细胞Adh Migr。2022; 16(1): 13–24.
TNF-α调节牙龈上皮细胞的基底膜成分和细胞基质粘附
,一,b条 ,一 ,一 ,一 ,b条,c（c） ,b条,c（c） ,d日和一,b条
马萨鲁·梅扎瓦
一日本松岛日本大学松岛牙科学院牙周病学系
b条日本松岛日本大学口腔医学院口腔科学研究所
Yuto Tsuruya村
一日本松岛日本大学松岛牙科学院牙周病学系
山口阿里萨
一日本松岛日本大学松岛牙科学院牙周病学系
河野哲郎
b条日本松岛日本大学口腔医学院口腔科学研究所
c（c）日本松岛日本大学松岛牙科学院组织学系
冈田裕久
b条日本松岛日本大学口腔医学院口腔科学研究所
c（c）日本松岛日本大学松岛牙科学院组织学系
克里斯托弗·麦卡洛赫
d日加拿大多伦多多伦多大学牙科学院
Ogata Yorimasa绪方
一日本松岛日本大学松岛牙科学院牙周病学系
b条日本松岛日本大学口腔医学院口腔科学研究所
一日本松岛日本大学松岛牙科学院牙周病学系
b条日本松岛日本大学口腔医学院口腔科学研究所
c（c）日本松岛日本大学松岛牙科学院组织学系
d日加拿大多伦多多伦多大学牙科学院
版权©2022作者。由Informa UK Limited出版，交易名称为Taylor&Francis Group。 摘要
层粘连蛋白5、4型胶原和α6β4整合素有助于牙周组织上皮中半桥粒的形成，这对牙龈连接的发育和维持至关重要。由于尚不清楚TNF-α是否会改变上皮细胞周围基质的组成，因此，人牙龈上皮细胞是在TNF-β存在或不存在的情况下培养的。TNF-α治疗可加速体外伤口的上皮细胞迁移和闭合。这些数据出乎意料地表明，TNF-α促进上皮细胞周围细胞周基质的形成，并增强上皮细胞与底层基质的粘附，这些特性对细胞迁移和齿龈连接的完整性很重要。
关键词：TNF-α、牙龈上皮、细胞粘附、细胞迁移、层粘连蛋白5、基底膜、细胞外基质
介绍
肿瘤坏死因子α（TNF-α）是由单核细胞和巨噬细胞释放的一种显著的促炎介质[1]这对离散细胞群具有广泛的促炎和免疫调节作用。这些影响部分来自前列腺素合成增强，并与多种癌症的肿瘤形成、蛋白酶表达增加、破骨细胞激活和骨吸收有关。TNF-α上调间质胶原酶、基质金属蛋白酶-1（MMP-1）、前列腺素E2（PGE2）、多种细胞因子和趋化因子、细胞粘附分子和促进骨吸收的分子的生成[2–4]. 基质金属蛋白酶是细胞外基质（ECM）降解所必需的，这一过程对肿瘤的生长、侵袭和转移至关重要[5]. 值得注意的是，牙周炎中TNF-α也上调[6,7]是一种高发病率的炎症性疾病。目前尚不清楚TNF-α如何影响齿龈连接处上皮成分的结构和蛋白质组成。
在齿龈连接处，连接上皮附着在牙齿表面，并显示出两个不同的基底层。外板与沟上皮的基底层连续，并将连接上皮附着于结缔组织的固有层。内基膜将连接上皮附着在牙齿表面[8,9]通过由层粘连蛋白5和整合素α6β4组成的半桥粒[10–12]. 基于免疫组织化学和就地杂交显示，层粘连蛋白5位于连接上皮的内基底层[13]. 层粘连蛋白5仅存在于缺乏IV型胶原的内部基底层。层粘连蛋白5和IV型胶原都存在于牙龈结缔组织固有层的ECM中[14].
凝集素可以与自身、中间丝蛋白（如角蛋白）以及β4整合素尾部的多个结构域相互作用。凝集素有助于细胞基底表面α6β4整合素的聚集，这是半桥粒形成的关键步骤[15–17]. 细胞角蛋白与核膜相互作用，也与质膜上的桥粒和半桥粒相互作用；这些相互作用增强了上皮细胞的结构完整性[18]. 蛋白与膜蛋白的相互作用通常由plakin家族的成员介导，包括结蛋白、plectin和某些整合素。此外，在基底层中，牙源性成釉细胞相关蛋白（ODAM）与成釉细胞分化、牙齿连接上皮附着等多种活动有关[19]釉质成熟与肿瘤生长[20,21].
口腔鳞状上皮癌与上皮细胞在牙周病中的行为之间的关系已经在早期讨论过了[22–24]. 值得注意的是，肿瘤性疾病可能是牙周组织的原发性病变，也可能是继发性转移性肿瘤。口腔鳞状细胞癌的临床特征类似于囊袋上皮细胞向牙龈固有层的迁移，如局部牙周炎或急性牙周感染，其中有牙龈红斑、肿胀、探袋深度增加和骨丢失的放射学证据[25]. 鉴于这种关系，我们使用人牙龈鳞状细胞癌细胞（Ca9-22）作为细胞模型来研究TNF-α是否调节细胞周基质的结构和功能以及MMP的表达。我们发现，TNF-α强烈影响蛋白质的表达和基底膜的组成，表明TNF-β可能直接影响细胞周蛋白的结构和代谢，进而调节连接上皮细胞与釉质的粘附。
材料和方法
试剂
兔多克隆抗体（层粘连蛋白5、IV型胶原、I型胶原和p115-rhoGEF）、兔单克隆抗体（67-kDa层粘连素受体、Tak1和TIMP1）、小鼠单克隆抗体，和山羊抗鼠Alexa 647是从Abcam（日本东京）获得的。从Novus（Littleton，CO）购买了兔凝集素多克隆抗体。β-肌动蛋白的小鼠单克隆抗体购自Cell Signaling Technology。兔抗牙源性成釉细胞相关蛋白（ODAM）多克隆抗体购自Proteintech（伊利诺伊州罗斯蒙特）。大鼠α6整合素单克隆抗体（CD49f；GoH3）购自R&D Systems（明尼阿波利斯，明尼苏达州）。人重组肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和α-微量必需培养基（α-MEM）购自日本东京的Wako。胎牛血清（FCS）、青霉素和链霉素、TrypLE Express和TRIzol试剂购自Invitrogen（Carlsbad，CA）。PrimeScript RT试剂盒和SYBR Premix Ex Taq II购自Takara Bio（日本东京）。牛血清白蛋白（BSA）、完整蛋白酶抑制剂混合物和苯甲基磺酰基氟化物购自Sigma Aldrich Japan（日本东京）。与过氧化物酶抗体偶联的抗鼠兔IgG（全分子）、与过氧化物酶偶联的抗兔山羊IgG，以及ECL Prime Western印迹检测试剂购自GE Healthcare（英国白金汉郡）。纤维结合蛋白来自牛血浆（Sigma-Aldrich）。所有使用的化学品均为分析级。
细胞培养
人牙龈鳞癌上皮Ca9-22细胞购自RIKEN BRC细胞库（日本筑波）。Ca9-22细胞在含有10%胎牛血清的αMEM中培养，直到在37°C的5%CO2和95%空气中70–80%融合。在含有1%胎牛血清的α-MEM中用TNF-α（10 ng/ml）或IL-1β（1 ng/ml）刺激Ca9-22细胞6小时或24小时。
实时PCR
根据制造商的方案，使用TRIzol试剂分离总RNA。总RNA（1 mg）用作cDNA模板，cDNA由PrimeScript RT试剂盒制备。在TP800 Thermal Cycler Dice实时系统（Takara Bio）中使用SYBR Premix Ex Taq II，我们使用特定引物集进行了定量实时PCR(). 扩增反应在25 mL最终体积中进行，包含×2 SYBR Premix EX Taq（12.5 mL）、正向和反向引物（0.2 mL）以及70 ng cDNA（7 mL），用于TNF-α、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、β4整合素、钙粘蛋白1、层粘连蛋白β3、层粘着蛋白γ2、层粘连蛋白α3、IV型α1胶原链和I型α1胶原链；50 ng cDNA（5 mL）用于分析GAPDH。为了减少重复之间的变异性，制备含有除cDNA外所有试剂的PCR预混合液，并将其校准到0.2 mL PCR试管中（日本遗传学公司）。热循环条件为：95℃下10s，95℃下40s，5s，60℃下30s。PCR后熔融曲线证实了单靶点扩增的特异性和由此产生的mRNA表达。TNF-α、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、β4整合素、钙粘蛋白1、层粘连蛋白β3、层粘连蛋白γ2、层粘连蛋白α3、IV型α1胶原和I型α1胶原，并在每种实验条件下和3个不同的日子测量一式三份的GAPDH数据。
表1。
| 肿瘤坏死因子-α |
|---|
| 正向5′-GTGCAAGCCTCTGTT-3′ |
| 背面5′-TTATCTCTCAGCTCACGCACATT-3' |
| 基质金属蛋白酶-2 |
| 前5′-GATACCCTTGACGGTAAGGA-3’ |
| 反向5′-CCTTCCCCAAGGTCCATAGC-3' |
| 基质金属蛋白酶-9 |
| 正向5′-ACGCACGTCTTCCAGTA-3′ |
| 反面5′-CCACCTGTTCAACTCACTCC-3′ |
| TIMP-1（金属蛋白酶组织抑制剂-1） |
| 正向5′-AAGACCTACTGTGGCTGTGAG-3′； |
| 背面5′-GTCCGTCACAAGCAATGAG-3′； |
| β4整合素 |
| 正向5′-CTCACCGAGTCACCTTC-3′ |
| 背面5′-CGGGTAGCCTGTCCTGTA-3′ |
| 卡德林1 |
| 正向5′-AAGTGTGCAGCAAGACAGA-3′ |
| 背面5′-AAATTGCCAGGCTCAATGACAAG-3′ |
| 层粘连蛋白β3-链 |
| 正向5′-CAAGCCTGAGACCTACTGC-3′； |
| 背面5′-GAATCCCTGTCCAGGTCCA-′3 |
| 层粘连蛋白γ2-链 |
| 正向，5′-GACAACTGGTAATGGATTCCGC-3′； |
| 背面，5′-TTCTCTGTGCCGGTAAAAGCC-3′ |
| 层粘连蛋白α3-链 |
| 正向，5′-TGCTAACAGTACCGGGATTCT-3′； |
| 背面，5′-TCTTGTTCAAGCCATTTGCC-3′ |
| IV型胶原α1-链 |
| 正向，5′-ACCTGGTCAAACTGGTCCTG-3′； |
| 背面，5′-GTGCCCCTAATGCCTTTGA-3′； |
| I型胶原蛋白α1-链 |
| 正向，5′-GCTTGCCACTTGCTTGAAGA-3′； |
| 背面，5′-GAGCATTGCTTTGATTGCTG-3′ |
| GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶） |
| 正向，5′-GCACGTCAGAGAGAAC-3′； |
| 背面，5′-ATGGTGTGAGACGCCAGT-3′ |
蛋白质印迹
裂解Ca9-22细胞，在8%SDS-PAGE凝胶上装载等量的蛋白质并分离，然后转移到Hybond 0.2μm聚偏氟乙烯膜。在4°C下隔夜封闭膜并用特定的一级抗体进行探测，然后在室温下将二级抗体孵育1小时。将膜与抗TAK1（ab109526；Abcam，剑桥，英国）、抗MMP-9（ab119906；Abcam）、抗β4整合素（ab29042；Abcam）、抗细胞角蛋白19（ab7755；Abcam）、抗p115-rhoGEF（ab220892；Abcam）、抗层粘连蛋白5（ab14509；Abcam）、抗67kDa层粘连蛋白受体（ab133645；Abcam）、抗IV型胶原（ab6586；Abcam）、，和抗β-肌动蛋白（#12262；细胞信号技术，MA）抗体2小时。用辣根过氧化物酶结合的抗兔抗体和抗鼠IgG作为二级抗体。ECL检测免疫反应性。ChemiDoc MP成像系统（Bio-Rad，Hercules，CA）用于检测和分析免疫印迹。
细胞迁移分析
使用Radius™24孔板（来自加利福尼亚州圣地亚哥Cell Biolabs）测定细胞迁移。平板播种5×10三Ca9-22细胞/ml每孔。细胞在含有10%FCS的α-MEM中培养，置于涂有纤维连接蛋白的平板上。通过移除细胞培养前放置的凝胶插入物，在形成圆形间隙之前培养细胞形成单层。用IL-1β（1 ng/mL）或TNF-α（10 ng/mL。处理后，用PBS洗涤细胞，并在4%多聚甲醛中固定10分钟。用PBS洗涤三次后，用DAP1对细胞染色15分钟，并用荧光显微镜（BZ-X810；日本Keyence）在相同放大倍数（×4）下测量培养物中缝隙的宽度。为了阻断整合素功能，将整合素α6的中和抗体与在含有10%FCS的αMEM中培养的Ca9-22细胞在35 mm培养皿中培养并生长融合。将培养基改为含有1%FCS的α-MEM，用细胞刮刀（1 mm宽；Corning）在培养皿中心刮除细胞层，用含有1%FCSα-MEM2清洗两次，以去除脱落的细胞。用TNF-α（10 ng/mL）刺激细胞，并用整合素中和抗体（10μg/mL）处理24 h，以观察伤口愈合区域。
免疫荧光分析
通过胰蛋白酶化制备Ca9-22细胞悬液，并在37°C下与0.5 mg/ml细菌胶原酶孵育30分钟，搅拌以去除细胞周围的糖萼。室载玻片（8孔）接种1×104细胞/ml/室，细胞在含有10%FCS的α-MEM中培养12h。使用计数室玻片（Invitrogen）进行细胞计数。用PBS（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8 mM Na）清洗细胞2高性能操作4和1.5 mM KH2人事军官4; pH7.4）。在37°C下用10μg/mL纤维连接蛋白涂覆室载玻片（8孔；康宁）60分钟。将培养基改为含有1%FCS的α-MEM培养6 h，然后用10 ng/mL TNF-α处理细胞6 h或24 h。处理后，细胞在4%多聚甲醛中固定10分钟。用PBS清洗三次后，用0.1%Triton X-100渗透细胞5分钟。在量化细胞周基底膜蛋白合成的实验中，没有使用Triton X-100进行渗透。细胞在2.5%山羊血清中4%BSA中室温封闭30min。用PBS清洗一次后，在37°C下以1:200的浓度使用主要抗体（兔多克隆抗层粘连蛋白5、抗IV型胶原、抗ODAM和抗补体抗体以及小鼠单克隆抗整合素β4）2 h。在用PBS进行三次洗涤后，在室温下以1:200的浓度使用二级抗体（Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 647山羊抗兔IgG）1小时。用PBS清洗三次后，用AntiFade Poly/Mount with DAPI（Polysciences，Warrington，PA，USA）安装盖玻片。荧光图像在蔡司LSM 510（德国Oberk-ochen）共焦显微镜下观察。
统计分析
对于所有实验，在不同的日期重复至少三次单独的分析。对于定量数据，计算平均值±SEM。采用方差分析对多个样本进行比较。统计显著性设为p<0.05。
结果
TNF-α调节细胞外基质消化
我们检测了IL-1β（1 ng/ml）和TNF-α（10 ng/ml(). 用TNF-α治疗6小时后，缝隙的平均细胞闭合百分比比用TNF--α治疗6 h后减少更多（p<0.05，). 对照组或IL-1β处理细胞之间的缝隙闭合百分比没有差异。我们检测了TNF-α、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TAK1的表达，以评估Ca9-22细胞中ECM的降解(). 用IL-1β（1 ng/mL）或TNF-α（10 ng/mL）处理Ca9-22细胞6小时或24小时。肿瘤坏死因子-α()和MMP-9()TNF-α治疗6小时或24小时后，mRNA水平显著增加（378倍）（p<0.001）。此外，TIMP-1 mRNA水平()TNF-α治疗24小时后增加（2.3倍）（p<0.001）。出乎意料的是，MMP-2 mRNA水平()在TNF-α治疗6 h和24 h后均下降（p<0.01）。IL-1β或TNF-α治疗24小时后，激活p38 MAPK/JUN/NFκB信号的TAK1蛋白（72kDa）水平升高(). IL-1β或TNF-α治疗24小时后MMP-9蛋白水平升高(). IL-1β或TNF-α治疗24小时后，TIMP1蛋白水平也增加(). 迁移试验的数据表明，整合素α6的中和抗体（10μg/mL）抑制由TNF-α刺激的Ca9-22细胞迁移().
TNF-α调节细胞外基质消化途径。（a） 再上皮化伤口愈合分析。在Radius™24孔板（纤连蛋白涂层）上分析Ca9-22细胞的再上皮化。胎面IL-1β和TNF-α分别于胎面6 h和24 h后进行荧光显微镜观察。采用三种不同的细胞染色法进行细胞核DAPI染色。（b） IL-1β和TNF-α处理细胞的平均伤口愈合面积（再上皮化）如图所示。数据代表了三个实验的结果。IL-1β（1 ng/ml）和TNF-α（10 ng/ml。定量提取RNA前，对IL-1β和TNF-α处理6或24小时的Ca9-22细胞中（c）TNF-β、（d）MMP-2、（e）MMP-9和（f）TIMP-1的mRNA表达。数据是来自3个独立实验的平均SEM±。（g） Ca9-22细胞裂解产物的TAK1、MMP-9和TIMP1免疫印迹分析。β-actin作为负荷对照。这些数据代表了3个单独的实验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。（h） α6整合素中和抗体（GoH3）对细胞迁移的影响。使用TNF-α（10 ng/ml）和整合素中和抗体（10μg/ml）刺激的Ca9-22细胞进行24小时的迁移分析。显微镜观察显示，TNF-α处理的损伤细胞在抓挠后伤口迅速愈合。刮擦后面板立即显示细胞（左面板），24小时后显示细胞（右面板）。
TNF-α影响半桥粒和桥粒的形成
我们研究了炎症细胞因子对Ca9-22细胞中细胞基质粘连（半桥粒形成）和细胞间粘连（桥粒生成）的影响。细胞因子不会改变β4整合素mRNA的表达，整合素是一种在上皮细胞与基质粘附中起重要作用的蛋白(). 相反，IL-1β（1 ng/mL）持续6小时或TNF-α（10 ng/mL）持续6或24小时后，β4整合素（202 kDa）的表达降低(). 用免疫荧光和共聚焦显微镜研究了与整合素β4亚单位结合的、参与细胞粘附的重要细胞骨架蛋白plectin的表达(). 免疫染色细胞以单个细胞为基础进行量化（每个感兴趣区域的像素数），荧光强度根据细胞的特定区域进行标准化。与对照组相比，TNF-α治疗组细胞内plectin的表达降低（1.3倍）（p<0.05，). TNF-α治疗24小时后，β4整合素与亮氨酸的共定位降低(). 中间丝细胞角蛋白19蛋白（40kDa）在上皮细胞中表达，并与补体结合，在TNF-α刺激6 h后表达减少，但在TNF--α刺激24 h后无变化(). 相反，在TNF-α刺激24小时后，钙粘蛋白1 mRNA（一种参与细胞间粘附的蛋白）的表达增加(). 我们还研究了激活Rho GTPases（Rho A、Rac1、Cdc42）的Rho GEF的表达。这些蛋白质参与细胞运动、极性和增殖的调节。细胞因子治疗后，Rho-GEFs蛋白水平（102kDa）的表达没有变化().
TNF-α影响半桥粒的形成。IL-1β（1 ng/ml）和TNF-α（10 ng/ml。在提取RNA之前，对IL-1β和TNF-α处理6或24小时的Ca9-22细胞中（a）β4整合素和（b）Cadherin 1的mRNA表达进行定量。数据是来自3个单独实验的平均SEM±。（c） 在β4整合素、细胞角蛋白19和Rho-GEF蛋白的免疫印迹分析中，从Ca9-22细胞裂解物。β-actin作为负荷对照。这些数据代表了3个单独的实验。*p<0.05。（d~f）将胶原酶处理过的Ca9-22细胞接种在纤维连接蛋白（10μg/mL）涂层培养皿上，并用TNF-α（10 ng/mL）处理24 h。然后对其进行固定，并通过渗透性进行plectin免疫染色。使用抗β4整合素和抗凝集素进行细胞间凝集素和共定位的免疫染色，并用Zeiss LSM 510共聚焦显微镜成像。每个标记和细胞类型至少测量30个细胞。比例尺：20μm。计算图像J皮尔逊系数以确定共定位。*p<0.05。
TNF-α解除了基底膜成分的调控
我们研究了IL-1β（1 ng/mL）和TNF-α（10 ng/mL）对层粘连蛋白-5和IV型胶原表达的影响，因为这些蛋白是与整合素结合的基底膜的重要组成部分。层粘连蛋白β3()和层粘连蛋白γ2()TNF-α治疗6小时或24小时后，mRNA水平显著增加（各13.7倍，11倍）（p<0.001）。α3 mRNA水平在TNF-α作用24小时后显著升高（3.3倍）（p<0.01，). 在TNF-α作用6h或24h后，层粘连蛋白5（100~150kDa）的表达增加(). 相反，参与细胞基质粘附的层粘连蛋白受体（30~50kDa）的表达在TNF-α作用6h后增加，但在IL-1β或TNF-β作用24h后仅略有增加(). IL-1β或TNF-α24小时后IV型α1胶原mRNA水平下降(). IL-1β刺激24小时后IV型胶原蛋白（160 kDa）的表达降低，但TNF-α刺激24小时之后基本不变(). TNF-α作用24小时后，I型α1胶原mRNA水平显著降低（p<0.01，). IL-1β或TNF-α24小时后，I型胶原（α1链；130 kDa）增加().
TNF-α对基膜成分有影响。IL-1β（1 ng/ml）和TNF-α（10 ng/ml。定量提取RNA前经IL-1β和TNF-α处理6 h或24 h的Ca9-22细胞中（a）层粘连蛋白β3、（b）层粘着蛋白γ2、（c）层粘连蛋白α3、（d）IV型α1胶原和（e）I型α1胶原蛋白的mRNA表达。数据是来自3个单独实验的平均SEM±。（f） 从Ca9-22细胞制备的裂解物中对层粘连蛋白5、层粘连素5受体、IV型胶原和I型胶原进行免疫印迹分析。β-actin作为负荷对照。这些数据代表了3个单独的实验。**p<0.01，***p<0.001。
TNF-α调节细胞内外层粘连蛋白5和IV型胶原的合成
我们通过免疫荧光染色检测了层粘连蛋白5和IV型胶原与整合素的共定位以及层粘连素5和IV类胶原的胞外表达。细胞共免疫层粘连蛋白5或IV型胶原和β4整合素(). 通过Pearson相关分析量化共定位程度。TNF-α作用24小时后，Ca9-22细胞中层粘连蛋白5和β4整合素的结肠化增加（1.3倍）（p<0.05，). 层粘连蛋白5在非渗透细胞的细胞周基质中进行免疫染色，通过共焦显微镜在单细胞基础上进行定量（每个感兴趣区域的像素数），并归一化为单个细胞面积。TNF-α刺激24小时后，细胞外层粘连蛋白5增加（1.8倍）（p<0.05，). 相反，TNF-α作用24小时后，Ca9-22细胞中IV型胶原和β4整合素的共同定位没有改变()而细胞周围IV型胶原在TNF-α作用24小时后略有减少，但两组间无显著差异。().
TNF-α促进细胞内外层粘连蛋白5的合成。（a） 将胶原酶处理的Ca9-22细胞接种在纤连蛋白（10μg/mL）包被的培养皿上，并用TNF-α（10ng/mL）处理24小时。然后对其进行固定，并通过渗透性或非渗透性对层粘连蛋白5进行免疫染色。（b和c）使用抗β4整合素和抗层粘连蛋白5进行共定位免疫染色，并用蔡司LSM 510共焦显微镜成像。每个标记和细胞类型至少测量30个细胞。比例尺：20μm。计算图像J皮尔逊系数以确定共定位。*p<0.05。
TNF-α抑制细胞内和细胞外Ⅳ型胶原的合成。（a） 将胶原酶处理过的Ca9-22细胞涂布在纤维连接蛋白（10μg/mL）涂层培养皿上，并用TNF-α（10 ng/mL）处理24 h。然后固定并免疫染色，以检测Ⅳ型胶原的渗透性或非渗透性。（b和c）使用抗β4整合素和抗Ⅳ型胶原进行免疫染色以实现共定位，并在蔡司LSM 510共焦显微镜下成像。每个标记和细胞类型至少测量30个细胞。比例尺：20μm。计算图像J皮尔逊系数以确定共定位。
TNF-α促进细胞外ODAM的合成
我们通过免疫荧光法研究成釉细胞相关（ODAM）的细胞外表达(). ODAM与层粘连蛋白5和阿米洛汀一起，是分泌性钙结合磷蛋白基因家族的成员，有助于形成位于连接上皮和釉质之间的内部基底膜。TNF-α治疗6小时后，细胞外ODAM增加（p<0.05，). TNF-α治疗6小时后，Ca9-22细胞中ODAM和β4整合素的结肠化增加（1.7倍）（p<0.05，).
TNF-α促进细胞外ODAM的合成。（a） 将胶原酶处理过的Ca9-22细胞涂布在纤维连接蛋白（10μg/mL）涂层培养皿上，并用TNF-α（10 ng/mL）处理24 h。然后在不渗透的情况下对其进行固定和ODAM免疫染色。（b和c）使用抗β4整合素和抗Ⅳ型胶原进行免疫染色以实现共定位，并使用蔡司LSM 510共焦显微镜进行成像。每个标记和细胞类型至少测量30个细胞。比例尺：20μm。计算图像J皮尔逊系数以确定共定位。*p<0.05。
讨论
口腔牙龈上皮基底膜由经典的基底膜成分组成，包括IV型胶原、nidogen、层粘连蛋白-5、−6、−7、−10和−11[13]. 牙周炎是一种由细菌、环境和宿主因素引起的慢性炎症性疾病，这些因素会导致牙齿支撑结构的渐进性破坏，尤其是牙龈连接处的退化[26]. 为了保持齿龈结合部的完整性，内外基底层进行持续快速的重塑。这种重塑与相邻连接上皮的高周转率相结合，后者是保护宿主免受细菌感染的重要防御机制[27–29]. 由于TNF-α是一种丰富的促炎细胞因子，在牙周炎中上调，我们检测了TNF-α对上皮周细胞重塑的影响。我们发现，TNF-α显著增强了层粘连蛋白5在细胞内外的表达。值得注意的是，关于TNF-α对Ca9-22细胞基质重塑的影响的数据非常有限，并且没有专门观察基底膜蛋白胞外表达的研究。在对受牙周炎影响的人类患者的临床研究中，层粘连蛋白5γ链在牙周袋较深部位的龈沟液中高度表达[30]因此，我们的数据表明，TNF-α增强了层粘连蛋白5介导的构成齿龈连接的上皮细胞的重塑。
我们在连接上皮中发现完整的ODAM，这反映了该蛋白在健康牙周组织中的表达，这与早期观察一致，即连接上皮与牙齿表面的粘附是由纤维连接蛋白/层粘连蛋白-整合素-ODAM-ARHGEF5-RhoA信号介导的[31]. 我们发现ODAM在牙龈上皮细胞周围的表达增加，在TNF-α刺激后，ODAM与整合素的共定位更强烈。基于这些数据，我们认为连接上皮层粘连蛋白5和ODAM的表达可能有助于抵抗TNF-α介导的牙周组织破坏。
67 kDa层粘连蛋白受体是一种非整合素细胞表面受体，与细胞外基质蛋白结合，介导细胞与基底膜的粘附，并在与基质结合后激发信号转导[32]. 67 kDa层粘连蛋白受体在肿瘤细胞中的表达增加，并与侵袭和转移潜能增强密切相关[33]. 我们的数据显示，在TNF-α刺激后不久，67kDa层粘连蛋白受体的表达增加。这些结果支持层粘连蛋白受体参与增强对ECM的粘附，因为TNF-α刺激后整合素β4表达降低。
MMP-9（也称为IV型胶原酶、92kDa明胶酶或明胶酶B）由多种细胞类型表达，包括上皮细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、成骨细胞、树突状细胞、巨噬细胞、粒细胞和T细胞。MMP-9通过降解ECM蛋白调节组织重塑，还可以激活细胞因子和趋化因子[34,35]. 我们发现，TNF-α强烈上调牙龈上皮细胞中MMP-9的表达，这与早期数据一致，即TNF-β促进永生化肾近端小管上皮细胞系中MMP-8表达的剂量依赖性增加[36].
我们研究了牙龈上皮细胞在培养皿中向裸露区域的迁移，我们将其用作伤口再上皮化的模型(). 我们发现TNF-α（24小时）治疗加速伤口闭合。我们认为，此处所述的TNF-α促进细胞迁移可能是由于TNF-β诱导的MMP-9降解ECM。接下来，我们研究了整合素α6在迁移过程中的不同功能。先前的研究表明，整合素α6中和抗体抑制人前列腺癌细胞的迁移[37]. 我们的数据表明，整合素α6抗体在TNF-α治疗后抑制Ca9-22细胞迁移。这些数据表明，整合素α6促进TNF-α治疗后的定向迁移。事实上，由于我们还发现与对照组相比，TNF-α降低了IV型胶原mRNA的表达，因此我们认为层粘连蛋白5和ODAM可能促进伤口愈合。免疫活性细胞向受牙周炎影响的边缘组织分泌促炎细胞因子，如TNF-α。此外，TNF-α促进细菌侵入牙龈组织[38].
我们发现TNF-α增强了层粘连蛋白5和ODAM的表达，这是参与连接上皮与釉质粘附的基底膜蛋白。这些蛋白质的表达有助于保护牙周炎部位的齿龈连接。然而，我们也认为这些研究中使用的细胞是口腔鳞状上皮癌细胞，其表达细胞角蛋白19和ODAM。这些蛋白在连接上皮中特异表达。TNF-α通过cIAP1/2和c-FLIP两条不同的caspase-8激活途径诱导细胞凋亡[39]. 与其他半胱氨酸蛋白酶底物相比，凝集素被半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8裂解的速度快得多。Plectin也是上皮细胞中肌动蛋白丝细胞骨架的组织所必需的[40]. 我们发现，TNF-α降低了Ca9-22细胞Plectin的表达及其与整合素的共定位。虽然我们没有观察到caspase 8的表达，但可以想象的是，TNF-α诱导的caspase 8抑制了Plectin的表达。
我们检测了IL-1β对基底膜蛋白表达的影响，发现用IL-1β治疗24小时后IV型胶原表达显著减少。所分析的其他蛋白质没有可检测到的差异。以前我们发现IL-1β处理（3h）细胞中IV型胶原mRNA的丰度显著降低[41]. IV型胶原蛋白和I型胶原蛋白mRNA和蛋白质表达缺乏一致性的一种解释与MMP-9对细胞外IV型胶原酶和I型胶原的快速降解以及降解的IV型胶原质分子在细胞内的吸收有关。由于TNF-α和IL-1β如预期的那样抑制胶原合成，我们认为炎性细胞因子可能影响连接上皮和结缔组织之间的外基底层的形成，并促进牙周袋的形成。
我们的主要发现是，人上皮细胞表达的层粘连蛋白5在IL-1β治疗后没有改变，但在TNF-α治疗后显著增加。我们的结论是，在TNF-α强烈增加的牙周炎病变中，层粘连蛋白5可能在上皮细胞形成基底层中发挥作用，观察到的TNF-β驱动的层粘连素5增加可能表明上皮细胞与牙齿的粘附增强，细胞迁移增加，保护受炎症损伤影响的牙周组织的过程。
致谢
作者感谢Ogata教授及其实验室成员的支持，以及日本松岛大学牙科学院组织学系的Okada教授和Kono博士的技术支持。作者还要感谢克里斯托弗·麦库洛赫教授在创建研究设计方面的合作。
资金筹措表
这项工作得到了日本大学2020-2021年联合研究拨款的支持。资助者在研究设计、数据收集或分析、出版决定或手稿准备方面没有任何作用。
工具书类
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