等。miR-203的缺失通过ROBO1/Rac/FAK调节细胞形状和基质粘附，以响应刚度。细胞生物学杂志。2016;212(6):707–19. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
37.Miroshnikova YA、Mouw JK、Barnes JM、Pickup MW、Lakins JN、Kim Y等。组织力学促进依赖IDH1的HIF1α-tenascin C反馈以调节胶质母细胞瘤侵袭。自然细胞生物学。2016;18(12):1336–45. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
38Northey JJ、Barrett AS、Acerbi I、Hayward MK、Talamantes S、Dean IS等。僵硬基质通过诱导癌基因ZNF217增加乳腺癌风险。临床投资杂志。2020;130(11):5721–37. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
39.Salcedo R、Cataisson C、Hasan U、Yuspa SH、Trinchieri G.MyD88及其在致癌过程中的不同代价。趋势免疫。2013;34(8):379–89. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
40Guo L，Junttila IS，Paul WE。细胞因子诱导的常规和固有淋巴细胞产生细胞因子。趋势免疫。2012;33(12):598–606. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
41Erez N、Truitt M、Olson P、Arron ST、Hanahan D。癌相关成纤维细胞在早期肿瘤中被激活，以NF-kappaB依赖的方式协调肿瘤引发的炎症。癌细胞。2010;17(2):135–47.[公共医学][谷歌学者]
42Su S，Liu Q，Chen J，Chen J，Chen F，He C，等。间质样癌细胞和巨噬细胞之间的正反馈回路对乳腺癌转移至关重要。癌细胞。2014;25(5):605–20.[公共医学][谷歌学者]
43Wang W、Abbruzzese JL、Evans DB、Chiao PJ。尿激酶型纤溶酶原激活物在胰腺癌中的过度表达受组成性激活的RelA调节。致癌物。1999;18(32):4554–63.[公共医学][谷歌学者]
44Ohlund D、Handly-Santana A、Biffi G、Elyada E、Almeida AS、Ponz-Sarvise M等。胰腺癌中炎性成纤维细胞和肌成纤维细胞的不同群体。《实验医学杂志》。2017;214(3):579–96. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
45Mace TA、Shakya R、Pitarresi JR、Swanson B、McQuinn CW、Loftus S等。IL-6和PD-L1抗体阻断联合治疗可降低小鼠胰腺癌模型的肿瘤进展。内脏。2018;67(2):320–32. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
46Mace TA、Ameen Z、Collins A、Wojcik S、Mair M、Young GS等。胰腺癌相关星状细胞以STAT3依赖的方式促进髓源性抑制细胞的分化。癌症研究。2013;73(10):3007–18. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
47Lin JH、Huffman AP、Wattenberg MM、Walter DM、Carpenter EL、Feldser DM等。1型常规树突状细胞在胰腺癌发生早期系统性失调。《实验医学杂志》2020；217(8).[PMC免费文章][公共医学]
48Duluc D、Delnester Y、Tan F、Moles MP、Grimaud L、Lenoir J等。肿瘤相关白血病抑制因子和IL-6使单核细胞分化为肿瘤相关巨噬细胞样细胞。鲜血。2007;110(13):4319–30.[公共医学][谷歌学者]
49Zegeye MM、Lindkvist M、Falker K、Kumawat AK、Paramel G、Grenegard M等。JAK/STAT3和PI3K/AKT通路的激活对人类血管内皮细胞中IL-6跨signaling介导的促炎反应至关重要。小区通信信号。2018;16(1):55. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
50Nishikai-Yan ST、Kanazawa S、Kado M、Okada K、Luo L、Hayashi A等。白细胞介素-6刺激非糖尿病但非糖尿病小鼠的Akt和p38 MAPK磷酸化和成纤维细胞迁移。普洛斯一号。2017;12（5） ：e178232。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
51Zhang Y、Yan W、Collins MA、Bednar F、Rakshit S、Zetter BR等。白细胞介素-6通过促进MAPK信号激活和氧化应激抵抗，在胰腺癌进展中是必需的。癌症研究。2013;73(20):6359–74. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
52罗凯。TGF-beta/Smad和其他信号通路之间的信号交叉对话。冷泉Harb Perspect生物。2017;9(1).[PMC免费文章][公共医学]
53Giraldez MD、Carneros D、Garbers C、Rose-John S、Bustos M。代谢、肝病和胃肠病中IL-6家族细胞因子的新见解。Nat Rev胃肠肝素。2021;18(11):787–803.[公共医学][谷歌学者]
54Wuensch KL、Evans JD。行为科学的直接统计。美国统计协会。1996;91(436):1750. [谷歌学者]
文章来自实验与临床癌症研究杂志：CR由以下人员提供BMC公司