阿尔茨海默病神经纤维缠结成熟度的可视化：生物标记物研究的临床病理学视角

2.1. 阿尔茨海默病

阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，由阿洛伊斯·阿尔茨海默氏（Alois Alzheimer）医生首次报道，患者患有痴呆症、记忆力丧失和妄想症。^1,2 尸检大脑分析显示成熟的缠结和Aβ斑块，¹²正如1985年哈恰图里亚标准首次讨论的那样，这成为了推荐的同名疾病的标志性神经病理学。¹³目前，AD已确认死后的使用美国老年痴呆症协会（NIA‐AA）提供的指南。^14,15NIA‐AA建议使用三种不同的测量方法，包括Thal淀粉样期（A；Aβ斑块¹⁶)Braak缠结阶段（B；NFT¹⁷)，和修改的建立阿尔茨海默病注册协会（CERAD，C；神经炎斑块¹⁸)以获得“ABC”分数。^14,15 验尸前AD痴呆的诊断可以通过病史、家族史、认知测试、生物流体测试和神经影像学进行。¹⁹

2.2. 微管相关蛋白tau

tau蛋白于1975年首次被发现（图1)并在微管稳定中起主要作用。²⁰编码蛋白tau的基因，微管相关蛋白tau(地图)，后来于1986年定位于染色体17q21²¹（图1). Tau是一种内在无序蛋白质，通常不采用二级结构（综述见Avila等人。²²). 通过磷酸化调节，τ蛋白的主要功能是促进微管蛋白聚合和稳定微管。^23,24一旦tau被磷酸化，它就会从微管中释放出来，并促进微管的分解。²⁵以丝状和过度磷酸化τ堆积为特征的疾病被称为τ蛋白病，最初由Bernardino Ghetti博士与Maria Grazia Spilantini博士共同创造。²⁶tau病包括AD和伴有tau的额颞叶变性（例如Pick’s病、皮质基底部变性、进行性核上性麻痹；有关综述，请参阅Murray和DeTure，²⁷科瓦茨，^28,29Götz等人。，³⁰和Murray等人。³¹).

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图1

1875年至2020年特殊染色、抗体发展、生物标记物和阿尔茨海默病（AD）/神经纤维缠结成熟度研究里程碑的历史概述。蓝色，染色技术发达；紫色，AD里程碑式研究；橙色，抗体发育；绿色，生物标志物开发。勾号表示1年的间隔。

地图mRNA（以下称为tau mRNA）在氨基末端（N末端）和羧基末端（C末端）交替剪接。零个、一个或两个插入物（0N、1N、2N）可以在tau mRNA的N末端交替拼接³²（图2). 此外，tau mRNA C末端的第十外显子可以选择性剪接，从而包含或排除第二个微管结合重复区（3R，4R）。³³与3R-tau相比，4R-tau蛋白与微管结合的亲和力更高³⁴比3Rτ翻得更快。³⁵在成人大脑中，3R和4Rτ蛋白的水平大致相同。³⁶然而，3R tau mRNA的含量是4R tau的2到3倍。³³tau的选择性剪接是一个发育调控过程，因为胎儿大脑只包含0N3R tau，而成人大脑包含所有六种亚型。³²异构体在神经系统的不同神经元类型中有不同的表达。例如，在齿状回的海马颗粒细胞中，仅表达3R tau mRNA，而安门角的一些锥体细胞表达3R和4R tau m RNA。³³

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图2

Tau结构¹⁹⁶用tau抗体表位定位。对角线条纹表示交替拼接区域。在每个子目中，命名的τ抗体与其识别基序相对应，并附有相关参考文献。

3.2. 成熟的缠结

尽管尚未命名，但成熟缠结（图三)1907年阿尔茨海默病首次报道为神经元中厚厚的嗜银纤维。^1,2成熟的缠结存在于细胞核缩小和/或移位的神经元中，嗜银原纤维以“篮子状或吊索状”的形状取代细胞质。¹²NFT呈现其所占据神经元的形状，因此锥体神经元中的成熟缠结通常呈火焰状。除了嗜银性外，^10,17,42成熟的缠结是泛素阳性^48,49并且容易被多种tau抗体染色，这将在第3节中进一步讨论。

3.3. 幽灵缠结

幽灵缠结，NFT成熟度更高的水平（图三)最初被阿尔茨海默病描述为神经元和细胞核解体后剩下的纤维。^1,2这些细胞外缠结不太嗜银，看起来比成熟缠结更松散。^2,10,12此外，与细胞内成熟缠结的嗜碱性特性相比，苏木精和伊红（H&E）使幽灵缠结呈现嗜酸性。⁵⁰幽灵缠结是泛素阳性¹⁰也可以被胶质突起浸润。^12,50由于AD大脑中的神经元死亡多于幽灵缠结，⁵¹在评估NFT积累和神经元死亡之间的关系时，应考虑共存病理的贡献。^41,52

4.1. 染色技术可追溯tau蛋白的发现

苏木精，创建于19世纪40年代，⁵⁹是一种带正电的碱性染料。⁶⁰Eosin创建于1871年，⁵⁹是一种带负电荷的酸性染料。⁶⁰H&E最初是在1875年至1878年间一起使用的⁵⁹（表1，图1)作为形态学染色，苏木精将细胞核染色为蓝色（嗜碱性），伊红将细胞质和细胞外基质染色为粉红色（嗜酸性；⁶⁰图4). H&E是许多实验室常用的常规染色方法，用于观察AD中神经元的丢失以及成熟缠结和幽灵缠结。^50,61,62,63与未受影响的神经元相比，成熟的缠结表现为嗜碱性，而幽灵缠结由于星形胶质细胞突起的浸润而呈嗜酸性。⁵⁰

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图4

神经纤维缠结（NFT）成熟度的特殊染色和tau免疫组化。在阿尔茨海默病（AD）大脑海马CA1区拍摄每种染色技术的代表性图像。常规和特殊染色包括Bielschowsky银染色、H&E、刚果红、硫黄素-S（硫代-S）和噻嗪红。所有常规和特殊的染色都能识别成熟缠结和幽灵缠结。对于免疫组织化学，使用了Alz‐50、MC‐1、CP13、AT8、PHF‐1，pS396、TauC3、GT‐38、Ab39和MN423。Tau抗体识别一系列NFT成熟度水平。免疫组织化学用苏木精进行复染。我们感谢García‐Sierra博士的噻嗪红图像。箭头，三角；闭合箭头，成熟缠结；开箭，幽灵缠结。比例尺测量25μm。

刚果红（表1，图4)是一种染色剂，最初于1884年作为棉染料用于纺织工业⁵⁹（图1). 这种染料将显示双折射，其中有两个折射率，这取决于偏振光的方向。⁶⁴因此，使用偏振光显微镜，刚果红在交叉极化下显示出传统上“苹果绿”的反常颜色。⁶⁴1886年，刚果红首次用于染色轴突。⁵⁹到1922年，刚果红被用于观察组织切片中的淀粉样蛋白⁵⁹它与β褶皱板结合。^65,66这是因为刚果红能够自我组装成与这些蛋白质结构的β构象兼容的条带。⁶⁷50多年来，这种染料一直被用于AD神经病理学的可视化，包括成熟的缠结和重影缠结。⁶⁸刚果红不会使预棱镜染色，可能是因为缺乏纤维结构。

银染色（表1)是第一种用于可视化AD神经病理学的技术。具体来说，阿尔茨海默病首次使用贝尔肖夫斯基银染色法来可视化他的第一个患者的神经病理学^1,2,12（图4). 这种方法是贝尔肖夫斯基于1902年发明的⁶⁹（图1)在整个现代时代，改良的贝尔斯乔夫斯基银染色方案一直在世界各地使用。开发了其他银染色技术，包括Bodian、Gallyas和Campbell‐Switzer（有关综述，请参阅Uchihara⁷⁰)，这一切都已经习惯了。阳性银染色被称为嗜银染色，与非嗜银结构相比，其颜色更暗。这是由于银离子还原为金属颗粒，然后可以通过光学显微镜观察到金属颗粒（有关综述，请参阅内原⁷⁰). 虽然成熟缠结和幽灵缠结都是嗜银的，但幽灵缠索的染色不如成熟缠结强烈¹²（图4). 银染色方法有多种修改，这影响了3R/4R神经病理学的偏好。⁴⁵Gallyas银染色更倾向于4R tau神经病理学，而Campbell‐Switzer更倾向于3R tau神经病理学。⁴⁵这可能解释了为什么Gallyas银染法据说能染上三角帆，^43,44因为它们主要由4Rτ组成。^44,63,71,72

硫黄素是20世纪50年代发展起来的一组荧光染料（图1)就像刚果红一样，它会与β褶皱床单结合。⁷³硫黄素-S（表1，图4)在440 nm处激发，在455至600 nm的波长范围内可见，可以检测AD脑中的aβ斑块和高级缠结。⁷⁴由于Aβ斑块和NFT均由硫黄素-S显示，因此形态学特征用于区分病理。具体来说，Aβ斑块是圆形的细胞外堆积物，可能含有营养不良的神经突，呈球状或线状；而NFT在细胞内区域呈神经元形状，一旦神经元死亡，可能会残留在细胞外空间。将改良的Bielschowsky和Bodian银染色方法与硫黄素-S进行比较，所有技术都能识别斑块和NFT。⁷⁵然而，改良Bielschowsky银染和硫黄素-S在识别神经炎斑块方面的表现优于Bodian银染。⁷⁵由于不含β折叠片，因此硫黄素-S不容易显示预棱镜。

4.2. 发现tau蛋白后开发的染色技术

1985年4月，Yen等人。报告了小鼠单克隆抗体Ab39，该抗体是为了鉴定NFT病理学而开发的（表2，图1). 该研究报告称，Ab39抗体识别AD大脑中的大多数成熟缠结。⁷⁶该表位目前尚不清楚，但据信可以识别NFT特有的构象表位。⁷⁷自那时以来，除了成熟缠结外，Ab39还被用于识别幽灵缠结⁷⁸（图4). 该抗体可通过Shu‐Hui Yen博士获得，但不再生产或分发。同年10月，Binder等人。报告了小鼠单克隆Tau‐1抗体（表2，图1)，其被开发用于确定tau在哺乳动物中枢神经系统中的定位。⁷⁹该抗体的表位是氨基酸162-210⁸⁰（表2，图2)核心序列包含192-204个氨基酸^81,82并可通过Millipore Sigma（目录号MAB3420）获得。Tau‐1识别AD脑组织切片去磷酸化后的成熟缠结和较小程度的幽灵缠结和前角。^10,83

1986年，Wolozin等人。报告了小鼠单克隆抗体Alz‐50（表2，图1)旨在研究腹侧前脑胆碱能神经元的NFT病理学。³⁷不连续表位映射到氨基酸2-10和312-342⁸⁴（图2). Alz‐50免疫阳性神经元被解释为“识别缠结形成的前体”（即预角蛋白），因为它们缺乏硫黄素-S共染色³⁷（图4). Alz‐50也识别成熟缠结，但不标记幽灵缠结（图4). 因此，Alz‐50被认为是NFT成熟度的早期标志。1997年，Jicha等人。产生小鼠单克隆抗体MC‐1（图1)创造一种具有与Alz‐50类似表位的抗体，该抗体不会与Alz­50阳性蛋白FAC1反应。⁸⁴MC‐1的表位是氨基酸7–9和312–322⁸⁴（图2). 与Alz-50类似，MC-1主要识别预角和成熟缠结（图4). Alz‐50和MC‐1之前由Peter Davies博士制作。

1988年，Wischik等人。报告了小鼠单克隆抗体423（mAb 423，MN423）（表2，图1)，用于识别PHF核心。⁸⁵该抗体识别PHF核心谷氨酸（E）391截短的tau的387-391氨基酸。^86,87MN423主要识别幽灵缠结和成熟缠结。^88,89,90MN423甚至可以识别海马体中高级形式的幽灵缠结，它们显示出球形的终末期形态（图4). MN423对AD的科学理解具有重要意义，因为它确定了PHF核心中的截断τ。这种抗体最初由Michal Novak博士产生。

硫氮红（表1)是一种与β褶皱板结合的荧光染色剂⁹¹1988年首次用于识别斑块和缠结⁹²（图1). 噻嗪红显示成熟缠结和幽灵缠结，⁹³但不能预折，因为它们不含纤维（图4). 此外，幽灵缠结比成熟缠结的污渍更少。⁹³当在418 nm激发时，噻嗪红在波长>520 nm处可见。⁹³与硫黄素-S不同，噻嗪红可用于对冷冻解冻的AD脑组织进行染色。⁹²

PHF‐1是1989年开发的小鼠单克隆抗体⁹⁴（表2，图1)以努力识别PHF蛋白。这是一种常用的抗体，可识别丝氨酸（S）396和S404处磷酸化的tau⁹⁵（图2)主要是成熟缠结的免疫染色，预角蛋白和幽灵缠结的染色减少（图4). PHF‐1之前由Peter Davies博士制作；然而，Abcam的pS396抗体（目录号ab109390）可能是一种可接受的商业替代品，因为它与PHF‐1共享磷酸化的S396表位（表2，图2). 与PHF‐1一样，该抗体主要染色成熟缠结和幽灵缠结（图4).

1992年，Mercken等人。产生小鼠单克隆抗体AT8⁹⁶（表2，图1)，识别S202处磷酸化的tau^97,98和苏氨酸（T）205⁹⁹（图2). AT8是AD领域的一种重要抗体，因为它对包括免疫印迹、，^97,98免疫组织化学，⁹⁸和免疫EM。⁹⁸AT8通常免疫染色预角蛋白和成熟缠结蛋白^{42,43,44,46,72,100,101,102,103,104}（图4). 重影缠结不容易被AT8识别；然而，神经炎病理可以以缠结相关神经炎簇（TANC；⁴²图三). 相比之下，以前有报道称AT8免疫染色主要发生在成熟缠结和幽灵缠结中。^40,63AT8是一种商用抗体（Thermo Fisher Scientific，目录号MN1020），与之前由Peter Davies博士（CP13）生产的类似非商用小鼠单克隆抗体。1999年，Jicha等人首次报告了CP13。¹⁰⁵（表2，图1). 这种广泛使用的抗体识别S202处磷酸化的tau（图2)主要是染色三角和成熟缠结（图4).

TG-3是Vincent等人于1996年首次报道的一种抗体。¹⁰⁶（图1). 该抗体识别T231处磷酸化位点的区域构象变化¹⁰⁷（表2). Luna‐Muñoz等人的研究。对TG‐3免疫染色进行了表征，并发现该抗体可识别纤维性和非纤维性τ，如噻嗪红共染色所示。¹⁰⁸这种抗体识别预角蛋白和成熟缠结，但关于幽灵缠结的偏好报道不一。^40,108TG‐3之前由Peter Davies博士制作。

Tau‐66是Ghoshal等人于2001年报道的一种小鼠单克隆抗体。为了研究在τ中观察到的其他构象变化¹⁰⁹（表2，图1). 该抗体识别tau的构象变化，其中富含脯氨酸的区域与微管结合域重复序列3（氨基酸的不连续表位155-244、305-314）相互作用¹⁰⁹（图2). 初步鉴定后，Tau‐66对颞上回和海马的成熟缠结进行了免疫染色。¹⁰⁹Tau‐66抗体在Tau病理的顺序构象状态假说的发展中发挥了至关重要的作用⁹⁰（有关更多讨论，请参阅第4.1节）。该抗体最初由西北大学的Lester Binder博士生产，由密歇根州立大学的Nicholas Kanaan博士提供。

De Silva等人。开发的小鼠单克隆抗体RD3（Millipore Sigma，目录#05-803）和RD4（Millipore Sigma#05-804；表2)2002年（图1)，分别识别3R和4Rτ。¹⁰⁴RD3的假定表位包含连续氨基酸267–274和306–316，RD4表位包含氨基酸275–291¹¹⁰（图2). Pretangs主要用RD4免疫染色，成熟缠结用RD3和RD4免疫着色，幽灵缠结主要用RD3免疫染色。^{44,63,71,72,103,111}为了简化双重免疫染色程序，2013年产生了兔多克隆4R‐tau抗体¹¹²（Cosmo Bio，目录#CAC‐TIP‐4RT‐P01）。兔多克隆4R‐tau抗体与RD4具有相同的表位¹¹²（表2，图1和4)，并通过消除宿主物种冗余，实现了与RD3的比较。¹⁰³总的来说，RD3和RD4抗体是第一批针对3R和4R亚型的高度特异性抗体，使研究人员能够研究AD中的亚型变化。

小鼠单克隆抗体TauC3于2003年开发¹¹³（图1)最初由西北大学的莱斯特·宾德博士制作。该抗体标记在天冬氨酸（D）421处截短的τ，识别412-421个氨基酸¹¹³（表2，图​图2）。2). 这种抗体免疫染色既有成熟缠结也有幽灵缠结⁹²（图4)提供证据表明，NFT中含有在解理位置截短的τ。

Gibbons等人。报告小鼠单克隆抗体GT‐38（表2)2018年（图1)以确定AD特异性τ神经病理学。¹¹⁴确切的表位未知，但被认为可以识别τ的构象物种。这种抗体免疫染色既有成熟缠结也有早期幽灵缠结（图4). GT‐38在皮质基底部变性和进行性核上性麻痹的背景下不认识τ病理学。¹¹⁴相反，该抗体被证明对3R/4R混合τ蛋白病（如AD）的NFT病理学具有特异性，而不是仅对3R或4R原发性τ蛋白疾病（如皮克氏病和进行性核上性麻痹）具有特异性。¹¹⁴GT‐38现在可通过Abcam（目录号ab246808）获得。

5.2. 超微结构变化

1963年，成熟缠结的超微结构研究表明PHF积聚（图1)由双螺旋结构组成。^136,137X射线衍射研究表明，PHF符合β折叠片结构，¹³⁸它是由氨基酸链组成的蛋白质的二级结构，氨基酸链通过氢键结合形成片状结构（有关综述，请参见Taylor等人。¹³⁹). PHF的主要成分是τ^{140,141,142,143,144,145,146}含有由泛素组成的次要成分。^48,49tau和泛素的免疫染色模拟了银染切片上嗜银NFT的观察结果。EM也在成熟NFT中发现了直丝。然而，直丝不像AD大脑中的PHF那样丰富。¹⁴⁷Fitzpatrick等人。发现PHF芯和直丝芯由相同的原丝组成；然而，PHF和直丝芯在原丝的包装方式上有所不同。¹⁴⁸随着低温电磁研究继续推进我们对τ生物学的理解，研究原生质丝包装如何从预角缠结发展到成熟缠结并发展到幽灵缠结将非常有意义。通过仔细观察NFT成熟度中丝状变化的结构可视化，我们可能能够更好地了解什么样的抗原-抗体界面被揭开，足以用于治疗靶向。

5.3。Tau亚型

AD被认为是3R/4Rτ蛋白病，这意味着NFT由两种亚型组成，没有一种亚型占优势。这与原发性τ蛋白病形成对比，原发性牛磺酸蛋白病分为3R显性（如皮克氏病）或4R显性（例如进行性核上性麻痹、皮质基底变性）。^27,28尽管AD被归类为3R/4Rτ蛋白病，但有证据表明τ亚型表达通过NFT成熟水平发生了变化。根据NFT的成熟度，使用免疫组织化学在海马中绘制了3R和4R tau病理图^63,72,149和免疫荧光。^44,71前角蛋白主要含有4Rτ，成熟缠结既含有3Rτ又含有4R tau，幽灵缠结主要含有3R tau。^{44,63,71,72,150}尽管τ亚型在预角和重影缠结中占主导地位，但3R和4Rτ也可以在NFT寿命的另一端表达。神经元本身的tau亚型表达也存在异质性，3R tau在树突中表达，3R/4R tau则在成熟缠结神经元的胞体中表达。¹¹¹据报道，AD患者脑干中3Rτ通过疾病进展而增加。¹⁰³从4R到3Rτ的变化不是翻译后修饰，这表明NFT中亚型表达变化的可能机制可能是由于亚型的选择性剪接调控或代谢改变。相反，与对照组相比，在AD大脑的额叶皮层（一个在疾病过程中稍后积累NFT的区域）中观察到tau蛋白亚型表达没有变化。^33,103有趣的是，一些报告显示，与对照组相比，AD大脑中4R:3R tau mRNA的比率增加，^151,152,153这可能表明由于神经元中3R tau蛋白比例增加，产生4R tau mRNA的过度补偿。

目前没有地图确定导致AD的突变；然而，一些突变被确定为额颞叶痴呆的病因（综述见Ghetti等人。¹⁵⁴). 有趣的是，不同的突变赋予3R或4Rτ内含物优势。例如，V337M和R406W突变的额颞叶痴呆患者的τ病理学同时包含3R和4Rτ。³⁶具有这两种突变的患者有PHF和直丝，以及与AD中观察到的神经病理学类似的前角蛋白、成熟缠结、神经丝和神经炎斑块。^155,156相反，有许多突变主要导致3R或4R tau病理。P301L和N279K是导致额颞叶痴呆主要4Rτ病理学的两个突变示例。³⁶考虑突变对tau亚型表达的影响非常重要，特别是对于tau病建模或tau标记物的生物标记物评估。

这篇综述是为了纪念已故伟大的彼得·戴维斯博士。没有他的利他主义，这份手稿中引用的许多研究可能都不可能实现。研究人员得到了阿尔茨海默病协会（AARG‐17‐533458）的资助；国家老龄研究所（R01 AG054449，U01 AG57195，P30 AG062677）；佛罗里达州卫生部，以及Ed和Ethel Moore阿尔茨海默病研究计划（8AZ06，20a22）；还有大卫和弗朗西斯·斯特朗送的礼物。我们感谢弗吉尼亚·菲利普斯（Virginia Phillips）、亚里士多·利布雷罗（Ariston Librero）、乔·兰迪诺（Jo Landino）和莫妮卡·卡斯坦德斯·凯西（Monica Castanedes‐Casey）在体形发育过程中提供的组织学支持。我们要感谢Francisco García‐Sierra博士（Cinvestav）分享噻嗪红图像；Benjamin Wolozin博士（波士顿大学）分享Alz‐50抗体；Peter Davies博士（Northwell Health’s Feinstein Institutes for Medical Research）分享CP13和PHF‐1抗体；和Nicholas Kannan博士（密歇根州立大学）分享tau抗体（TauC3最初来自西北大学的Lester Binder博士，MN423最初来自Michal Novak博士）。