所有需氧生物的DNA都会受到活性氧物种（ROS）的损伤，而DNA的氧化损伤在诱变、致癌和衰老中起着重要作用(1). 然而，DNA修复阻止了生物效应，而碱基切除修复（BER）途径似乎是去除DNA氧化损伤的最重要机制(37). BER的第一步是通过DNA糖基化酶活性识别和去除改变的碱基，在DNA中留下一个碱基位点（AP位点）。AP位点被与DNA糖基化酶本身相关联的AP-lyase活性或独立的AP-endonuclease活性切割。修复是通过磷酸二酯酶、DNA聚合酶和DNA连接酶的顺序作用完成的。其他辅助蛋白质因子，如XRCC1(11,27)对于BER路径中不同步骤的协调也很重要。
已经鉴定出几种去除氧化碱基残基的DNA糖苷酶。这些可以分为两个功能子组，例如大肠杆菌Fpg（甲脒嘧啶DNA糖基化酶）修复氧化嘌呤和大肠杆菌Nth（内切酶III），用于氧化嘧啶的修复(13,26). Fpg催化从双链DNA中切除7,8-二氢-8-氧鸟嘌呤（8-oxoG）和咪唑环片段甲酰胺基嘧啶（faPy）残基，并具有强相关的β，δ-消除AP-lyase活性(8,39). 鸟嘌呤衍生物8-oxoG具有误编码和诱变特性(24,25)，而faPy残基代表DNA复制的阻断，并且大多具有细胞毒性(7). 这个大肠杆菌fpg(万兆)突变体具有自发突变表型(32).
没有与之对应的真核序列英尺/加仑已被鉴定，而第N个糖基化酶家族在整个系统发育过程中都存在(2,17). Nth特别去除胸腺嘧啶和胞嘧啶的辐解产物，包括环饱和、碎片化或收缩的损伤(14). 需要清除的一个重要损伤是胸腺嘧啶乙二醇（Tg），它在体外强烈抑制DNA复制，在体内表现为细胞毒性损伤(23,35). 胞嘧啶修饰5-羟基胞嘧啶（5-OHC）已被证明在大肠杆菌(18). 与Fpg一样，Nth具有较强的相关AP-lyase活性，但仅产生β消除。另一种DNA糖基化酶在大肠杆菌是Nei（内切酶VIII），其底物特异性类似于Nth(31).
编码原核Nth同源物的基因已在几个真核生物物种中鉴定出来，包括酿酒酵母(17),葡萄裂殖酵母(34),秀丽隐杆线虫(41)、和人类(2,21). 第N个基因家族的多重比对揭示了两个高度保守的结构域：一个螺旋-发夹-螺旋（HhH）基序，参与拟议的催化机制，另一个[4Fe-4S]簇被认为对DNA结合很重要(28). [4Fe-4S]簇存在于酶家族的所有成员中，除了酿酒酵母Ntg1号机组(三,17). 这个NTG1公司该基因最初是通过HhH基序的存在来鉴定的。中的表达式分析大肠杆菌揭示了Ntg1在去除Tg和在AP位点产生链断裂方面的行为与其原核对应物相似(三,17). 然而，与已报道的第N个相比酿酒酵母研究发现，Ntg1能高效释放faPy残基，因此具有Fpg酶的一些特性大肠杆菌(17).
这个NTG1公司基因（EMBL登录号。L05146号)包含在酵母基因组序列完成前分析的染色体I的较大序列片段中(4). 完成酿酒酵母基因组序列显示第二个第N个同源物Ntg2位于第XV号染色体上（EMBL登录号：。Z74785号). Ntg2包含第N家族其他成员的[4Fe-4S]簇特征（图。显示了对相关序列特征的对齐和引用）。在这项研究中，我们将这两种酶纯化到接近物理同质性的水平，并发现了底物特异性的差异，尽管两种酶都作用于DNA中的Tg和faPy残基。此外，我们发现每一个缺失Ntg1和Ntg2的突变体都比野生型细胞具有更高的自发和过氧化物诱导突变频率。双突变体的突变频率甚至更高，表明NTG1公司和NTG2系列在酵母修复中。
对齐酿酒酵母Ntg1和Ntg2蛋白。突出显示的氨基酸代表相同的残基。如分别参考Ntg1和Ntg2所示，不同的结构特征在线形的上方和下方加下划线。NLS，核定位信号；线粒体定位信号。
材料和方法
酵母和细菌菌株。
大肠杆菌使用的菌株为BH20(英尺/加仑) (6)和BK3004(fpg:：kan)由T4转导fpg:：kan从BH20进入BL21。野生型酵母FF18733(材料一他的7-3 leu2-1112 lys1-1 trp1-289 ura3-52)是从Serge Boiteux那里获得的NTG1公司和NTG2系列通过对FF18733中野生型等位基因的靶向基因破坏，获得突变体。这个URA3公司基因标记被插入Bgl公司II限制位置NTG1公司在pUC19中克隆，并且LEU2级标记已插入生态RI限制位置NTG2系列在pVL1393（PharMinen）中。这个NTG1公司和NTG2系列去除带有标记的基因，用BAL 31部分降解，并用醋酸锂法转化FF18733(22). 这个ntg1 ntg2通过转化ntg1型带有ntg2:：LEU2插入。结果转化子RH101的基因型(ntg1:：URA3)，RH102型(ntg2:：LEU2)和RH103(ntg1:：URA3 ntg2:：LEU2)，经Southern印迹分析证实。
试剂酶。
大肠杆菌从含有Richard Cunningham获得的Nth表达质粒的细胞中纯化Nth。内切酶IV（Nfo）由His纯化6tag-Ni亲和纯化系统（Qiagen有限公司）。大肠杆菌Fpg由S.Boiteux善意提供。尿嘧啶DNA糖苷酶购自Boehringer Mannheim，限制性内切酶、T4 DNA连接酶、T4 DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶均购自New England Biolabs。
Ntg1和Ntg2的表达和纯化。
这个NTG1公司将编码区（1200bp）克隆到pUC19中(17)生成pUC-NTG1.大肠杆菌BH20由pUC转化-NTG1公司并在37°C的10升LB培养基中培养至0.8的光密度。异丙基-β-d日-添加硫代吡喃半乳糖苷（IPTG；1 mM），并继续孵育2 h。如前所述，通过结合胞浆溶解和溶菌酶处理制备细胞提取物(36). faPy活性的测定用于监测Ntg1的纯化。将细胞提取物应用于Affi-Gel Blue（Bio-Rad）柱（2×8 cm），与缓冲液A（0.1 M Tris[pH8.0]，1 mM EDTA，20%甘油，10 mMβ-巯基乙醇）平衡。洗涤后，通过两步盐梯度（缓冲液a中的1和2 M KCl）洗脱活性组分。将具有faPy活性的组分合并，在缓冲液B（50 mM吗啉乙醇磺酸[pH6.0]，1 mM EDTA，20%甘油，10 mMβ-巯基乙醇）下透析，并应用于MonoS柱（HR 5/5；Pharmacia）。用0到1.0 M NaCl线性梯度洗脱色谱柱，将0.3到0.4 M NaCl-之间洗脱的峰馏分合并并在缓冲液a中透析。将脱盐馏分应用于小牛胸腺DNA纤维素色谱柱（HR 5/5；Pharmacia），并在缓冲溶液a中用0到2.0 M KCl线性梯度洗提。收集0.25到0.4 M KCl之间洗脱的活性组分，在Sephadex G-25M（PD-10色谱柱；Pharmacia）上脱盐，与缓冲液A平衡，并应用于MonoQ色谱柱（HR 5/5；Pharmachia）。柱用0到1.0 M NaCl线性梯度洗脱，纯化Ntg1用0.2 M NaCl.洗脱。
这个NTG2系列基因编码区（1143bp）用PCR扩增Pfu公司聚合酶和引物5′-cgggatcATGAGAGGAAGTAGGTCTAGG（小写字母的连接序列）和5′-actgcagCCACAATGAATGGTGGTCTAT。这个NTG2系列碎片被插入巴姆HI和Pst（磅/平方英尺）pT7-SCII（Stratagene）的I限制性位点。这个Nde公司我-巴姆将HI片段从聚合酶链中移除，以缩短核糖体结合位点和翻译起始点之间的距离NTG2系列，产生pT7-NTG2.大肠杆菌BK3004被pT7转化-NTG2系列并在10升K培养基（补充有1%葡萄糖、1%酪氨酸和0.0001%硫胺素的M9缓冲液）中培养至0.8的光密度。添加IPTG（0.1 mM），继续孵育2 h，并按照Ntg1制备提取物。Ntg2通过与Ntg1类似的方案进行纯化。将提取物应用于Affi-Gel Blue色谱柱，该色谱柱在缓冲液A中与0.1 M KCl平衡，并在缓冲液B中以1和2 M KCl的梯度洗脱。将活性组分合并，与含有0.1 M KCl的缓冲液A进行透析，并应用于MonoQ色谱柱。Ntg2在流动中收集并应用于DNA-纤维素柱。除使用NaCl梯度外，色谱与Ntg1相同。将0.2和0.4 M NaCl之间洗脱的活性组分混合，用缓冲液B透析，并应用于MonoS柱。将在0.4 M NaCl下洗脱的峰馏分应用于与缓冲液B平衡的Sephadex-75凝胶过滤柱（HR 5/5；Pharmacia）中。在缓冲液B中用50 mM的NaCl洗脱柱。
faPy DNA糖苷酶活性测定。
在含有70 mM吗啉丙基磺酸（pH 7.5）、1 mM二硫苏糖醇、1 mM-EDTA和5%甘油的反应缓冲液中，37°C下30分钟，测定所有酶的活性。N个-[三H] 甲基-N个如别处所述，使用′-亚硝基脲（18 Ci/mmol）制备含有faPy残基（5000 dpm/μg DNA）的聚（dG-dC）DNA(8). 如前所述，在含有0.4μg FaPy-DNA底物的50μl总体积中测量含FaPy-DNA（FaPy-DNA）糖苷酶活性(17).
含Tg-和5-OHC-的DNA的裂解分析。
含Tg DNA（Tg-DNA）是通过将三个寡核苷酸I（5′-TTGACATTGCCT）、II（5′-CGCGA[Tg]ACGCC）和III（5′-TAGACGAATTCCG）与互补的37聚体寡核苷酸杂交而构建的。寡核苷酸II在位置6处含有Tg（由康涅狄格州米德尔敦卫斯理大学化学系Philip Bolton善意提供）。寡核苷酸I的5′末端标记有[γ-32P] ATP（5000 Ci/mmol；Amersham）和T4多核苷酸激酶，然后在16°C下通过T4 DNA连接酶（8 U）连接3 h。添加Nfo（2.5 ng），以在通过15%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）（Long Ranger凝胶；FMC BioProducts）纯化之前去除底物中的AP位点。通过电洗脱提取全长含Tg的单链，并将其重新混合到37米互补寡核苷酸。通过退火5′制备含有单个5-OHC残基的双链DNA32P-end标记的12-mer（5′-GCTCATGCGCAG-3）与26米互补寡核苷酸（5′-GACCTCTTTCCGCTGCGCGAGC-3′）结合，并通过T4 DNA聚合酶（0.02U）与50μM 5-d[OH]CTP（由西雅图华盛顿大学病理学系劳伦斯·勒布善意提供）延伸引物，50μM dGTP，和50μM dATP在37°C下保持30分钟，形成完整的双链分子。用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化双链DNA并用电洗脱法分离。每个反应混合物含有10 fmol的底物和酶，总体积为10μl。在37°C下培养30分钟后，反应产物在20%变性聚丙烯酰胺凝胶（Long Ranger；FMC BioProducts）上用1×三硼酸盐-EDTA分离。用荧光成像仪（分子动力学模型445 SI）对放射性标记片段进行可视化。
8-氧代G-和次黄嘌呤DNA的裂解分析。
如前所述，双链DNA在与a、G、C或T相对的位置10（5′-ATCACCGGC[8-oxoG]CCACACAGCGTG-3′）含有一个8-oxoG残基(5). 通过标记、退火并将含有次黄嘌呤的25聚寡核苷酸（5′-GCTCATGCGCAG[次黄嘌嘧啶]CAGCCGACTCG-3′）延伸到互补的18聚寡核苷酸中（5′-CGAGTACTGTCGCG-3′。对于这两种底物，5′端被T4多核苷酸激酶和[γ]标记-32P] ATP（3000 Ci/mmol；Amersham）。反应混合物包含10 fmol的底物和酶，总体积为5至10μl，条件如Tg-DNA裂解分析所述。
紫外线照射下糖化酶活性的测定[三H] C-DNA。
要生成[三H] 胞嘧啶-DNA([三H] C-DNA）底物，通过PCR从第n个服务提供商基因输入葡萄裂殖酵母使用上游引物5′-ATATCACATGAAATGAACC-3′和下游引物5’-CCCAAGCTTAAAGAGAGTGTAA-3′。反应体积为100μl，30μl[5-三H] dCTP（30 Ci/mmol；Amersham）和0.2μM浓度的dATP、dTTP和dGTP以1×塔克缓冲液（20 mM Tris-HCl[pH9.2]，60 mM KCl，2 mM MgCl2). 在93°C下扩增30个周期，持续1分钟，52°C下放大1分钟，72°C下扩大30秒塔克聚合酶。PCR产物通过10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳从任何污染DNA中分离出来，并通过电洗脱提取。DNA以10000 J/m的紫外线照射（254 nm）2每个样品含有0.02μg紫外线照射[三H] 总体积为50μl的C-DNA（750000 dpm/mg），检测条件与faPy-DNA相同。
紫外线照射DNA酶切的序列分析。
扩增相同的285-bp PCR片段，用于紫外线照射DNA裂解的序列分析。上游引物末端标记有[γ-33P] 扩增前ATP（2500 Ci/mmol；Amersham），而下游引物未标记。PCR与[三H] 除未标记的dCTP和Vent聚合酶外，均使用C-DNA。通过PAGE纯化后，将DNA暴露于10000J/m的UV（254nm）下2序列分析分析包含50 ng DNA（625000 dpm/μg）和20 ng酶，总体积为8μl。在7M尿素-8%聚丙烯酰胺凝胶上分析裂解产物，并进行Sanger双脱氧测序反应（Thermo Sequenase放射性标记终止环测序；Amersham）。
NaCNBH公司三-介导酶在AP-DNA上的捕获。
如别处所述，在a、G、C或T（AP-DNA）对面的位置13（5′-GCTCATGCGCAG[AP位点]CAGCCGACTCG-3′）处制备含有单个AP位点的双链DNA(17).32P-5′-末端标记的AP-DNA（80 fmol）与酶一起培养，如40 mM氰基乙二氢钠（NaCNBH）的存在所示三)、20 mM HEPES（pH 7.5）、50 mM KCl和5 mM EDTA，总体积为12.5μl。在室温下培养2 h后，添加3μl 5×十二烷基硫酸钠（SDS）-PAGE加载缓冲液。将样品煮沸5分钟，在10%Tricine SDS凝胶上分离，并通过荧光成像进行分析。
DNA结合分析。
Ntg1和Ntg2的DNA结合通过电泳迁移率变化分析测定，使用32含有Tg或四氢呋喃（THF）残基的P-5′末端标记双链DNA底物（5-GCTGTTGAGATCAGTTCGTGG[THF]AGTAACCCACTCGTGC-3；由德国多特蒙德摩尔库拉生理学研究所Elmar Weinhold善意提供）。如图所示，DNA（10至80 fmol）和酶在总体积为10μl的冰上培养15分钟。样品在4°C下通过10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。除了添加0.1到10 pmol的无损伤双链寡核苷酸外，竞争实验的条件如上所述。
NTG1公司和NTG2系列发起人-lacZ公司融合分析。
一个270-bp的片段NTG1公司利用引物5′-ttttgtaccTTTAACAATTAGGTT-3′和5′-ttggaccATAGAGTTAGTG-3′扩增启动子区（包括起始密码子和下游序列的30 bp），并用PCR方法扩增出启动子区160 bpNTG2系列启动子区（包括起始密码子和下游序列的18bp）由引物5′-tttggtaccTCAGCTGGAAGCATT-3′和5′-ttggatccTACTTCCTCTCATTAT-3′扩增（小写字母表示含有限制性位点的连接子区）。扩增的启动子片段在千磅我和巴姆着丝粒酵母的HI限制位点-大肠杆菌穿梭质粒pHQ107（由加尔维斯顿德克萨斯大学医学分院路易斯·普拉卡什提供）位于lacZ公司的基因大肠杆菌在含有NTG1公司-或NTG2-lacZ公司将融合物暴露于甲基甲磺酸甲酯（MMS；0.05%）或甲萘醌（0.3 mM）中2.5 h。将等分样品（1.5 ml）制成丸，并在250μl的1 M山梨醇–0.1%Triton–100 U的溶菌酶中在30°C下培养15 min。β-半乳糖苷酶与氯酚红β在Z缓冲液（0.75 ml）中进行反应-d日-吡喃半乳糖苷（0.8 mg；Boehringer-Mannheim），通过在574 nm处测量吸光度来监测其活性。将反应混合物在25°C下培养60分钟，并通过添加0.4 ml 1 M Na停止反应2一氧化碳三。根据提取物中蛋白质浓度的变化对值进行校正。
Northern印迹分析。
如前所述进行RNA提取和Northern印迹分析(17). 简言之，从在YPD培养基中呈指数增长的FF18733细胞中分离出总RNA，并暴露于H2O（运行）2（1mM）、甲萘醌（5mM）、MMS（0.05%）或4-硝基喹啉-N个-氧化物（NQO；2μg/ml）在30°C下保持30分钟。RNA（10μg）在甲醛–1%琼脂糖凝胶中通过电泳分离，吸附在尼龙膜上，并用合适的探针进行探测32P标记的DNA探针。通过荧光成像对杂交进行定量。
酵母存活。
酵母细胞在YPD中生长到2×106细胞/ml，并暴露于DNA损伤剂（MMS、NQO、H2O（运行）2甲萘醌、254 nm处的UVC和360 nm处的UV A）。在不同的剂量间隔下，对细胞进行稀释和电镀，以进行存活率测量。
突变。
指数生长细胞（2×106用0.5、1、2和3 mM H处理YPD中的细胞/ml）2O（运行）2在30°C下保持30分钟。细胞被稀释并铺在YPD板上以测量存活率。通过离心收集后，将细胞置于缺乏精氨酸的合成培养基上（不含氨基酸的Difco YNB，每毫升补充150μg亮氨酸、腺嘌呤、尿嘧啶、色氨酸和组氨酸以及2%葡萄糖），每毫升含有100μg卡纳凡尼，并在30°C下培养3天。突变频率计算为每10个卡纳凡尼耐药菌落的数量7存活细胞。
NTG1和NTG2与GFP融合的细胞内定位。
对于绿色荧光蛋白（GFP）与Ntg1和Ntg2（分别为Ntg1-GFPn和Ntg2-GFPn）的N端融合NTG1公司和NTG2系列编码序列首先被引入酵母-大肠杆菌穿梭载体pCUP1-Lux载体（来自挪威奥斯陆奥斯陆大学Odd Stokke Gabrielsen）。pCUP1-Lux向量包含强CUP1大学基因启动子对添加CuSO的反应4通过其顺式-作用金属响应元件(30). 利用上游引物5′-aactgcagATGGTGAGAGAGAGGCGAGAG-3′，从pEGFP-N1载体（Clontech）中扩增出GFP序列(Pst（磅/平方英尺）一） 和下游引物5′-cgggatcgcCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3′(巴姆HI）（不包括GFP终止密码子，包括帧内融合到Ntg1的连接子）或5′-cggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3′(巴姆HI）（不包括GFP终止密码子，包括与Ntg2帧内融合的连接子）。对于C端融合（Ntg1-GFPc和Ntg2-GFPc）NTG1公司和NTG2系列使用下游引物5′-aactgcagGTCCTCTACTATACAGAAATATC-3′通过PCR去除(Pst（磅/平方英尺）一） 和5′-actgcagTTTTCTTGTGTCTTTCTGTTG-3′(Pst（磅/平方英尺）一） 和上游引物5-aactgcagATGCAAAAGATCAGTAAATA-3′(Pst（磅/平方英尺）一） 的NTG1公司和5-cggatccATGAGAGGAAGAGTAGGTCTAGG-3′(巴姆HI）用于NTG2系列在已经插入pCUP1-Lux载体的GFP前面克隆PCR产物（通过如上所述的GFP上游引物和包括终止密码子的下游引物扩增[5′-aactgcagATGCAAAAGATCAGTAAATA-3′]；Pst（磅/平方英尺）一） ●●●●。所有结构均通过DNA测序进行检查和验证。酵母FF18733通过醋酸锂法转化(22)通过各种融合构建物，一个仅含有GFP的构建物作为对照。100μM CuSO诱导指数生长细胞表达融合构建4在30°C下保持2 h。细胞在室温下固定在4%多聚甲醛中30 min，并在山梨醇缓冲液（1.2 M山梨醇，0.1 M KH）中用溶解酶渗透2人事军官4[pH 6.5]）在30°C下孵育30分钟。在室温下于磷酸盐缓冲盐水中的0.05%Triton X-100中孵育5分钟后，用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行染色。GFP和/或DAPI荧光在配备徕卡MPS 60相机的徕卡DMIRB/E显微镜中显示。异硫氰酸荧光素的发射滤波器为S13832，DAPI为S13824。
核苷酸序列登录号。
Ntg1和Ntg2序列的EMBL登录号为L05146号和Z74785号分别是。
结果
酿酒酵母ntg1和ntg2型突变分析。
两个人的存在大肠杆菌酵母中的第N个同源物Ntg1和Ntg2提出了一个问题，即这两种功能是否对保护DNA免受氧化损伤至关重要，或者这些基因是否起到相互备份的作用。ntg1型和ntg2型单个突变体，以及ntg1 ntg2通过靶向基因断裂构建双突变体，分析糖基化酶基因的体内功能。与野生型细胞相比，这两个单突变体的自发突变频率显著增加（40到60倍），而双突变体的突变频率则进一步增加（图。). 因此，Ntg1和Ntg2对于修复自发DNA损伤都是必不可少的。接触H后2O（运行）2，双突变体和单突变体的突变频率增加了10到15倍，支持NTG1公司和NTG2系列防止氧化应激引起的突变。然而，无论是单个突变体还是双突变体都没有对H过敏2O（运行）2或其他DNA损伤剂（紫外线、MMS、NQO或甲萘醌[数据未显示]），与我们之前报告的ntg1型野生型菌株FL200的突变体(17). 我们已经重新调查并确认了原药的过敏性ntg1型甲萘二酮和H的突变体2O（运行）2; 这种明显的差异必须归因于两个菌株的不同遗传背景。
自发和H2O（运行）2-诱导突变频率酿酒酵母缺乏Ntg1和/或Ntg2的突变体。卡那凡尼耐药突变频率酿酒酵母FF18733（野生型；），RH101(ntg1:：URA3; □), 右侧102(ntg2:：LEU2; ▵), 和RH103(ntg1:：URA3,ntg2:：LEU2; ○) 在未经处理的细胞和暴露于H的细胞中测量2O（运行）2按照指示的剂量。为野生型细胞绘制的自发性突变水平是突变频率的较高估计值，因为当108将细胞接种在canavanine平板上。
Ntg1和Ntg2的纯化。
的单独角色NTG1公司和NTG2系列突变研究表明，可能与生化特性的差异有关，例如底物特异性。对于生化分析NTG1公司和NTG2系列功能表示为大肠杆菌，并根据酶从DNA中释放faPy残基的能力对其进行纯化。最初通过全提取分析观察到Ntg2，与之前观察到的Ntg1相似，但不同于大肠杆菌Nth在去除DNA中faPy残基方面很活跃。这个英尺/加仑选择突变背景以避免任何干扰大肠杆菌纯化过程中甲脒嘧啶DNA糖苷酶活性。纯化组分的SDS-PAGE显示，这两种酶在凝胶上恢复为两条紧密连接的条带，Ntg1和Ntg2的分子量分别为45.5和42 kDa，与预测的45.6和43.8 kDa的计算分子量非常一致（图。). 我们不知道双带出现的原因，但在整个纯化过程中观察到这种迁移模式，似乎与酶的表达和/或构象或电泳分离有关。
纯化Ntg1和Ntg2过程中获得的不同蛋白质组分的SDS-PAGE。（A） 编号1。样品包括分子量标准品（第1和第7道）、MonoQ分数（第2道）、DNA-纤维素分数（第3道）、MonoS分数（第4道）、Affi-Gel Blue（AGB）分数（第5道）和细胞提取物（第6道）。（B） 编号2。样品包括分子量标准品（第1和第8道）、Superdex-75馏分（第2道）、MonoS馏分（第一道）、DNA-纤维素馏分（四道）、MonoQ馏分（五道）、Affi-Gel Blue馏分（六道）和细胞提取物（第七道）。
Ntg1和Ntg2切除faPy而非8-oxoG。
Ntg2在faPy残基切除方面的活性与Ntg1相似，但效率比Ntg1低四倍大肠杆菌Fpg（图。). 然而，在酶过量的情况下，Ntg1和Ntg2对faPy的切除达到了Fpg获得的水平，这表明Ntg1、Ntg2和Fpg对faPy的去除没有定性差异（数据未显示）。我们还检测了纯化Ntg1和Ntg2对DNA中次黄嘌呤和8-oxoG的潜在活性。然而，对于含有相反链中所有正常碱基组合的DNA底物，未观察到8-oxoG或次黄嘌呤的切除（数据未显示）。这一发现与我们之前通过Ntg1在大肠杆菌但显然与Bruner等人最近的报告不一致(9)Ntg1/Ogg2具有去除8-oxoG的活性，尤其是互补链中的相反A或G。我们没有发现与我们的酶制剂相关的这种活性，即使在测定中使用了多达2μg的Ntg1或Ntg2（数据未显示）。相比之下，1 ng酶足以显著裂解含有Tg的寡核苷酸（见下文）。这种明显的差异可能归因于所用寡核苷酸序列上下文的差异。
通过Ntg1和Ntg2释放faPy残留物。faPy切除术[三H] 在37°C下酶孵育30分钟后，随着纯化Ntg1（□）、Ntg2（φ）、Fpg（）和Nth（○）数量的增加，测量faPy-poly（dG-dC）DNA（0.4μg）。
去除紫外线引起的DNA损伤。
除了环丁基嘧啶二聚体和嘧啶（6-4）嘧啶加合物外，DNA的紫外线照射（254 nm）产生faPy残基和单嘧啶光产物，它们主要是饱和于C-5–C-6双键的胞嘧啶衍生物(10,16). 采用两种方法研究了Ntg1和Ntg2对紫外线照射DNA的活性。在一组实验中，33P-end标记的DNA经过紫外线照射，并与饱和浓度的Ntg1和Ntg2孵育，在DNA测序凝胶上分析酶诱导的链断裂的形成（图。A） ●●●●。每个带位的DNA定量表明，Ntg1比Ntg2更有效地去除所有序列位置的胞嘧啶水合物，而嘌呤光产物似乎是Ntg2的更好底物。单独紫外线照射或与AP-核酸酶孵育均未产生明显的链断裂(大肠杆菌Nfo[未显示]）。在另一种方法中，紫外线（254-nm）照射的DNA含有三用H标记的胞嘧啶作为糖苷酶分析的底物，监测放射性标记碱基残基的释放（图。B） ●●●●。Ntg1和大肠杆菌Nth释放出等量的胞嘧啶光产物，而Ntg2在饱和酶浓度条件下只能去除约50%的C损伤。这些结果表明，与Ntg2相比，Ntg1对紫外线诱导的胞嘧啶光产物具有更广泛的底物范围特异性，并且与大肠杆菌在这方面没有。可能Ntg2只能检测DNA中形成的两种不同的胞嘧啶水合物立体异构体中的一种，但也可能有其他解释。
Ntg1和Ntg2对紫外线照射DNA的活性。（A） A的酶裂解33P末端标记的紫外线照射DNA片段（250 fmol）与过量的Ntg1和Ntg2在37°C下孵育30分钟。切割产物在DNA测序凝胶上与DNA测序反应一起分离。如图所示，确定作用于每个带位置的碱基类型，并通过磷光成像（Ntg1[开条]和Ntg2[填充条]）量化带强度。（B） 紫外线照射下放射性标记胞嘧啶的释放[三H] 37°C孵育30分钟后，通过增加纯化Ntg1（□）、Ntg2（ω）和Nth（○）的量来获得C-DNA。
含有Tg和5-OHC的DNA的酶活性。
Tg和5-OHC是DNA中两种主要的嘧啶氧化产物。这些病变具有截然不同的生物学效应，因为Tg被认为主要具有细胞毒性(23)和5-OHC被认为具有错误编码属性(18). 在含有单个Tg或5-OHC残基的双链寡核苷酸上测试Ntg1和Ntg2的活性（图。). Ntg2以与大肠杆菌第N名。Ntg1也能有效地裂解含有Tg的寡核苷酸；然而，在所使用的酶浓度下，未检测到Ntg1对5-OHC的显著释放。因此，Ntg1和Ntg2在去除胞嘧啶损伤方面起着不同的作用：Ntg1在去除紫外线诱导的胞嘧啶水合物方面更有效，而Ntg2是有效去除氧化剂诱导的5-OHC所必需的。
含Tg和5-OHC的DNA的裂解。（A） 在37°C下，用1和5 ng的Nth（通道1和2）、Ntg1（通道3和4）、Ntg2（通道5和6）或Nfo（通道7和8）或无酶（通道9），在位置19（10 fmol）含有单个Tg的双37-mer寡核苷酸孵育30分钟。用20%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）从完整DNA中分离出断裂的DNA，并通过磷光成像进行可视化。（B） 将位于13位（10 fmol）含有5-OHC的双链26-mer在37°C下与5和20 ng的Nth、Ntg1、Ntg2或Nfo或无所示酶孵育30 min。用20%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和磷化成像分析裂解产物。nt，核苷酸。
共价DNA酶中间体的DNA结合分析和硼氢化物捕获。
如前所述，Ntg1和Ntg2具有AP裂解酶活性，可裂解含有碱基位点的双链DNA(15). 具有相关AP-lyase活性的DNA糖基化酶通过C′-1碳上的亲核攻击和随后的β消除释放受损碱基以裂解磷酸二酯链。NaCNBH可以捕获中间共价亚氨基酶-DNA复合物三并通过SDS-PAGE分析检测(15). 用AP-DNA进行的捕集实验表明，Ntg1和Ntg2的复合形成与基部相对位置无关（图。A） ●●●●。这与来自人类和酵母的8-oxoG DNA糖基化酶形成对比，后者明显倾向于作用于与C相对的碱性位点(5,19). 然而，Ntg1的捕获效率高于Ntg2，并且大肠杆菌Nth，表明Ntg1的酶DNA中间产物的寿命更长。在另一组实验中，含有Tg或THF的DNA的带移分析产生Ntg2的带移，而Ntg1没有检测到带移（图。B） ●●●●。对Ntg2结合的进一步分析表明，Ntg2具有100倍多余的未受损DNA的位移（数据未显示），从而证明Ntg2对受损DNA具有很强的特异性。因此，Ntg1和Ntg2用于底物识别和与DNA相互作用的反应机制似乎存在定量和定性差异。需要进一步的蛋白质-DNA相互作用动力学实验来更详细地阐明这些差异。
Ntg1和Ntg2的硼氢化物捕获和DNA结合分析。（A） 用NaCNBH探索共价酶-AP-DNA中间产物三减少。双面打印32P标记的寡脱氧核糖核苷酸（80 fmol）含有一个单独的AP位点，与a（车道1至4）、C（车道5至8）、G（车道9至12）和T（车道（13至16）相对，与40 ng Ntg1（车道1、5、9和13）、Ntg2（车道2、6、10和14）或Nth（车道3、7、11和15）或不含酶（车道4、8、12和16）孵育。用10%Tricine-SDS-PAGE从DNA中分离蛋白质-DNA复合物。（B） 将含有单个THF（10 fmol；1至3道）或Tg（50 fmol，4至6道）残基的双链DNA与5 ng Ntg1（2道和5道）、5 ng Ntg2（3道和6道）或无酶（1道和4道）在4°C下孵育15分钟，并用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
手机定位。
为了研究Ntg1和Ntg2的亚细胞定位和细胞内分选机制，通过基因构建物转化酵母细胞NTG1公司或NTG2系列在C或N端子端熔接至GFP。Ntg2-GFPc（图。)和Ntg2-GFPn（数据未显示）都在细胞核中产生非常强烈的GFP信号（黄色染色），并且只在细胞质中产生微弱、均匀的背景染色。相反，Ntg1-GFPc（图。)被发现在细胞核和代表线粒体的DAPI染色的细胞质体中积累。在另一个实验中，发现细胞质中DAPI染色体与线粒体特异性标记（Mitotracker Red；Molecular Probes）共定位（数据未显示）。用只含有GFP蛋白的表达载体进行的对照实验显示，没有出现细胞室特异性染色，并且整个细胞的背景色均匀（图。). 这些观察结果表明，Ntg酶的细胞分布是不同的，Ntg2被分选到细胞核，Ntg1靶向细胞核和线粒体。然而，我们不能排除一小部分低于GFP检测水平的Ntg2被分选到其他细胞区室的可能性。推测的N末端线粒体靶向序列表明Ntg1的线粒体定位（图。; 残基15至20），巴顿和卡巴克首次预测(4). GFP与Ntg1 N末端的融合阻止了线粒体分选（Ntg1-GFPn[图。])可能是通过干扰线粒体膜转运的假定先导序列。Ntg1和Ntg2都含有高密度带正电氨基酸区域（Ntg1的残基14至17和31至37，Ntg2的残基8至12和376至380[图。])PSORT算法对核定位信号有很强的预测能力(33).
荧光显微镜酿酒酵母表达Ntg1-和Ntg2-与GFP的融合。酿酒酵母FF18733通过单独表达GFP、NTG1-GFPn、NTG1/GFPc或NTG2-GFPc的DNA构建物转化。细胞也用DAPI染色，以显示细胞核和线粒体中的DNA。
酿酒酵母NTG2不能诱导DNA损伤。
体内表达NTG公司通过Northern blot分析测量基因功能（图。A） 并通过基因启动子与细菌的融合分析lacZ公司报告基因（图。B） ●●●●。如前所述(17)mRNA水平和启动子诱导证实NTG1公司是DNA损伤诱导的。相反，NTG2系列如两种实验所示，未在任何显著程度上诱导。此外，由lacZ公司基因融合分析表明NTG2系列表达水平明显低于NTG1公司即使在不可简化的条件下。
的表达式NTG1公司和NTG2系列在里面酿酒酵母接触DNA破坏剂。（A） Northern印迹分析。从未经处理的细胞和暴露于H的细胞中分离出的总RNA2O（运行）2将（1 mM）、甲萘醌（5 mM），MMS（0.05%）和NQO（2μg/ml）在甲醛–1%琼脂糖凝胶上分离，并将其吸附在尼龙膜上。将印迹与1.2 kb杂交NTG1公司探针，剥离，用1.1-kb重混合NTG2系列探针，再次剥离，最后与2.1kbβ-actin探针杂交。杂交信号的量化和计算NTG1/NTG2相对于β-肌动蛋白（非处理样品归一化为1），H为1.2/0.8、2.3/0.7、1.9/1.2和1.9/1.32O（运行）2、甲萘二酮、MMS和NQO。（B） 启动子融合分析。酵母FF18733携带NTG1:：lacZ或者NTG2:：lacZ在着丝粒质粒上进行融合，检测未处理细胞（开放条）或暴露于甲萘醌（0.3 mM；灰色条）或MMS（0.05%；填充条）的细胞中表达的β-半乳糖苷酶活性。
讨论
DNA序列分析显示酿酒酵母与…相似大肠杆菌内切酶III，Augeri等人从酵母细胞提取物中对两种不同的内切酶Ⅲ活性（称为ScrI和ScrII）进行生化纯化也表明了这一点(三). 我们之前已经对NTG1公司酵母功能的突变分析和酶表达大肠杆菌(17). 在这项工作中，我们纯化了Ntg1和Ntg2，使其具有明显的物理均匀性，并比较了它们的酶性质。此外，我们还构建了酿酒酵母单缺陷或双缺陷突变体NTG1公司和NTG2系列这两种酶从DNA中去除Tg和faPy残基的效率相似。然而，Ntg1在去除5-OHC方面似乎效率很低，5-OHC是Ntg2和大肠杆菌第N个(20). 相反，Ntg1对紫外线诱导的胞嘧啶衍生DNA损伤具有更广泛的特异性（图。). 两种基因的自发突变和过氧化氢诱导突变水平升高ntg1型和ntg2型突变体表明，这两种酶都需要修复内源性以及诱导的氧化DNA损伤。因此，尽管Ntg1和Ntg2在酶性质上有相当大的重叠，但在正常条件和遗传应激情况下，它们似乎对保持DNA的完整性必不可少。这一观察结果可能可以用底物特异性的差异来解释。此外，由于Ntg1的诱导性，Ntg1可能还需要应对遗传应激条件，并且在线粒体DNA修复中也具有独特的作用。线粒体的损伤被认为会影响活性氧的增加(12)这反过来可能会对细胞造成损伤，使细胞中非还原性Ntg2酶的能力超载ntg1型突变体。然而，NTG1公司和NTG2系列如下文所述，在由细胞内复合物形成或隔室的差异引起的修复中可能有其他单独的作用。
大肠杆菌Nth已被证明依赖赖氨酸120和天冬氨酸138残基的酶活性(40). Lys 120被认为是C′-1碳脱氧核糖的一级亲核试剂，它通过β消除来影响碱去除和随后的链断裂。这两个残基也在Ntg1（Lys 243和Asp 262）和Ntg2（Lys 288和Asp 287）中保守，可能是ɛ-α氨基中间产物捕获所必需的（图。). [4Fe-4S]簇被认为参与了第N个的DNA结合，并且该基序在Ntg2中是保守的，但在Ntg1中不存在。Ntg2相对于Ntg1更强的DNA损伤结合特性与[4Fe-4S]簇在DNA结合中的作用一致。从Nth的结构分析表明，[4Fe-4S]簇和HhH基序之间的带正电荷的缝隙可以容纳活性位点内碱基结合翻转的DNA(40). 同样的机制可能适用于Ntg2，但需要进一步的结构分析来阐明Ntg1的反应模式。然而，在Nth和Ntg2之间也观察到底物特异性的差异，这可能是由于活性位点囊内螺旋外修饰碱基的可变结合所致。Nth似乎仅用于氧化嘧啶残基的切除，而Ntg酶的底物范围也包括甲脒基嘧啶。由于咪唑片段化的嘌呤类似于具有立体侧基的嘧啶，因此看起来Ntg2可能比Nth含有更灵活的活性位点裂缝。
线粒体中的DNA特别容易受到DNA损伤，因为它靠近氧化磷酸化过程中产生的副产品ROS(12). 据我们所知，本报告中证明的Ntg1的线粒体定位是第一个直接证据，证明切除修复酶被分类到酵母的线粒体中，并表明该酶在避免线粒体中氧化DNA损伤积累方面发挥着重要作用ntg1型与野生型相比，突变型可能表明Ntg1在多大程度上阻止线粒体中形成突变。
虽然底物特异性差异可以解释Ntg1和Ntg2对酵母修复的要求，但也可能涉及其他因素。可能是这些酶在基因组结构的不同水平上运作。由于染色质结构影响DNA对蛋白质的可及性，因此包括转录和修复在内的DNA处理反应必须由染色质的结构和动态特性耦合和调节。在酵母中，核苷酸切除修复（NER）和光解酶在不同基因组组织水平上修复嘧啶二聚体的异质性已被证明(38). NER在转录的链上的作用比未转录的链更快，这与染色质结构无关。在非核小体区域观察到有效的光解酶复活，而受核小体保护的嘧啶二聚体被光解酶缓慢修复。然而，在活性基因中，通过光解酶去除非转录链上的二聚体比转录链更快。先前的体内研究酿酒酵母已经表明，与非转录链相比，转录链上的Tg损伤修复得更快。此外，Tg的去除似乎独立于NER功能，除了RAD2型基因，提示由DNA糖基化酶启动的修复途径(29). Ntg1 C-末端的酸性结构域可能参与蛋白质相互作用，表明Ntg1可能是Tg转录偶联修复的候选基因。与Ntg1相比，Ntg2对DNA有很强的亲和力，这表明Ntg2可能能够与组蛋白竞争DNA可及性。因此，也许Ntg2在某种程度上可以作用于染色质结构的保护区域，这意味着Ntg2对DNA氧化损伤具有潜在的全局修复功能。对其体内作用的进一步研究NTG1公司和NTG2系列功能应该包括染色体结构修复的特征，包括核小体、连接区和表达基因。
在编写本报告期间，You等人(42)发表了一篇论文，描述了从酵母中纯化的Ntg1/Scr1和Ntg2/Scr2的特性。关于DNA中Tg和faPy残基的活性，他们的结果与我们的相似。
