胰岛素促进肌肉和脂肪组织中葡萄糖储存的能力对维持葡萄糖稳态至关重要。胰岛素刺激这些组织葡萄糖摄取的能力受损，称为胰岛素抵抗，导致2型（非胰岛素依赖性）糖尿病、高血压和心血管疾病的发生(25). 胰岛素刺激葡萄糖摄取的主要机制是通过葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）从细胞内位置转移到细胞表面(26). 调节葡萄糖转运的胰岛素信号转导通路的缺陷被认为是胰岛素抵抗的可能原因(28).
虽然触发GLUT4易位的胰岛素信号通路尚未确定，但已经取得了快速进展。胰岛素受体的激活导致胰岛素受体底物（IRS）蛋白的酪氨酸磷酸化，即通过磷酸酪氨酸部分招募src同源2信号蛋白的对接蛋白。一些证据表明IRS蛋白参与胰岛素刺激的GLUT4易位。小鼠IRS-1和IRS-2的破坏分别导致轻度胰岛素抵抗和2型糖尿病(6,60). IRS-1在大鼠脂肪细胞中的过度表达模拟了胰岛素对GLUT4易位的影响(43)反义核酶还原IRS-1(43)或慢性胰岛素治疗(44)降低胰岛素反应性。胰岛素刺激GLUT4易位所需的IRS蛋白招募的分子之一是磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）。两种PI3K抑制剂沃特曼和LY294002均抑制胰岛素刺激的GLUT4易位(14,17,42). 此外，在脂肪细胞中引入一个显性负p85调节亚单位，无论是在微注射时还是在注射后，都会显著损害胰岛素刺激的GLUT4易位(31)或当过度表达时(47). 在缺乏胰岛素的情况下，组成型活性p110催化亚基的过度表达刺激GLUT4易位到质膜（PM）(38,53). 因此，这些实验共同表明PI3K对于胰岛素刺激的GLUT4易位是必要的。
一些蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶最近被确定为PI3K的下游靶点。这些包括蛋白激酶B（PKB；v-AKT的细胞同源物，也称为RAC-PK）(11,20,22)，PKCζ(8,50)和PKCλ(32). 一些研究已经检测了PKB在胰岛素刺激的GLUT4易位中的作用；然而，结果有些矛盾。组成活性PKBα已在任一3T3-L1脂肪细胞中表达(30)或大鼠脂肪细胞(18,54)并发现促进GLUT4转位到质膜。同样，组成活性PKBα增加L6肌管的葡萄糖摄取(23,57). 利用显性阴性PKB的研究产生了相互矛盾的结果。为了支持PKB在胰岛素作用中的作用，Cong等人(18)发现当转染到大鼠脂肪细胞中时，激酶激活（K179A）PKBα突变体将胰岛素刺激的GLUT4移位抑制20%。然而，Hajduch等人(23)发现相同的结构对L6肌管无显著影响。同样，最近的两项研究(29,32)发现PKBα的双磷酸化位点突变在体外测定的3T3-L1脂肪细胞PKB活性方面表现为显性阴性突变，但对胰岛素刺激的GLUT4易位没有显著影响。相反，PKBα的一个激酶活性低、磷酸化缺陷的突变被发现可以抑制L6成肌细胞中胰岛素刺激的GLUT4易位(59). 调和这些结果的部分困难在于PKB监管的复杂性，而PKB监管才刚刚开始被破译。使用不同类型的细胞，其中一些可能不是真正的胰岛素反应细胞，也使解释变得复杂。此外，PKB突变形式的慢性过度表达可能使细胞通过替代途径进行适应。另一个潜在的问题是异构体特异性。PKB的三种亚型已被鉴定；然而，在大多数研究PKB在胰岛素刺激的葡萄糖摄取中的作用时，这些都没有区别。虽然所有研究的PKB突变体都基于PKBα，但PKBβ最近被鉴定为大鼠脂肪细胞中以胰岛素依赖方式与GLUT4小泡相关的亚型(12). 有趣的是，PKBβ似乎在功能上与PKBα和PKBγ不同，因为应激激活了PKBα与PKBγ，而不是PKBβ(48).
为了进一步评估PKB在胰岛素刺激GLUT4易位中的作用，我们采用了与以往研究不同的方法。使用微量注射特异性底物肽和抗体来急性抑制内源性PKB作用。微量注射PKB底物肽（KRPRATF）可显著抑制3T3-L1脂肪细胞中胰岛素刺激的GLUT4易位。针对PKBαN末端的抗体也能识别PKBβ，产生了类似的效果。我们进一步表明，PKBβ表达在脂肪细胞分化过程中启动，而PKBα表达下调。伴随着这种变化，我们还观察到分化过程中生长因子反应性的改变，即血小板衍生生长因子（PDGF）刺激PKB磷酸化的能力在脂肪细胞中被关闭，而胰岛素的强烈激活则被破坏。总之，我们的结果强烈支持PKBβ作为参与调节脂肪细胞中胰岛素代谢效应的亚型。
材料和方法
抗体。
针对PKBαN末端（残基3至22）的兔抗体购自圣克鲁斯生物技术公司（N19；加州圣克鲁斯）。羊抗PKBα（残基466至480）、PKBβ（残基455至469，如参考文献所述58)和PKBγ（残基116至128）购自Upstate Biotechnology Inc.（纽约州普莱西德湖）。针对PKBβ的C末端肽（CDQTHFPQFSYSASIRE）产生兔PKBβ抗体。在Ser473或Thr308磷酸化的PKB特异性抗体购自新英格兰生物实验室（马萨诸塞州贝弗利）。单克隆抗血凝素（抗HA）抗体（HA11，克隆16B12）购自BabCo（加州伯克利）。在兔子体内培养多克隆抗GLUT4抗体（R017），以对抗包含GLUT4 C末端的17-氨基酸肽。
肽合成。
利用应用生物系统430A肽合成器结合FastMoc策略合成肽。通过反相高压液相色谱检查纯度，通过氨基酸分析和基质辅助激光解吸电离质谱确认其完整性。检测了两种肽。KRPRAATF是一种与Alessi等人报告的肽密切相关的肽(1)作为PKB的特定底物，除了我们加入赖氨酸以增加其在水溶液中的溶解度。KRPRAAAF是相同的肽，只是苏氨酸被丙氨酸取代。第一肽被发现是体外PKB检测的良好底物。丙氨酸取代肽仅在测试的最高浓度（1 mg/ml）下部分抑制底物肽的PKB磷酸化（数据未显示）。
细胞培养。
如别处所述，培养3T3-L1成纤维细胞（美国型培养物收集）并将其分化为脂肪细胞(55). 简言之，3T3-L1成纤维细胞在添加10%新生小牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中生长和传代。细胞在融合后1至2天分化。分化培养基含有10%胎牛血清（FCS）、250 nM地塞米松、500 nM异丁基甲基黄嘌呤和500 nM胰岛素。3天后，用含有10%FCS和250 nM胰岛素的分化后培养基替换分化培养基。细胞分化后每3天在添加10%FCS的Dulbecco改良Eagle培养基中喂养一次。除非另有说明，否则在融合处使用成纤维细胞，在分化开始后8至15天使用脂肪细胞。稳定表达HA-PKBα或HA-PKBβ的3T3-L1成纤维细胞已在别处描述(52).
微量注射。
如前所述进行微量注射(35). 将生长融合并在盖玻片上分化的细胞转移到Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液中（111 mM NaCl，4.87 mM KCl，1.15 mM CaCl21.22 mM千赫2人事军官41.21 mM硫酸镁4，25.7 mM NaHCO三，10 mM HEPES，2.5 mM葡萄糖，0.5%牛血清白蛋白[BSA]，1 mM丙酮酸钠，pH 7.4），持续45分钟。使用蔡司自动注射系统（德国奥伯科钦卡尔蔡司）和Eppendorf（德国汉堡）微量注射器，在45分钟内进行微量注射。使用Sutter（Novato，Calif.）P-97微量移液器制备微量移液管。将微量注射试剂溶解在微量注射缓冲液中（5 mM磷酸钠[pH7.2]和100 mM KCl）。在微量注射缓冲液的三种变化中通过透析去除抗体制剂中的叠氮化钠。在注射肽（5 mg/ml）或抗体（0.2 mg/ml）后，用胰岛素（100 nM）刺激细胞并通过PM草坪试验分析GLUT4易位之前，将细胞转移到新鲜培养基中，使其恢复60-90分钟。
PM草坪分析。
如Robinson和James所述，GLUT4易位是通过PM草坪试验测定的(46)根据Marsh等人的描述进行修改(37). 简单地说，在盖玻片上生长的3T3-L1细胞在聚乙烯中清洗-我-细胞处理后，用三分之一细胞内缓冲液（70 mM KCl，5 mM MgCl2，3 mM EGTA，1 mM二硫苏糖醇，30 mM HEPES，pH 7.2），并在细胞内缓冲液中设置为0时用探针声波仪（Microson，Farmington，N.Y。然后用兔抗GLUT4抗体（R1159）对这些片段进行免疫标记(27)和Cy3标记的山羊抗兔抗体（英国小查尔丰阿默沙姆）。使用Bio-Read Lasershar MRC-500共焦激光扫描免疫荧光显微镜对盖玻片进行可视化和成像。在同一张盖玻片上，将微注射细胞中GLUT4的易位与紧邻的非注射细胞中的GLUT4易位进行了比较。使用Bio-Read COMOS共焦成像软件分析数据。在每个实验中，针对每个条件分析了六个或更多字段。
细胞处理、代谢标记和提取物制备。
通过将分化的3T3-L1脂肪细胞在含有12.5mM HEPES（pH 7.4）、120mM NaCl、6mM KCl、1.2mM Mg的Krebs-Ringer磷酸盐缓冲液（KRP）中孵育，使其血清饥饿2SO公司4，1 mM氯化钙2，1 mM NaPO4和0.1%（wt/vol）BSA在37°C下刺激前至少2小时。胰岛素（1μM；Eli Lilly）和PDGF（50 ng/ml；Gibco）治疗5或15分钟。如有指示，在添加胰岛素前25分钟，向KRP中添加100 nM沃特曼（Sigma）。为了进行代谢标记，细胞在含有0.5 mCi32P（P）我（ICN）/ml，代替KRP培养，然后按上述方法处理。处理后，用冰镇HES缓冲液（20 mM HEPES[pH7.4]，1 mM EDTA，250 mM蔗糖）清洗细胞三次，并在添加蛋白酶抑制剂（每毫升10μg抑肽酶，每毫升10微克亮氨酸蛋白酶和1 mM苯甲基磺酰氟）的HES缓冲溶液中均质磷酸酶抑制剂（1 mM原钒酸钠、1 mM焦磷酸钠、1 mmM钼酸铵和10 mM氟化钠）通过一个22号针头。以相同的方式获取3T3-L1成纤维细胞，但通过27 gauge针头进行均质。如Clark等人的工作所述，对3T3-L1脂肪细胞进行亚细胞分离(16).
大鼠原代脂肪细胞的制备。
采用胶原酶消化法从雄性Wistar大鼠（100至125 g）附睾脂肪垫中制备原代大鼠脂肪细胞(49). 在37°C下，在KRP（含2%BSA）中孵育并搅拌1小时后，用或不用1μM胰岛素处理细胞15分钟。通过离心法收集脂肪细胞，并用抑制剂在HES缓冲液中均匀化，15次通过27号针头。
免疫沉淀。
在裂解缓冲液（50 mM Tris[pH7.5]、100 mM NaCl、1%Triton X-100、25 mMβ-甘油磷酸、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂）中收集细胞，并通过15次穿过22号针头使其均质。在冰上培养15分钟后，以12800×克在4°C下保持15分钟。将上清液添加到含有封闭的抗体结合蛋白A-G珠（Pierce）的Eppendorf管中，并在4°C下孵育至少2小时，以进行免疫沉淀。通过离心收集免疫复合物，并用冷裂解缓冲液洗涤两次，用低盐缓冲液洗涤一次（10 mM NaCl，10 mM Tris，pH 7.5）。结合蛋白通过添加凝胶样品缓冲液洗脱。
为了表征PKB抗体和进行PKBβ免疫缺失实验，通过向放射免疫沉淀分析缓冲液（150 mM NaCl、10 mM Tris[pH8]、1%Triton X-100、1%脱氧胆酸钠和0.1%十二烷基硫酸钠[SDS]）中添加100μg细胞裂解物（在HES缓冲液中）进行免疫沉淀补充蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，并在4°C下用抗体结合蛋白A-G珠培养裂解产物。对于PKBβ缺失实验，上清液进行第二轮免疫沉淀。为了分析PKBβ缺失后的裂解物，将免疫沉淀后的上清液等分液进行甲醇-氯仿沉淀(7). 将所得蛋白质颗粒重悬于莱姆利样品缓冲液中，并通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行分析。
电泳和免疫印迹。
蛋白质分析使用Bradford分析试剂（Bio-Rad）或双辛酸蛋白质分析试剂盒（Pierce）进行，以BSA（分数V；Pierse）为标准。根据Laemmli方法进行SDS-PAGE(34)，使用SE400系统（Hoefer）。
固定化pH梯度的双向凝胶电泳（2-DE）完全按照Hill等人的工作进行(24)第一维为非线性pH值3至10的固定化pH梯度，第二维为SDS–7.5%PAGE凝胶。为了制备2-DE样品，HES缓冲液中的细胞裂解物与4体积的甲醇在−20°C下沉淀1 h，然后在10000×克在室温下。去除上清液后，将颗粒风干并在2D样品缓冲液（7M尿素、2M硫脲、40mM Tris、4.4%3-[（3-氯氨基丙基）-二甲氨基]-1-丙磺酸[CHAPS]、84mM二硫苏糖醇、1%Pharmalyte、0.01%溴酚蓝、1mM苯基甲基磺酰氟、，和上述磷酸酶抑制剂）。样品在室温下在超声水浴（Branson）中超声1分钟，然后像以前一样离心。将所得上清液置于阳极处的充油样品杯中，在20°C下对53.5 kV·h进行等电点聚焦。
电泳后，根据Towbin等人的方法将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜（Millipore的Immobilon-P）上(56). 在室温下，将膜在5%脱脂奶粉中的Tris缓冲盐水-吐温（TBST；50 mM Tris[pH7.5]，150 mM NaCl，0.1%吐温20）中封闭1 h，然后在4°C下与相关的一级抗体（在封闭缓冲液或TBST中稀释）孵育过夜。在TBST中用三种不同的缓冲液洗涤30分钟后，用辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）、山羊抗鼠IgG（Amersham）或兔抗羊IgG，视情况而定，用SuperSignal化学发光底物（Pierce）检测免疫反应蛋白。图像是在胶片（富士）或Lumi成像仪（勃林格）上拍摄的。
结果
PKB底物肽或PKB抗体对胰岛素刺激的GLUT4易位的影响。
以前研究PKB在胰岛素刺激的葡萄糖转运中的作用时，利用了两种组分活性蛋白的过表达(18,23,30,54,57)或显性阴性(18,23,29,32,59)PKBα突变体。这些研究产生了相互矛盾的结果，因此我们采用不同的方法来评估PKB在胰岛素刺激的葡萄糖转运中的作用。首先，我们对3T3-L1脂肪细胞进行了微量注射。这种方法避免了突变体慢性过度表达期间可能发生的潜在适应性反应，因为我们通常在微量注射后60至90分钟进行分析。这项技术与PM草坪试验相结合，为检查单个细胞中抑制剂的作用提供了一种方法。使用该系统，我们常规观察到，在注射了对照肽或对照抗体的细胞以及相邻的未注射细胞中，GLUT4的细胞表面水平因胰岛素而增加2.5倍。用3T3-L1脂肪细胞进行微量注射，其中含有一种与先前确定的PKB相对特异性肽密切相关的肽（KRPRAATF）(1)，除了在N末端包含赖氨酸以增加其溶解度。如图所示。A、 底物肽抑制胰岛素刺激的GLUT4易位（66.1±7.8）%(n个= 10). 用丙氨酸取代磷酸化位点苏氨酸的对照肽对GLUT4易位没有显著影响（[7.3±3.7]%，n个= 6). 这表明，注射的底物肽可能通过与PKB的生理底物竞争，干扰了导致GLUT4易位的信号通路的传播。
微量注射PKB底物肽或N末端PKB抗体可抑制胰岛素刺激的GLUT4易位。盖玻片上的3T3-L1脂肪细胞在Krebs-Ringer碳酸氢盐-HEPES缓冲液中预孵育45至90分钟或微量注射0.2 mg/ml纯化的N末端PKB抗体（N19；Santa Cruz）或纯化的兔IgG组分（对照抗体）。改变浸泡缓冲液，使细胞恢复60分钟。然后，按照材料和方法中的描述，在通过PM草坪试验评估PM GLUT4水平之前，用100 nM胰岛素刺激或不刺激细胞20分钟。结果来自四个或多个实验，在这些实验中，针对每个实验中的每个条件，测定了六个或更多领域中的GLUT4水平。*，P（P）与胰岛素刺激（配对t吨测试）。
为了进一步评估PKB在胰岛素刺激的GLUT4易位中的作用，进行了将抗PKB的抗体微注射到3T3-L1脂肪细胞中的研究。针对PKBαN末端的抗体（来自圣克鲁斯的N19）与PKBβ交叉反应，可将胰岛素刺激的GLUT4易位抑制（55.6±7.8）%，而非相关抗体对此过程没有显著影响（图。B） ●●●●。我们还检测了多种C末端PKB抗体的作用，包括以下所述的异型特异性绵羊PKBβ抗体。然而，这些抗体均未对该系统中胰岛素刺激的GLUT4易位产生显著影响（数据未显示）。这可能表明体内无法到达C末端，或者与该结构域结合的抗体对PKB功能的破坏性较小。
3T3-L1脂肪细胞PDGF反应性的下调。
微量注射数据表明，PKB的激活是完全介导胰岛素刺激的脂肪细胞GLUT4易位所必需的。然而，据报道，PDGF也激活脂肪细胞中的PKB，对GLUT4易位没有任何显著影响(10,51,54)增加了PKB活化可能不足以发挥胰岛素作用的可能性。为了进一步探讨这个问题，我们比较了胰岛素和PDGF对3T3-L1脂肪细胞及其前体细胞3T3-LI成纤维细胞PKB活化的影响。由于Ser473和Thr308的磷酸化对PKB激活至关重要，胰岛素和PDGF对3T3-L1细胞中PKB磷酸化的影响最初通过磷酸化特异性PKB抗体的免疫印迹进行检测（图。A） ●●●●。用胰岛素或PDGF处理3T3-L1成纤维细胞15分钟后，Ser473和Thr308上的PKB磷酸化，PDGF比胰岛素更有效（图。A） ●●●●。3T3-L1脂肪细胞对胰岛素和PDGF的反应与成纤维细胞不同。在这种情况下，只有胰岛素刺激PKB磷酸化，如磷酸化特异性PKB抗体所检测到的（图。A） ●●●●。
生长因子反应的变化伴随3T3-L1脂肪细胞的分化。（A） 用1μM胰岛素（I）或50 ngPDGF/ml（P）刺激血清饥饿的3T3-L1成纤维细胞或脂肪细胞15分钟或不治疗（B）。通过SDS-PAGE和用磷酸化-Ser473（pSer473）或磷酸化-Thr308（pThr308）PKB抗体进行免疫印迹分析细胞裂解物（30μg）。（B） 从表达HA-PKBα或HA-PKBβ的3T3-L1成纤维细胞裂解物（100μg）中免疫沉淀HA-PKB a或HA-PKBβ，并通过SDS-PAGE进行分析。用羊PKBα、羊PKBβ或兔PKBβ抗体进行免疫印迹。（C） 用SDS-PAGE和羊PKBα或羊PKBβ抗体的免疫印迹法分析为A组制备的细胞裂解物（30μg）。标记为带1的带显示出相同的电泳迁移率。
为了将这些结果与特定PKB亚型的磷酸化相关联，使用表达HA标记形式的PKBα或PKBβ的3T3-L1成纤维细胞的稳定细胞系，通过免疫印迹法检测PKB抗体的亚型特异性。用单克隆HA抗体从裂解物中免疫沉淀HA标记的PKB，并用一组PKB抗体进行免疫印迹。绵羊PKBβ抗体免疫印迹HA-PKBβ，但与HA-PKBα没有可检测的交叉反应性（图。B） ●●●●。相反，绵羊PKBα抗体免疫印迹HA-PKBα和HA-PKBβ，而兔PKBβ抗体与HA-PKB。B） ●●●●。
上述数据表明，绵羊PKBβ抗体具有亚型特异性，至少在免疫印迹方面是如此；然而，绵羊PKBα抗体与PKBβ有相当程度的交叉反应。然而，我们继续使用羊PKB抗体检测PKBα和PKBβ的相对表达以及生长因子对其电泳迁移率的影响。如图所示。C、 绵羊PKBα和PKBβ抗体在平均分子量为60kDa的3T3-L1细胞中标记了条带，与计算的56kDa分子量一致。虽然在基底成纤维细胞中检测到一条单一的免疫反应带，但在基底脂肪细胞中检测出另一条分子量较低的带（带0），带有PKBα或PKBβ抗体（图。C） ●●●●。在分化过程中，PKBβ抗体标记的条带上调，而成纤维细胞中PKBα抗体标记条带的强度与脂肪细胞中两条条带的结合强度没有显著差异（图。C） ●●●●。与图所示结果一致。A、 胰岛素和PDGF都引起成纤维细胞PKB电泳迁移率的改变，而只有胰岛素引起脂肪细胞的迁移。有趣的是，与成纤维细胞相比，脂肪细胞中PKBα和PKBβ的电泳位移更为显著。此外，在胰岛素处理的脂肪细胞中，条带0几乎定量地移动到略高于条带1的位置（标记条带2），而条带1的表观迁移率和强度没有变化（图。C） ●●●●。
PKBβ在脂肪细胞分化过程中高度上调。
脂肪细胞分化后，介导胰岛素代谢调节的关键分子增加。因此，我们进一步研究了分化过程中PKBβ表达的变化，发现分化期间PKBβ的表达增加与GLUT4的表达密切相关（图。A） ●●●●。PKBβ和GLUT4的最大增加发生在第6天之后，此时去除分化培养基，并用仅添加10%FCS的培养基喂养细胞（图。A） ●●●●。分化开始前未检测到GLUT4表达（第0天，图。A） ●●●●。然而，检测到低水平的PKBβ（第0天，图。A） ●●●●。初步实验表明，PKBβ的表达可能与细胞融合有关。通过从不同汇流处的3T3-L1成纤维细胞中获取的免疫印迹裂解物来检测这种可能性。如图所示。B、 在50%的汇合处，成纤维细胞中未检测到PKBβ，但在3T3-L1成纤维细胞汇合处观察到低水平表达。然而，向脂肪细胞分化诱导了更显著的PKBβ表达上调（图。B） ●●●●。
脂肪细胞分化诱导PKBβ表达。（A） 在分化过程的每一天收获3T3-L1细胞，并分别用绵羊PKBβ抗体或兔抗GLUT4抗体（R017）通过免疫印迹分析PKBβ（●）或GLUT4（○）的表达。免疫反应信号（以Lumi-Imager单位获得）根据每个样品获得的总蛋白进行调整，然后以最大值的百分比表示。结果代表了两个单独的实验。（B） 3T3-L1成纤维细胞在亚融合时（50%或90%）或达到融合后1天（对照后）采集。分化完成后第8天（adip）采集3T3-L1脂肪细胞。细胞裂解物（30μg）通过SDS-PAGE和羊PKBβ抗体免疫印迹分析PKBβ表达水平。
脂肪细胞中PKBα表达下调。
上述数据清楚地证明了脂肪细胞分化过程中PKBβ表达的诱导。然而，虽然PKBα在成纤维细胞中高表达，但由于抗体交叉反应，其在脂肪细胞中的表达尚不清楚。因此，为了更清楚地确定PKBα的表达，我们对用特异性羊PKBβ抗体去除PKBβ的细胞裂解物进行免疫印迹。与图一致。C、 在PKBβ免疫缺失之前，PKBα抗体在成纤维细胞和脂肪细胞中检测到强度相似的条带，而在脂肪细胞中观察到PKBβ的大量诱导（图。A） ●●●●。用羊PKBβ抗体进行免疫耗竭后，几乎所有免疫反应性PKBβ都从脂肪细胞裂解物中去除（图。A） ●●●●。当用PKBα抗体免疫印迹相同的样品时，PKBβ免疫缺失前后成纤维细胞的差异不大，表明PKBα在成纤维细胞中高水平表达。然而，在PKBβ耗尽后，脂肪细胞中使用该抗体的免疫标记显著减少，这表明大多数PKBα免疫反应是由于这些细胞中的PKBβ引起的，并且PKBβ是3T3-L1脂肪细胞中表达的主要亚型（图。A） ●●●●。为了确定这是否是脂肪细胞的一般特征，我们对从大鼠脂肪中分离的脂肪细胞进行了类似的原代培养。在PKBβ免疫缺失之前，PKBα和PKBβ抗体都检测到一条带，该带显示了胰岛素治疗后电泳迁移率的改变（图。B） ●●●●。然而，在PKBβ缺失后，在大鼠脂肪细胞裂解物中未检测到PKBα，这表明这些细胞未表达显著水平的PKBα（图。B） ●●●●。
PKBβ是脂肪细胞中的主要亚型。（A） 用羊PKBβ抗体进行连续两轮免疫沉淀，去除血清饥饿的3T3-L1成纤维细胞（Fib）或3T3-LI脂肪细胞（Ad）的细胞裂解物（100μg）中的PKBβ。通过SDS-PAGE和羊PKBα或羊PKBβ抗体的免疫印迹分析20毫克裂解物（裂解物）和五分之一免疫沉淀上清液（PKBβ-IP后）。（B） 用1μM胰岛素（I）处理15分钟或左基底（B）的分离的大鼠脂肪细胞的细胞裂解物（100μg）中PKBβ被耗尽，并如图A所述进行分析。（C）用绵羊PKBβ抗体对100μg由过表达HA-PKBα的3T3-L1脂肪细胞制备的细胞裂解物进行免疫沉淀。免疫沉淀（PKBβ-IP）和10μg裂解物（裂解物）用单克隆HA抗体通过SDS-PAGE和免疫印迹分析HA-PKBα的存在。
对这些观察结果的一个微不足道的解释是，PKBα和PKBβ异构化，因此在PKBβ免疫缺失期间，所有PKBα都被去除。然而，这似乎不太可能，因为PKB分子之间的相互作用已被证明是亚型特异性的，因为PKB-α的Akt同源结构域协同免疫沉淀PKBα而非PKBβ(21). 然而，我们利用3T3-L1脂肪细胞过度表达HA-PKBα来解决这种可能性。如图所示。C、 在PKBβ免疫沉淀物中未检测到与HA-PKBα相对应的信号，这表明在这些条件下，PKBα不会与PKBβ共同免疫沉淀。
胰岛素而非PDGF刺激3T3-L1脂肪细胞中的PKBβ磷酸化。
上述数据表明，PKBβ是图中观察到的3T3-L1脂肪细胞中胰岛素特异性PKB磷酸化最相关的亚型。A.为了验证这一结论，我们接下来用异型特异性抗体进行免疫沉淀，检测PKB异型体的磷酸化。为了检测PKBα磷酸化的程度，有必要在用PKBα抗体进行免疫沉淀之前先耗尽PKBβ的裂解物。在这些实验中，我们还检测了刺激5分钟后胰岛素和PDGF的作用，以评估PDGF是否对PKB活性有短暂影响。胰岛素（而非PDGF）刺激3T3-L1脂肪细胞中免疫沉淀PKBα的磷酸化，如磷酸化PKB抗体所检测到的（图。A） ●●●●。然而，该信号很可能代表由PKBα抗体免疫沉淀的残余PKBβ（图。A） ●●●●。在对胰岛素的反应中观察到PKBβ磷酸化的显著增加，而PDGF在刺激5或15分钟时对PKBβ磷酸化几乎没有影响（图。A） ●●●●。通过3T3-L1脂肪细胞的免疫沉淀直接检测PKBβ磷酸化，代谢标记为32P（图。B） ●●●●。在基础条件下观察到低水平的组成性磷酸化，胰岛素刺激导致PKBβ磷酸化增加三倍（图。B） ●●●●。胰岛素刺激的磷酸化伴随着电泳迁移率的改变，移位的带被磷酸化Ser473 PKB抗体特异性检测到（图。B） ●●●●。与之前的结果一致（图。和A） PDGF对3T3-L1脂肪细胞PKBβ磷酸化无明显影响。
胰岛素而非PDGF刺激3T3-L1脂肪细胞中PKBβ的磷酸化。（A） 从100μg 3T3-L1裂解液中免疫沉淀PKB亚型，3T3-LI裂解液由未刺激细胞（B）或用1μM胰岛素（I）或50 ngPDGF/ml（P）处理5或15分钟的细胞制备。在PKBα免疫沉淀的情况下，PKBβ首先通过连续两轮免疫沉淀从细胞裂解液中去除。用SDS-PAGE和免疫印迹法分析免疫沉淀物，分别用磷酸化-Ser473（pSer473）或磷酸化-Thr308（pThr308）PKB抗体或羊PKBβ抗体（PKBβ）。（B） PKBβ免疫沉淀自32使用羊PKBβ抗体，用1μM胰岛素（I）或50 ngPDGF/ml（P）处理15或左侧基底部（B）的P-标记3T3-L1脂肪细胞，并用SDS-PAGE进行分析。对聚偏二氟乙烯膜进行放射自显影（autorad.），然后用磷酸化-Ser473抗体（pSer473）进行免疫印迹。
2-DE用于进一步检测脂肪细胞中PKBβ磷酸化。PKBβ免疫沉淀自32P-标记3T3-L1脂肪细胞，然后进行2-DE和放射自显影。在基底脂肪细胞中检测到两个分子量相似但pIs不同的斑点（斑点1和2，图。A） ●●●●。这些磷酸点的观察pI为5.6至5.8，与PKBβ（5.9）的计算值一致。两个磷酸化-PKBβ点的存在与构成磷酸化的两个位点一致，其中点1和点2分别代表单磷酸化和双磷酸化形式。胰岛素刺激导致点1和点2的强度增加，以及32酸性更强的pI的额外点（点3）的P标记（图。B） ●●●●。为了确定差异磷酸化形式PKBβ的相对丰度，我们进行了2D免疫印迹。除了点1和2之外，在基础脂肪细胞裂解物的2D印迹中还检测到pI6处的点，该点代表未磷酸化的PKBβ（点0，图。C） ●●●●。仔细检查图。C表明，在基础条件下，大多数PKBβ要么是未磷酸化的（点0），要么是单磷酸化（点1），只有一小部分是双磷酸化的。胰岛素刺激导致0点完全消失，2点强度显著增加，3点出现（图。D） ●●●●。还检测了PDGF刺激对PKBβ斑点2D模式的影响。与之前的结果一致（图。和)，用50 ng/ml PDGF刺激3T3-L1脂肪细胞15分钟，并没有导致胰岛素引起的2D PKBβ点的左移（对比图。C至E）。此外，用100 nM沃特曼蛋白预处理细胞完全抑制了胰岛素对PKBβ2D模式的影响（图。F） ，与报道的胰岛素刺激的PKB激活的PI3K依赖性一致。
通过2-DE分析3T3-L1脂肪细胞中胰岛素刺激的PKBβ磷酸化32用兔抗PKBβ抗体从细胞裂解液中免疫沉淀PKBβ，并通过2-DE和放射自显影术进行分析。用2-DE和兔抗PKBβ抗体免疫印迹法分析未经处理的3T3-L1脂肪细胞（C）或用1μM胰岛素处理15分钟的脂肪细胞（D）、50 ng/ml PDGF处理15分钟（E）或100 nM沃特曼蛋白处理40分钟（F）制备的裂解物（150μg）。面板A和B的聚偏二氟乙烯膜的免疫印迹结果与面板C和D的结果相似。
胰岛素刺激PKBβ向PM和HDM组分的移位。
除了磷酸化外，膜移位被认为是激活PKB所必需的。目前的PKB激活模型表明，PKB通过其补体同源结构域被受体激活的PI3K产生的3′-磷脂酰肌醇招募到PM，其中PKB在Ser473和Thr308被3′-磷酸肌醇依赖激酶1（PDK1）和PDK2磷酸化（参考文献综述2和40). 我们和其他人以前曾报道过胰岛素和PDGF刺激脂肪细胞中的PI3K，但每种情况下酶的亚细胞分布不同(16,41,45). 在PDGF中，我们观察到PM组分中的PI3K活性显著增加，而在胰岛素中，它在与IRS-1和/或-2相关的高速颗粒（HSP）组分中富集(16). 因此，我们接下来研究了PKBβ在这些组分中的分布。在基础条件下，几乎所有免疫反应性PKBβ都出现在胞浆中（图。). 与之前的结果一致，细胞质组分中的基础PKBβ被分解为两条带，对应于图中的带0和带1。A.在基础状态下HSP组分中检测到的一条带显示出与带0相似的明显电泳迁移率；然而，与细胞质中的条带相反，胰岛素没有诱导HSP条带的电泳迁移率改变（图。). 胰岛素诱导PKBβ向PM和高密度微粒体（HDM）组分移位，而PDGF无影响。这种易位并不代表PKBβ与大蛋白复合物的关联，因为我们发现它在沉降时通过蔗糖上浮，与膜相关蛋白一致（数据未显示）。胰岛素刺激的PKBβ易位仅限于带2，即PKBβ的激活形式，经磷酸化-Ser473 PKB抗体的免疫反应证实（图。). 有趣的是，在胰岛素刺激的5分钟内，胞浆部分中的PKBβ从带0几乎定量地转移到带2，同时Ser474磷酸化增加（图。). 这表明PKBβ要么在细胞溶质中被激活，要么在PM中被激活并迅速从该位点转移到细胞溶质。
胰岛素，而不是PDGF，刺激PKBβ向3T3-L1脂肪细胞膜部分的易位。用胰岛素（I）或PDGF（P）刺激3T3-L1脂肪细胞5或15分钟或左基底部（B）。按照材料和方法中的描述，通过差速离心将细胞均质并亚分离，以生成PM、HDM、HSP（也称为LDM）、胞浆（CYT）和线粒体核（M/N）部分。通过SDS-PAGE和羊PKBβ（PKBβ）或磷酸化-Ser473 PKB（pSer473）抗体的免疫印迹分析每个组分的20微克。
胰岛素诱导PKBβ与含GLUT4小泡的相关性的最新研究(12)及其成分的磷酸化(33)提示PKBβ可能直接介导GLUT4易位。与Calera等人的报告相反(12)对于大鼠脂肪细胞，我们没有在基础状态下的膜部分中检测到PKBβ，也没有在3T3-L1脂肪细胞中观察到胰岛素诱导的PKBβ向HSP部分（也称为低密度微粒体[LDM]部分）的显著易位（图。). 为了进一步评估PKBβ是否与GLUT4囊泡直接相互作用，我们检测了胰岛素或PDGF刺激GLUT4和PKBβ过度表达的3T3-L1成纤维细胞GLUT4移位的能力。胰岛素或PDGF激活PKBβ并没有改变GLUT4在这些细胞中的亚细胞位置（数据未显示），这表明PKBβ的激活不足以刺激该系统中GLUT4的易位。
讨论
在本研究中，我们提供了进一步的证据支持丝氨酸/苏氨酸激酶PKB在脂肪细胞胰岛素刺激葡萄糖转运中的作用。我们发现PKB底物肽或PKB抗体分别抑制胰岛素刺激的GLUT4易位66%和56%。此外，我们已经获得证据表明PKBβ亚型参与胰岛素作用：（i）PKBβ的表达在脂肪细胞分化过程中显著增加，而PKBα的表达在此过程中显著减少，（ii）大鼠脂肪细胞原代培养物中没有检测到的免疫反应性PKBα，以及（iii）胰岛素而非PDGF刺激3T3-L1脂肪细胞中PKBβ磷酸化和向膜移位。
先前的研究报道了关于PKB在胰岛素刺激的葡萄糖转运中的作用的相互矛盾的发现(18,23,29,30,32,54,57,59). 我们相信，本研究为PKB参与胰岛素作用提供了有力支持，并澄清了出现的一些潜在矛盾领域。首先，如下文详细讨论的，我们的研究表明，在脂肪细胞葡萄糖转运的胰岛素调节中，仅PKBβ而非PKBα发挥作用。这可能很关键，因为许多以前的研究使用的试剂要么专门针对PKBα，要么至少对不同的PKB亚型具有可疑的特异性。其次，我们采用了一种策略，即微量注射抗体或底物肽，然后在60至90分钟后检查这些试剂对GLUT4贩运的影响。这可能克服了可能在更长时间内对cDNA表达作出反应的潜在细胞适应机制。
PKBα与PKBβ的作用。
通过免疫印迹法对3T3-L1成纤维细胞和脂肪细胞中PKBα和PKBβ的相对表达进行初步比较，结果表明，虽然PKBβ上调，但PKBα的表达并未因脂肪细胞分化而显著改变（图。C） ●●●●。然而，由于发现PKBα抗体与PKBβ发生交叉反应（图。B） ，3T3-L1脂肪细胞中PKBα免疫反应的一部分可能代表PKBβ，PKBβ在这些细胞中高度表达。在用PKBα抗体进行免疫印迹之前，我们通过从细胞裂解物中去除PKBβ来验证这一假设，并发现事实上，脂肪细胞中的大多数PKBα免疫反应性都被PKBβ去除了（图。A） ●●●●。相反，在去除成纤维细胞裂解物中的PKBβ后，仍有大量PKBα免疫反应性（图。A） ●●●●。与我们在3T3-L1脂肪细胞中的发现一致，我们还发现大鼠脂肪细胞中几乎没有PKBα，PKBβ是主要的亚型（图。B） ●●●●。基于目前的研究，我们预测先前关于大鼠脂肪细胞中胰岛素激活的PKBα活性的报道可能是由于抗体交叉反应。
这些结果表明，在成纤维细胞分化为脂肪细胞的过程中，异型表达发生了变化。由于PKBα和PKBβ的氨基酸序列81%相同，脂肪细胞分化时亚型表达的特定变化可能具有功能性。成纤维细胞是一种高度增殖的细胞类型，因此PKBα似乎在细胞生长和增殖的调节中很重要，其在分化时的下调是适当的，因为脂肪细胞是终末分化而非增殖的。另一方面，脂肪细胞分化过程中PKBβ表达的诱导与GLUT4相似（图。A） 这意味着PKBβ在脂肪细胞代谢调节中的作用。进一步的支持来自我们的观察，即大鼠脂肪细胞表达高水平的PKBβ（图。B） 以及报道的棕色脂肪组织中PKBβmRNA的高表达(三). Sol8肌肉细胞分化时也观察到PKBβmRNA的诱导(13)和C2C12肌管(三)支持PKBβ在肌肉细胞和脂肪细胞代谢的胰岛素调节中的作用。在我们的研究中，在低流量、高增殖的成纤维细胞中未观察到PKBβ的表达。当细胞在培养中融合时，观察到PKBβ表达略有增加，随后当成纤维细胞分化为脂肪细胞时，诱导作用更加显著（图。). 综上所述，这些观察结果表明PKBβ的表达通常局限于终末分化的非增殖细胞，PKBβ在代谢调节中发挥作用。PKBβ在未分化细胞中的不当表达可导致细胞不受控制的增殖，NIH 3T3细胞过度表达PKBβ的转化能力证明了这一点(15). 组成活性PKBα在3T3-L1成纤维细胞中的过度表达导致自发分化为脂肪细胞(36). 为了进一步说明不同PKB亚型的作用，比较组成活性PKBβ或PKBγ的过度表达与3T3-L1成纤维细胞中观察到的PKBα的作用可能是有意义的。
PKBβ的激活在3T3-L1脂肪细胞中是胰岛素特异性的。
最近的几项研究比较了脂肪细胞中胰岛素和PDGF的信号传导，基于PDGF无法诱导葡萄糖摄取反映其无法激活相关下游信号通路的假设。事实上，一些研究小组报告了胰岛素激活的PI3K和PDGF激活的PI3G的亚细胞位置之间的差异(16,41,45). 此外，PDGF对磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸（PIP）的水平几乎没有影响三)在3T3-L1脂肪细胞中，而胰岛素诱导显著增加(19). 这些结果表明，虽然PI3K通过3T3-L1脂肪细胞PM处激活的PDGF受体募集而激活，但它可能无法获得合适的底物，因此不能产生PIP升高三同意缺乏PDGF诱导的PIP三在3T3-L1脂肪细胞中，通过电泳迁移率转移、免疫沉淀和32用磷酸特异性抗体进行P标记或免疫印迹，或用2-DE分析等电点位移。此外，PDGF没有像胰岛素观察到的那样刺激PKBβ的膜移位，也没有对PKBβ磷酸化产生暂时性影响（图。A） ●●●●。胰岛素特异性进一步支持PKBβ在脂肪细胞葡萄糖代谢调节中的作用。
之前的三项研究报告了PDGF对3T3-L1脂肪细胞PKB的不同影响(10,51,54). 两项研究利用磷酸化-Ser473 PKB抗体，发现PDGF诱导的小PKB磷酸化（～20%的胰岛素效应）。在细胞裂解物的免疫印迹中，我们无法在每毫升50 ng PDGF处理的3T3-L1脂肪细胞中检测到PDGF刺激的PKB磷酸化（图。A） ，但有时在免疫沉淀物中观察到非常弱的PDGF诱导的PKBβ磷酸化（图。A） ●●●●。Tanti等人通过免疫沉淀偶联激酶分析观察到3T3-L1脂肪细胞中PDGF刺激PKB的显著激活（达到胰岛素效应的50%）(54). 这些研究之间存在差异的原因尚不清楚。一种可能的解释是3T3-L1脂肪细胞培养物完整性的差异。由于PKBα是3T3-L1成纤维细胞中的主要亚型，并且在这些细胞中被PDGF强烈激活，脂肪细胞培养物中成纤维细胞污染程度的增加可能会引起PDGF对PKB的反应。在使用与PKBα具有高亲和力的抗体进行免疫沉淀的情况下，这可能会进一步放大。
3T3-L1脂肪细胞PKBβ活化的调节。
我们对3T3-L1脂肪细胞中PKBβ活化的综合数据表明，基础脂肪细胞中存在未磷酸化（带0和点0）和磷酸化（带有1和点1和点2）PKBβ。此外，磷酸化PKB分离成具有不同pI的两个位点表明，在基底3T3-L1脂肪细胞中存在两个不同磷酸化形式的PKBβ群体。3T3-L1脂肪细胞中PKBβ的组成性磷酸化在Ser474或Thr309上均未发生，因为在基础脂肪细胞中未检测到磷酸化PKB抗体的显著信号（图。A和A） ●●●●。报道了PKBβ转染HEK-293细胞的两个组成性磷酸化位点，即Ser125和Thr451(39). 因此，对我们结果的一种解释是，约50%的PKBβ是组成性磷酸化的，可能在3T3-L1脂肪细胞（点1）的基础状态下的Ser125或Thr451上，而少量PKBβ在两个残基上都是双重磷酸化，导致酸性更强的pI（点2）。胰岛素导致非磷酸化PKBβ（点0）完全消失，点2和3的免疫反应性增加，伴随着胰岛素诱导的磷酸化（图。A至D）。最近的一项研究表明，当在NIH 3T3细胞中表达时，Thr450引物PKBα的组成型磷酸化可用于随后的生长因子刺激(9). 因此，一种可能性是胰岛素刺激一个或两个组成位点（Ser125和Thr451）上的基础未磷酸化PKBβ（点0）磷酸化，但只有基础磷酸化PKAβ（点1和点2）在激活位点（Ser474和Thr309）上磷酸化。由于目前的数据没有提供关于不同电荷PKBβ亚型磷酸化位点的信息，需要进一步的研究来证实3T3-L1脂肪细胞中的这一假设。有趣的是，在大鼠脂肪细胞中只观察到一条电泳迁移率介于带0和带1之间的单一带。胰岛素刺激后，整个带移到对应于带2的位置。大鼠脂肪细胞基带的磷酸化状态尚待确定，并应提供有关组成性磷酸化作用的宝贵数据。
目前生长因子刺激的PKB激活模型表明，PI3K的产物向PM招募PDK1和PKB，其中PDK1磷酸化并激活PKB(2,4,40). 发现肉豆蔻酰化棕榈酰化对PM的强制易位足以诱导Thr308和Ser473的PKB磷酸化，这支持了PKB激活中膜易位的要求(5). 在本研究中，我们观察到磷酸化PKBβ向PM和HDM组分的特异性易位，以响应3T3-L1脂肪细胞的胰岛素处理。与PDGF不能诱导PKBβ磷酸化一致，未观察到PDGF刺激引起的膜移位。有趣的是，虽然一些PKBβ仍然与PM和HDM相关，但在胰岛素刺激后5分钟内，在胞浆中观察到活化的PKBβ的主要部分（图。). 这些结果表明，PKBβ可以在细胞溶质中被激活，或者更可能的是，在细胞膜激活后，大多数PKBβ返回细胞溶质，在那里可以磷酸化其生理底物。胰岛素诱导PKBβ与含GLUT4小泡关联的最新报道(12)及其成分的磷酸化(33)提示PKBβ可能直接调控GLUT4易位机制。我们没有观察到PKBβ向HSP-LDM组分的任何显著募集，HSP-LDM组分在3T3-L1脂肪细胞中含有GLUT4的胰岛素反应池。然而，我们的检测可能不够敏感，无法检测到该组分的低水平PKBβ募集。因此，我们通过检测胰岛素或PDGF在表达PKBβ和GLUT4的3T3-L1成纤维细胞中激活PKBβ的作用，进一步验证了PKBβ直接介导GLUT4易位的假设。胰岛素和PDGF均未刺激这些细胞中的GLUT4易位，这表明要么需要另一条信号通路，要么成纤维细胞缺乏GLUT4转位所需的下游信号分子或机制的表达。
总之，我们的数据表明PKB在脂肪细胞中的胰岛素作用中具有重要作用。我们不能排除其他平行通路的作用，如PKCλ和/或PKCζ。通过微量注射PKB底物肽或PKB抗体，我们观察到胰岛素刺激的GLUT4易位到PM的抑制率为～60%。因此，可以想象，残余胰岛素作用是由PKB非依赖性途径引起的。需要进一步努力来确定这种替代途径，并确定脂肪细胞中PKBβ的下游靶点。
