蛋白质磷酸化在信号从细胞表面传递到细胞核中起着重要作用(27). 已经描述了几种信号转导途径，包括自身为转录因子的细胞内激素受体；细胞表面受体与转录因子之间的直接相互作用，转录因子经修饰后转移到细胞核；和蛋白激酶的线性级联，例如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）（参考文献综述55)作为细胞表面受体和核转录因子之间的联系。通过MAPK刺激转录的最具特征的表面受体家族之一是ErbB家族，它由四个受体组成，即ErbB-1[表皮生长因子受体（EGFR）]、ErbB-2、ErbB3和ErbB-4。在配体结合后，这些受体形成同二聚体和异二聚体的不同组合，从而增加信号的多样化潜力并紧密调节MAPK激活(51). 每个ErbB蛋白由一个大的细胞外配体结合结构域、一个单一的跨膜片段和一个含有酪氨酸激酶亚结构域和羧基末端尾部区域的细胞内部分组成。ErbB-1、ErbB-3和ErbB-4存在多个配体，这些配体似乎诱导了ErbB蛋白不同的同源和异源二聚体。ErbB-3和ErbB-4、Neu分化因子（NDFs）或神经调节蛋白的配体是结合并激活其同源受体的肽生长因子。
神经调节蛋白的生物活性，从基因敲除小鼠和培养细胞系的表型推断（参考文献综述11)，描述了上皮细胞-间充质和其他类型的诱导细胞-细胞相互作用中的作用。神经调节蛋白的不同亚型，也称为NDF、heregulin或乙酰胆碱受体（AChR）诱导活性，被分离出来作为导致ErbB-2酪氨酸磷酸化的活性(26,48,65)或在神经肌肉突触中诱导AChR(19)分别是。直到后来才确定，配体的神经调节蛋白家族的亚型并不直接与ErbB-2结合，而是与ErbB3和ErbB-4相互作用(58,62). 原位杂交分析表明，NDF主要在实质器官、胚胎中枢和外周神经系统、成人大脑和神经肌肉突触中表达(12,32,44,46). 因此，这些观察结果导致了这样一种观点，即神经调节蛋白通过对参与异嗜性细胞间相互作用的配体和受体的转录调节来控制诱导过程（参考文献综述6). 然而，迄今为止，只有少数基因被NDF转录调控：在体内和体外，在神经肌肉连接处的肌肉细胞中，AChRα、δ和ɛ亚基基因被NDF-诱导两到三倍(三,12,32,60). AChR基因选择性地表达在突触下方的肌纤维核中，NDF目前是AChR表达的运动神经元衍生诱导剂的主要候选物。另一个神经调节蛋白调节基因Krox-20是一种锌指转录因子，参与雪旺细胞髓鞘形成的控制(61). NDF，调节大鼠雪旺细胞前体细胞的存活和增殖(17)在胚胎发生过程中，参与了雪旺细胞中Krox-20表达的诱导(45). 另一个已知受NDF与其受体结合产生的信号调节的基因是神经营养素3（NT-3）基因，该基因编码交感神经节周围非神经元细胞产生的Trk配体(64).
Sp1转录因子家族除了Sp1本身之外还包括三个成员：普遍表达的Sp2和Sp3(24,37)和Sp4，其表达仅限于大脑(24). Sp1是一种磷酸蛋白，含有三个Cys-2–His-2型锌指基序，与富含GC或GT的启动子元件具有高亲和力(29,30,53). 蛋白质的几个区域参与其功能调节，包括三个反式激活域(14)、一个DNA结合区域和一个参与多重聚合和协同反式激活的羧基末端结构域(22,47). 已证明，Sp1作用于细胞表面的信号级联的下游，其DNA结合、转录活性和蛋白质相互作用均受磷酸化和去磷酸化事件的调节(4,15,31,39,53,68,69). 酪蛋白激酶II对Sp1的磷酸化导致其DNA结合下调，从而抑制编码D位点结合蛋白的两个基因的转录(4,39)以及葡萄糖介导的乙酰辅酶A羧化酶(68). 同样，转化生长因子β对α2（I）胶原基因的诱导涉及Sp1的去磷酸化(23). 相反，蛋白激酶A（PKA）对Sp1的磷酸化已被证明可以增强HL-60细胞中其DNA结合和转录活性(53). 此外，Sp1参与细胞周期调节，因为其活性受视网膜母细胞瘤蛋白的调节(36)可能通过与视网膜母细胞瘤家族成员p107的直接蛋白相互作用(16). 因此，Sp1受到多种细胞类型特异性调节模式的影响，这些模式在调节其在细胞生长和分化中的作用。
在本研究中，我们表明NDF靶基因的转录控制是通过Sp1结合到各自启动子共享的富含CA的元素来介导的。NDF以及其他EGF样配体与ErbB受体的结合通过推定的60kDa蛋白激酶诱导Sp1的磷酸化。随后，在富含CA的位点（我们称之为NDF反应元件[NRE]）上形成含Sp1的复合物，这导致转录活性增加。显然，NRE处Sp1-DNA复合物的形成并不是由于DNA结合活性本身的调节，它可能涉及高阶蛋白质相互作用。
材料和方法
材料和抗体。
EGF购自Sigma（密苏里州圣路易斯），重组NDF制剂（类EGF域）购自Amgen（加利福尼亚州千橡树）。放射性材料来自Amersham（英国小查尔丰特）。兔和山羊抗Sp1多克隆抗体购自圣克鲁斯生物技术公司。Sp1抗体针对Sp1的436至454氨基酸。与其他Sp家族成员没有交叉反应。除非另有说明，否则所有其他材料均来自Sigma。pCI-Sp1是Scott L.Friedman（纽约西奈山医疗中心）的礼物。
质粒。
大鼠AChRɛ亚单位基因启动子片段（−228至+27）被克隆为巴姆HI（高）-Hin公司pɛ-228/CAT质粒的dIII片段(18)进入Bgl公司二-Hin公司pSEAP-basic（Clontech Laboratories，Inc.）的dIII位点。构造p（NRE）三E1b-LUC是一种双链NRE寡核苷酸（顶链，5′-TCGACTGCCCCCCCCCACATCACC-3′），用T4激酶磷酸化，然后克隆到Xho公司pE1b-LUC的I站点(1). 退火的寡核苷酸被设计成携带萨尔I站点位于5′端Xho公司I位于3′端。自动双脱氧核苷酸测序确定噬菌体包含三个NRE寡核苷酸拷贝，所有拷贝方向相同。pGEX-Sp1，一种指导细菌表达Sp1与谷胱甘肽融合蛋白的质粒S公司-转移酶（GST），通过克隆生态RI（此端填充Klenow酶）-Sma公司I从pCI-Sp1片段到生态pGEX-3X（Pharmacia）的RI（钝端Klenow酶）位点。
细胞转染和报告基因分析。
采用磷酸钙沉淀法转染P-19畸胎瘤细胞。细胞在转染前24小时以2×10接种5细胞/60-mm培养皿置于生长培养基中（补充10%胎牛血清[FCS]的α-最小必需培养基[MEM]），转染前3 h用Dulbecco MEM加10%FCS进行参考。用8μg报告质粒[pɛ-228/SEAP或p（NRE）转染细胞三次三E1b-LUC]和2μg pCMV-βGal作为转染效率的内部对照。将其保存在转染培养基中14至16小时，然后用生长培养基清洗和重新标记。10小时后，用生长培养基中的NDFβ（100 ng/ml）处理细胞，或不处理12小时，然后采集细胞进行荧光素酶或β-半乳糖苷酶分析。或者，取出生长培养基的等分试样并测定胎盘碱性磷酸酶活性。根据制造商（Clontech Laboratories，Inc.）的描述，对分泌型碱性磷酸酶（SEAP）活性进行了分析。简而言之，在添加配体12小时后，取下一等分（110μl）培养基并离心以去除细胞碎片。将所得上清液与SEAP稀释缓冲液混合（1:3），并在65°C下培养30分钟。添加分析缓冲液和化学发光底物，并在室温下培养混合物20分钟。在试管光度计（特纳）中测量SEAP活性。荧光素酶和β-半乳糖苷酶检测是从在磷酸盐缓冲液中刮取的细胞中进行的，并将其分为两个试管。对于β-半乳糖苷酶分析，将细胞离心并重新悬浮在50μl 0.25 M Tris-HCl（pH 7.5）中，并通过六个冻融循环制备提取物。通过离心法去除细胞碎片，并在含有1 mM MgCl的磷酸钠缓冲液（pH 7.5）中分析等分上清液的β-半乳糖苷酶活性2，45mMβ-巯基乙醇和0.88μg ONPG(o个-硝基苯-β-d日-吡喃半乳糖苷）。通过将细胞重新置于30μl裂解缓冲液（Promega）中，制备荧光素酶测定用提取物。在室温下培养10分钟后，去除细胞碎片，并将所得上清液的等分液与100μl荧光素缓冲液（0.1 M三醋酸、10 mM醋酸镁、1 mM EDTA[pH8.0]、74 mM荧光素、2.2 mM ATP）混合。用光度计测量光强度。为了排除因转染效率差异引起的变异，报告者荧光素酶和SEAP的活性在每个点均归一化为内部β-半乳糖苷酶对照的水平。
全细胞和细胞核提取物的制备。
全细胞提取物是从生长在10厘米培养皿中的培养物中制备的。将细胞单层清洗两次，并在含有2 mM原钒酸钠、10 mM氟化钠、0.5μg/ml亮白肽、2μg/ml抑肽酶、0.5μg/ml胃蛋白酶抑制素A和0.5 mM苯甲脒的1 ml磷酸盐缓冲盐水中刮擦，然后转移到微离心管中。在12000×10s离心后克将细胞重新悬浮在0.3 ml缓冲液A中（10 mM HEPES-KOH[PH7.9]，1.5 mM MgCl2，10 mM KCl，0.5 mM二硫苏糖醇[DTT]，0.2 mM苯甲基磺酰氟[PMSF]，20 mMβ-甘油磷酸，10 mC第页-硝基苯磷酸盐，400 nM冈田酸），在冰上孵育10分钟，涡流10秒，如上所述离心10秒。将粗细胞提取物重新悬浮在30μl缓冲液C中（20 mM HEPES-KOH[PH7.9]，25%甘油，420 mM NaCl，1.5 mM MgCl2，0.2 mM EDTA【pH 8.0】，0.5 mM DTT，0.2 mM PMSF，20 mMβ-甘油磷酸，10 mM第页-硝基苯磷酸盐，400 nM冈田酸）在冰上培养20分钟，并离心（14000×克2分钟）。使用Bradford试剂（Bio-Read实验室）测定蛋白质浓度。将等分（5μl）的全细胞提取物在液氮中快速冷冻并储存在−70°C下。核提取物是从生长在150毫米培养皿中的细胞培养物中制备的。用冰镇洗涤缓冲液（2.7 mM KCl，1.5 mM KH）洗涤细胞单层两次2人事军官4，136 mM氯化钠，8.1 mM钠2高功率放大器4·7小时2O） 一次用缓冲液A-NE（10mM Tris-HCl[pH 7.8]、15mM KCl、2mM MgCl2、1 mM DTT、0.1 mM EDTA、0.2 mM PMSF、每ml 2μg亮肽、每ml 0.1 mg抑肽酶、30 mMβ-甘油磷酸、400 nM冈田酸、2 mM原钒酸钠）。将细胞刮入2ml缓冲液A-NE中并离心。细胞颗粒在1 ml缓冲液B（含有0.2%Nonide P-40的缓冲液A-NE）中溶解，用力移液10次，然后立即在14000×克持续2分钟，使细胞核颗粒化。浓缩（10倍）细胞质提取缓冲液（0.3 M HEPES-KOH[PH7.9]，1.4 M KCl，0.03 M MgCl2)将混合物加入上清液中，以100000×克，并且将得到的细胞质提取物在液氮中快速冷冻。将造粒的细胞核重新悬浮在315μl缓冲液C-NE中（50 mM Tris-HCl[pH7.8]，50 mM KCl，0.1 mM EDTA，1 mM DTT，0.1 M PMSF，10%甘油，30 mMβ-甘油磷酸，400 nM冈田酸，2 mM原钒酸钠），添加35μl 3 M硫酸铵（pH7.9），并在4°C下轻轻倒置30 min。经过15分钟的离心步骤（200000×克在4°C）下，向上清液中添加等量的3M硫酸铵，并以100000×克将颗粒蛋白重新悬浮在50μl缓冲液C-NE中10分钟，以进行凝胶内激酶分析，并在液氮中快速冷冻。或者，在样品缓冲液I（0.3%十二烷基硫酸钠[SDS]，200 mM DTT，28 mM Tris-HCl[pH7.0]，22 mM Tris碱）和样品缓冲液II（9.9 M尿素，4%壬二酸P-40，2.2%两性细胞，100 mM DTD）的混合物（1:4）中进行再悬浮，以进行双向凝胶电泳。蛋白质浓度用Bradford试剂测定。
电泳迁移率变化分析（EMSA）。
从未处理的细胞或用NDF或EGF处理指定时间间隔的细胞（每种浓度为100 ng/ml）制备的全细胞提取物（5至10μg）与0.1 ng（20000 cpm）的双链末端标记的NRE寡核苷酸探针孵育20分钟（在室温下）。孵育混合物还包含每毫升250纳克剪切鲑鱼精子DNA和结合缓冲液（10 mM Tris-HCl[pH7.5]，25 mM NaCl，0.5 mM EDTA，0.1毫克牛血清白蛋白/ml[BSA]，5 mM DTT，10%甘油）。如前所述，蛋白质-DNA复合物通过4%非变性丙烯酰胺凝胶电泳分离(51). 为了控制提取物活性和数量，使用NF-Y结合基础转录因子的双链寡核苷酸（顶链，5′-TTTGGATTGAAGCCAATATATA）进行姐妹反应。为了分析开工率，在没有标记探针的结合缓冲液中培养提取物，并将9μl（含2.5μg全细胞提取物蛋白质）的等分样品与NRE探针（104cpm）并孵育指定时间。培养结束后，将样品加载到流动性转换凝胶上。
碱性磷酸酶治疗。
将全细胞提取物（5μg）在脱磷酸缓冲液（25 mM HEPES-KOH[pH 7.9]，34 mM KCl，50 mM MgCl）中于室温下平衡5 min2). 将碱性磷酸酶（0.1 U；Boehringer Mannheim）添加到冰上，并将混合物培养15分钟。通过添加等体积的抑制剂混合物（20 mM NaF、20 mM钒酸钠、20 mM焦磷酸钾、200μg/ml BSA、0.02%Nonide P-40、20%甘油、5 mM DTT、250 ng剪切鲑鱼精子DNA/ml）停止反应，然后添加NRE探针（20000 cpm）。在室温下继续培养20分钟，并如上所述分离蛋白质-DNA复合物。作为不同结合缓冲液的对照，在与碱性磷酸酶孵育之前添加抑制剂混合物。
双向凝胶电泳。
按照制造商（Bio-Rad）的规定，使用垂直管凝胶和等体积的两个两性电解质（pH值3至10和pH值8至10[Bio-Rad]）对P-19核提取物（5μg）进行等电聚焦。第二个维度是在10%聚丙烯酰胺凝胶中进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。将分离的蛋白质电印在硝化纤维过滤器上，用Sp1特异性抗体（见下文）检测Sp1蛋白，然后用辣根过氧化物酶连接蛋白A检测。用制造商（Amersham）指定的化学发光试剂检测复合物。
西部和西南部斑点。
在还原条件下，通过凝胶电泳（8%丙烯酰胺）分离P-19核提取物样品（一式三份，每份60μg），并转移至硝化纤维过滤器。过滤器被切割成允许用抗体或放射性标记探针探测每组样品。对于Western分析，在TBST缓冲液（10 mM Tris-HCl[pH8.0]，150 mM NaCl，0.05%吐温20）中清洗一次印迹，并在室温下在含有5%牛奶的TBST缓冲溶液中封闭1 h。随后在含5%牛奶的TBST缓冲液中用Sp1特异性抗体（1μg/ml）培养印迹。对于西南部分析，使用复性缓冲液（20 mM HEPES-KOH[pH 7.9]，3 mM MgCl）清洗膜两次2，40 mM KCl，10 mMβ-巯基乙醇，80μM ZnSO4)然后用含4%牛奶的20 mM HEPES-KOH（pH 7.9）封闭1小时。在西南结合缓冲液中平衡膜（10 mM HEPES-KOH[pH7.9]，70 mM NaCl，1 mM DTT，0.3 mM MgCl2、0.1%Triton X-100、每毫升60μg BSA、每毫升37.5μg剪切鲑鱼精子DNA）和NRE探针（用Klenow片段和[α-32P] 添加ATP），在室温下培养3小时。作为对照，在添加探针之前，将结合缓冲液中两倍过量的冷NRE培养1小时。最后，在室温下用含有0.01%Triton X-100的结合缓冲液将膜冲洗两次，持续5分钟，并进行自动射线照相。
凝胶激酶测定。
核提取物在含有0.2 mg GST-Sp1或GST蛋白的10%聚丙烯酰胺凝胶上分离，作为每ml的对照。GST融合蛋白在谷胱甘肽-糖柱上亲和纯化。将凝胶在含有20%异丙醇的50 mM HEPES-NaOH（pH 7.5）中洗涤，并在缓冲液I中用两种洗涤液（50 mM HEPES[pH 7.5]，5 mMβ-巯基乙醇）和在含有50 mM尿素的缓冲液I内用两种冲洗液变性。用含有0.02%吐温20的缓冲液I进行逐步复性，并在同一缓冲液中进行最后一晚的清洗。激酶反应在激酶缓冲液中进行（20 mM HEPES-NaOH[PH7.5]，20 mM MgCl2，2 mM DTT，20μM ATP，5μCi的[γ-32P] 在30°C下，将凝胶用含有5%三氯乙酸和1%焦磷酸钠的混合物冲洗数次，干燥并进行自动射线照相。
代谢标记[32P] 正磷酸盐和免疫沉淀。
P-19细胞生长在10-cm的平板中，达到70%至80%的汇合。将细胞清洗三次，并在含有5%透析FCS的无磷Dulbecco MEM（Sigma）中培养2小时。然后将培养基改为无磷培养基，其中含有0.5 mCi的[32P] 每毫升正磷酸盐（Amersham）。4小时后，用NDFβ（100 ng/ml）处理细胞30分钟或不处理。随后的所有步骤都是在冰上用冰镇缓冲液进行的。用磷酸盐洗涤缓冲液洗涤细胞三次，刮入500μl RIPA缓冲液中（50 mM HEPES-KOH，[PH7.9]，150 mM NaCl，2 mM EDTA[PH8.0]，10%甘油，0.1%十二烷基硫酸钠，1%Nonide P-40，0.5%脱氧胆酸钠，50 mMβ-甘油磷酸，1 mM原钒酸钠，10 mM NaF，400 nM冈田酸，10 mMK2HPO4、1 mM PMSF、抑肽酶、亮氨酸蛋白酶和胃蛋白酶抑制素各1μg/ml），并在冰上培养20分钟。在14000×克，将上清液转移到新鲜的微型离心管中，用25μl蛋白a-Sepharose预处理提取物30分钟，并剧烈摇晃。珠粒（12000×克2分钟），将上清液转移到新试管中，并添加25μl与Sp1或Egr1特异性抗体（兔多克隆抗体；Santa Cruz）结合的蛋白a-Sepharose珠。在4°C下进行免疫沉淀2h，剧烈摇晃，然后用RIPA缓冲液洗涤免疫沉淀蛋白五次。最后一次清洗时，将珠子转移到新的试管中，再悬浮在30μl的2×蛋白质样品缓冲液中（120 mM Tris-HCl[pH6.8]，10%甘油，3%十二烷基硫酸钠，20 mM DTT，0.4%溴酚蓝），并煮沸5分钟。用SDS-PAGE（7.5%丙烯酰胺）分离样品，转移到硝化纤维素中并进行自动射线照相。随后，如上所述封闭膜并进行Western blot，但抗Sp1抗体来源于山羊（Santa Cruz），使用的二级抗体是抗山羊辣根过氧化物酶结合抗体（Jackson Immunoresearch Laboratories，Inc.）。
结果
在编码AChRδ和ɛ亚基及NT-3的基因启动子中鉴定NDF调节的DNA序列。
为了确定NDF调节的序列元件，我们比较了它们的结构（图。A） 和核苷酸序列（图。B） 已知NDF转录激活的四个基因的启动子；这些是编码大鼠和小鼠AChR的ɛ亚单位和小鼠δ亚单位的基因(5,12,32,60)和NT-3(64). δ和ɛ亚基的启动子都包含一个足以进行肌肉特异性和NDF特异性调节的区域(12,32). 此外，已经证明E盒（图。A） AChRɛ亚基基因对于肌肉特异性转录很重要，而对于NDF的诱导则不必要(12). AChRɛ亚基基因的调控为跨突触诱导提供了一个特别有用的模型，因为它是唯一表现出严格空间调控的亚基；α、β、γ和δ亚单位受机制调节，在某些条件下，这些机制也允许在突触区域外表达。我们在AChRδ和ɛ亚基的增强子和NT-3基因的上游区域鉴定了一个常见的20-bp序列，并假设该序列元素对观察到的NDF介导的基因表达诱导很重要。为了验证这一预测，我们将大鼠AChRɛ亚单位的完整启动子序列（228 bp）放入(18)报告质粒上游，构建pɛ（−228/+25）-SEAP。还构建了另一个报告质粒，包含位于荧光素酶基因上游的三个疑似20bp序列拷贝[质粒构建体p（NRE）×3-LUC]。分别用两种报告质粒和一种β-半乳糖苷酶质粒将P-19畸胎瘤细胞转染三份，作为所有转染检测的内部对照。正如预测的那样，用NDFβ刺激转染的P-19细胞可显著诱导两种报告基因（图。C） ：在全长启动子增强子pɛ（−228/+25）-SEAP的背景下，NDF能够将SEAP活性提高两到四倍（图。C、 左）。此外，共享的20 bp序列足以介导NDF对荧光素酶表达的影响（图。C、 中心）。
AChRɛ基因启动子中NRE的定位。（A） 大鼠AChRɛ基因（核苷酸−185至+25）、小鼠AChRδ基因（−151至+84）和小鼠AChR-δ基因（-148至+24）肌肉特异性表达所需的最小启动子区域，以及NT-3基因启动子中包含假定NRE的区域。赋予肌肉特异性表达的E-box元素由阴影方框表示，赋予神经调节蛋白反应性的区域由实心方框表示；框中的箭头表示此元素的方向。mRNA起始位点由大箭头指示。（B） NDF诱导基因启动子中发现的富含CA元素的序列比较（星号表示严格保守的碱基）。图中还显示了寡核苷酸（NRE Oligo）的序列，我们使用该序列构建报告质粒并执行EMSA。我们在大鼠AChRɛ报告子中引入的一个突变也被列出（大鼠ACh R \603；mut）。（C） NDF通过NRE诱导转录激活。以下结构用于检测报告基因的转录激活（与β-半乳糖苷酶报告基因共同转染P-19细胞作为内部对照）：大鼠AChRɛ基因融合到SEAP基因的最小启动子[P \603]（−228/+25）-SEAP]，荧光素酶报告基因[p（NRE）×3-LUC]上游克隆的NRE寡核苷酸的三个拷贝，以及pɛ（−228/+25）-SEAP的两个版本，野生型和突变型（大鼠AChR \603,mut[B]）。转染后24小时，细胞未经处理（−）或用NDFβ（100 ng/ml）处理（+）。16小时后，采集细胞进行荧光素酶和β-半乳糖苷酶检测，或对其培养基进行SEAP活性检测。用报告基因获得的信号归一化为β-半乳糖苷酶活性。
为了进一步确定该元素作为NDF应答位点的功能，将其两个保守的胞嘧啶突变为胸腺嘧啶（图。B、 大鼠AChRɛmut）。突变的报告子结构用于与野生型报告子结构的平行转染实验（图。C、 右侧）。这些实验的结果表明，突变的AChR报道子对NDF的诱导完全没有反应（图。C、 右）或保持非常低的活性（未显示数据），从而将短序列确立为NRE的重要组成部分。
识别由多个配体诱导活化的NRE结合络合物。
利用EMSA研究NDF介导的NRE蛋白-DNA复合物的诱导。用NDF处理不同时间间隔后，从不同类型的细胞制备全细胞提取物，并与放射性标记的NRE寡核苷酸孵育（图。B） ●●●●。作为凝胶负载量相等的对照，我们使用NF-Y寡核苷酸作为NF-Y结合核因子的探针（图。B车道4至6）。用NDF处理30分钟后，在几个细胞系中检测到两个DNA蛋白复合物（图。)：P-19畸胎瘤细胞（表达ErbB-1、ErbB-2和ErbB-3）、T47D乳腺癌细胞（表达所有四种ErbB）和HeLa人宫颈癌细胞（表示ErbB-1和ErbB-4）以及其他（数据未显示）。NRE结合活性的诱导动力学不同；在P-19和HeLa细胞中，在添加NDF后30分钟观察到最大诱导，而在T47D细胞中，最大诱导仅在2小时后出现，但持续时间更长。此外，快速迁移复合物的强度（图。A） 我们测试的细胞系之间存在差异；在P-19细胞中，其诱导作用相对较弱，而在T47D和HeLa细胞中，这两条带的强度相当。总之，NDF对NRE结合复合物的诱导具有快速、特异性和细胞类型无关性，因此可能有助于NDF调节其他基因的转录。
NDFβ和EGF诱导两种NRE结合复合物的形成。（A） 使用寡核苷酸双链（顶链序列，5′-TCGACTGCCCACCCCCCCACATCACC-3′）作为探针，在没有（−）或5μg从P-19、T47D或HeLa细胞制备的全细胞提取物的情况下培养。如图所示，细胞未经处理（N）或用NDFβ或EGF处理指定的时间间隔，并用EMSA测定NRE结合。箭头表示两个蛋白-DNA复合物的位置。请注意，P-19细胞中缺少流动性较大的复合体（开放箭头）。（B） 将从NDF处理或未处理的P-19细胞制备的全细胞提取物与NRE寡核苷酸（1到3道）或NF-Y寡核苷酸探针作为对照（4到6道）用于EMSA。注意，NDF对NF-Y没有影响。
与与ErbB-3和ErbB-4结合的NDF类似，ErbB-1配体EGF能够诱导类似模式的DNA-蛋白复合物（图。). 然而，复合物的诱导作用弱于NDF。因此，EGF被用于pɛ（−228/+25）-SEAP报告子的转染分析，以测试其诱导转录的能力。我们发现EGF对SEAP活性的诱导非常低（数据未显示），这可能反映了EMSA测量的DNA结合诱导明显较低。为了将此观察扩展到其他生长因子，用其他几种配体处理P-19和T47D细胞30分钟。干细胞因子（SCF/c-Kit配体）和促肿瘤佛波酯-佛波酯醋酸酯（TPA）能够诱导P-19细胞中两种DNA结合复合物的形成。SCF的作用远低于TPA，并且SCF相关因子血小板衍生生长因子在该细胞系统中不起作用。此外，与NDF不同，NDF主要诱导慢分子复合物，SCF和TPA以相似的程度诱导了这两种DNA-蛋白复合物，并且在使用这两种因素处理后也检测到了第三条中间带（图。). 在T47D细胞中，EGF和肿瘤坏死因子都能够将NRE特异性DNA蛋白复合物诱导到与NDF诱导的水平相似的水平，而碱性成纤维细胞生长因子和α-干扰素没有作用（图。). 因此，NRE结合活性的诱导由几个但不是所有测试的生长因子共享。然而，这两种复合物的水平和相对诱导度不同。
生长因子在NRE探针上诱导蛋白质-DNA复合物。用指示的生长因子处理P-19（左）或T47D（右）细胞30分钟或用TPA处理2小时，然后制备全细胞提取物。提取物与标记的NRE探针孵育，蛋白-DNA复合物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离。箭头表示游离寡核苷酸探针的位置，箭头表示蛋白质-DNA复合物的位置（缓慢的复合物[闭合箭头]和快速迁移复合物[开放箭头]）。缩写：NS，非刺激性；血小板衍生生长因子；SCF，干细胞因子；肿瘤坏死因子；碱性成纤维细胞生长因子；INFα，α-干扰素。
由NDFβ激活的DNA结合蛋白是转录因子Sp1。
NDFβ诱导NRE位点的转录激活，以及该DNA序列上的复合物形成。为了确定与该位点结合的因子，我们使用了未标记的竞争性寡核苷酸，这些寡核苷酸携带多个已知转录因子的一致富含胞嘧啶的结合元件。选择T47D细胞进行此试验，因为在这些细胞中，NDF可对两种复合物进行相似诱导（图。和). 将T47D细胞的全细胞提取物与各种未标记竞争物寡核苷酸的100倍和500倍摩尔过量量孵育，并用EMSA测试NRE结合活性（图。A） ●●●●。由于EGF对A-431细胞的治疗导致STAT-1转录因子的磷酸化和随后的核定位，从而使其能够结合同源反应元件γ-干扰素激活位点(56)，我们测试了γ-干扰素激活位点寡核苷酸。然而，该DNA元素无法取代在NRE寡核苷酸上形成的NDF诱导复合物（图。A、 车道10和11）。类似地，AP-2反应元件，一个对AP-2转录因子家族特异性的富含CA的序列(66)，不追踪任何蛋白-DNA复合物（将第7和第8条车道与第9条车道进行比较）。然而，一致的Sp1元素，GC-rich序列(41)特别与迁移速度较慢的复合体有关（将第3和第4车道与第9车道进行比较）。事实上，与未标记的NRE探针相比，Sp1共有寡核苷酸更有效地消除了慢迁移复合物的形成（将通道1和2与通道3和4进行比较）（数据未显示），这表明NRE结合复合物与共有Sp1序列的相互作用更紧密。一种突变的Sp1寡核苷酸，携带一个点突变，可消除与Sp1的结合(41)，无法竞争迁移速度较慢的综合体（第5和第6车道）。因此，慢迁移复合物可能由Sp1或Sp1家族中具有DNA结合特异性的另一个成员组成。为了鉴定特异性成员，我们试图用Sp1特异性抗体延迟NRE蛋白复合物的电泳迁移率。我们使用的抗体针对的是Sp1的一个区域，这在Sp家族成员之间是不同的。对P-19和T47D细胞的整体提取物进行的超移分析表明，NRE结合蛋白确实是Sp1（图。B） ：抗体能够特异性地移动上带。在进行类似测试时，对照免疫前血清或Sp3特异性抗体没有显示出任何效果（图。B、 通道3和6）（数据未示出）。由于在转染试验中，携带NRE突变的报告构建物不受NDF的诱导，因此基础转录活性没有受到影响（图。C） ，我们得出结论，Sp1对于NDF诱导AChRɛ至关重要，但对于基本启动子活性则不重要。
识别与NRE相互作用的因素。（A） NRE和共有寡核苷酸之间的竞争。从NDFβ处理的T47D细胞中制备全细胞提取物，并在没有（−）或存在指示的未标记竞争物寡核苷酸的情况下，用NRE探针培养100倍过量（1、3、5、7和10道）或500倍过量（2、4、6、8和11道）。箭头表示自由NRE探针的位置，箭头表示两个蛋白-DNA复合体的位置（实心箭头表示迁移较慢的复合体）。（B） 慢迁移蛋白-DNA复合物与Sp1特异性抗体发生超转移。从EGF处理的P-19细胞或NDF处理的T47D细胞制备的全细胞提取物与Sp1特异性抗体（αSp1）预孵育。作为对照，用免疫前血清（PI）或无抗体（−）处理提取物。然后添加标记的NRE探针，并在非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质-DNA复合物。标记Sp1特异性复合体（实心箭头）和超移位复合体（阴影箭头）的位置。请注意，较低的NRE复合体没有发生超位移。
NDF介导的NRE复合物形成的诱导依赖于蛋白质磷酸化。
转录因子活性的调节可以通过诱导从头合成蛋白质或通过修饰（主要是磷酸化）来实现(27)现有蛋白质。因为Sp1是一种高度磷酸化的磷蛋白，在所有细胞系和组织中普遍表达(34)，我们假设Sp1结合活性的诱导是由于蛋白质磷酸化或去磷酸化事件。酪氨酸激酶通用抑制剂金雀异黄素对细胞的治疗(49)，消除了NDF对较慢迁移复合物的诱导，同时不影响较快迁移物种的激活（图。A[左]，将车道6和7与车道2和3进行比较）。相比之下，ErbB酪氨酸激酶特异性抑制剂酪蛋白AG-2002(21)，抑制两种蛋白-DNA复合物的诱导（图。A（右），第7和第8车道）。PKC抑制剂、GF109203X、蛋白激酶A信号通路激活剂和forskolin对复合物的形成没有影响。一种磷脂酰肌醇3′-激酶抑制剂Wortmanin降低了基础和NDF诱导的迁移率变化水平。然而，NDF的诱导仍然可以检测到。相比之下，使用冈田酸（一种有效的蛋白磷酸酶抑制剂）进行治疗(13)EMSA测定，强烈抑制两种NRE蛋白复合物的诱导（图。A[右]，将车道3至6与车道1和2进行比较）。冈田酸的抑制浓度（0.5μM）（图。A、 左图）可以特异性抑制蛋白磷酸酶2A（PP2A），这意味着PP2A作为NDF激活Sp1上游信号的正向调节器。
磷酸化事件对于调节Sp1与NRE位点的结合非常重要。（A） 激酶和磷酸酶抑制剂对NDFβ处理的T47D细胞NRE结合活性的影响。在使用NRE探针进行EMSA之前，将细胞与抑制剂GF109203X（GF109，一种蛋白激酶C特异性抑制剂）、染料木素（酪氨酸激酶的一般抑制剂）、福斯科林（环AMP磷酸二酯酶的抑制剂）、冈田酸（OA，蛋白磷酸酶2A的抑制剂）预培养20分钟，AG2002（ErbB酪氨酸激酶活性抑制剂）和沃特曼（磷脂酰肌醇3′-激酶抑制剂），然后用NDF处理。对照培养物未经抑制剂处理。两个蛋白-DNA复合物的位置用箭头表示（闭合箭头，Sp1-特异复合物；开放箭头，快速迁移复合物）。作为对照，使用NF-Y探头（下面板）进行EMSA。（B） CIP体外处理抑制Sp1 DNA结合。NRE（上面板）和NF-Y（下面板）探针与5μg从P-19细胞制备的提取物培养，这些提取物与NDFβ（N）培养指定的时间间隔。对照培养物未经生长因子（−）处理。在EMSA之前，将提取物与CIP孵育，然后通过添加特定抑制剂（氟化钠、钒酸钠和焦磷酸钾的混合物[通道4和5]）抑制磷酸酶。或者，在使用CIP治疗之前添加抑制剂（通道2和3）。Sp1特定复合体的位置由箭头指示。（C） Sp1是一种磷酸化蛋白，其磷酸化被NDF增加。P-19细胞用含有[32P] 正磷酸盐，然后用NDF处理（通道1和3）或不处理（通道2和4）。制备全细胞提取物，并与抗Sp1抗血清（泳道1和2）或抗Egr1抗体（泳道3和4）一起孵育。免疫沉淀物通过SDS-PAGE溶解并电泳转移至硝化纤维过滤器。对过滤器进行放射自显影（插图），然后用Sp1抗体进行免疫印迹（数据未显示）。这两个信号都被量化了，其比率以直方图表示。条形图下方的数字对应于凝胶层。（D） 用双向凝胶电泳分析NDF诱导的Sp1磷酸化。从未经处理的（对照组）或每毫升100 ng NDFβ处理的P-19细胞中制备核提取物（5μg蛋白质）。作为对照，分析两种核提取物（各2.5μg）的混合物（MIX）。提取物在第一维通过等电聚焦分离（显示pH值），在第二维通过SDS-PAGE分离（标记蛋白的位置以千道尔顿表示）。然后将蛋白质转移到硝化纤维过滤器中，用抗Sp1抗体通过免疫印迹检测Sp1蛋白。
接下来，我们研究了NRE结合复合物被磷酸化的可能性，以及这种蛋白质磷酸化对DNA结合至关重要。为了测试这一范式，我们用非特异性磷酸酶（小牛肠磷酸酶，CIP）处理从生长因子处理的细胞制备的全细胞提取物，然后确定其如何影响EMSA模式。为了控制缓冲条件的差异，在存在特定抑制剂的情况下用CIP处理提取物。此外，作为特异性对照，CIP处理的提取物与NF-Y反应元件孵育。这些分析的结果表明，蛋白质去磷酸化抑制了Sp1和快速迁移复合物的结合（图。B、 比较车道3和5）。CIP处理不会以非特异性的方式损害提取物的DNA结合活性，因为仍然可以检测到与NF-Y探针的结合（图。B、 底部）。
为了确定NDF是否诱导活细胞中Sp1磷酸化增加，我们用放射性正磷酸盐培养P-19细胞，用NDF刺激细胞，然后确定Sp1磷酸化度的状态。从标记细胞中免疫沉淀Sp1，进行SDS-PAGE，转移到硝酸纤维素膜上，并进行放射自显影。正如预期的那样，Sp1在未刺激的细胞中被磷酸化（图。C、 插图，通道1），但与NDF孵育30分钟会适度增加其磷酸化（通道2）。相比之下，另一种锌指转录因子Egr-1的磷酸化状态不受NDF的影响。使用抗Sp1抗体重新布设硝化纤维过滤器，可以精确定量Sp1磷酸化：测定Sp1磷酸化度增加50%至60%。这种适度增加可能是由于Sp1的基础磷酸化相对较高。因此，NDF诱导的磷酸化通过另一种方法进行测试，即双向凝胶电泳，该方法检测磷酸化引起的等电点变化。从未经处理和NDF处理的P-19细胞制备核提取物，并通过双向凝胶电泳进行分离，该凝胶电泳根据蛋白质在第一维的等电点和第二维的大小分离蛋白质。将凝胶分离蛋白转移到硝化纤维过滤器，并用Sp1特异性抗体进行免疫印迹。该分析表明，未刺激细胞中存在几种Sp1亚型，但NDF可使其pI范围向酸性极点扩大（图。D） 与磷酸盐基团的添加相一致。电泳从处理过的和未处理过的细胞中提取的混合物证实了NDF的作用（图。D、 底部）。我们估计大约一半的Sp1分子在NDF处理后被修饰。此外，修饰的Sp1的外观表明，这些超磷酸化的Sp1分子上附着了一个以上的磷酸基团。在未给出结果的实验中，我们未检测到Sp1的酪氨酸磷酸化，这表明该富含丝氨酸和苏氨酸的蛋白质的修饰不会影响其少量酪氨酸残基。
NDF对Sp1结合活性的调节独立于单体Sp1 DNA结合能力。
观察到的NDF诱导的Sp1与NRE结合的增加可能归因于蛋白质水平的变化或DNA结合能力的增强。为了深入了解潜在的机制，进行了Western和Southwestern分析，以确定Sp1蛋白水平或其结合DNA的能力是否发生变化。用抗Sp1抗体对全细胞提取物进行免疫印迹，排除了蛋白质水平变化导致蛋白质复合物与NRE结合增加的可能性（图。A、 左）。用标记的NRE作为探针对核提取物进行西南分析表明，单体Sp1的结合不受NDF处理的影响（图。A、 中心）。然而，NDF增加了NRE与分子量约为45000的未知蛋白质的结合。然而，与NDF和冈田酸的联合处理未能影响p45或Sp1（p110）与NRE的结合（图。A） 尽管这种治疗抑制了NDF诱导的EMSA中NRE寡核苷酸上复合物的形成（图。A） ●●●●。标记的NRE探针与凝胶分离的蛋白质（包括Sp1）结合的特异性从图的右侧面板中显而易见。A： 一个未标记的NRE寡核苷酸将标记的探针从所有蛋白带上移开。可以想象，尽管NDF增加了Sp1的磷酸化，但由于单体Sp1的NRE结合没有改变，这种修饰明显调节了Sp1寡聚状态或其与其他蛋白质的相互作用。
NRE上Sp1结合和络合物形成动力学。（A） 西南分析。从未经处理（−）或用NDFβ处理30分钟的P-19细胞制备全细胞提取物。在使用NDF治疗之前，用冈田酸（OA）培养第三个培养物20分钟。用SDS-PAGE分离重复提取物（60μg），然后用Sp1抗体进行Western blot分析（左），或用标记的NRE探针进行Southwestern分析（中、右）。为了控制NRE结合特异性，在存在过量未标记NRE探针的情况下也进行了西南分析（右）。Sp1标注栏由箭头标记。（B） NRE上络合物形成的On-rate动力学。在EMSA结合缓冲液中培养由未处理（1至9道）或NDF处理（10至18道）细胞制备的整个P-19细胞提取物。取下等量的样品，用标记的NRE探针培养指定的时间间隔。培养结束后，将样品装入流动性转换凝胶中。NRE特定复合体的位置由实心箭头（最慢的复合体）、开放箭头和括号（迁移最快的复合体”）标记。时间标记为秒（“）或分钟（'）。注意，由于在凝胶上加载样品时进行连续电泳，所有括号标记的带代表相同的复合物。
为了在NDF治疗后检测此类含Sp1的复合物，进行了速率分析。全细胞提取物与NRE探针孵育不同时间间隔（图。B） ●●●●。未经处理的提取物和NDF处理的提取物之间存在两个显著差异（图。B、 车道1至9和车道10至18）。首先，在最短的时间间隔内，NDF已经增加了NRE与迁移最慢和迁移最快的复合物的结合（图。B） ●●●●。第二，在与NRE探针长时间孵育后，这两种缓慢迁移的复合物在NDF处理的提取物中表现出更高的稳定性（图。B） ●●●●。因此，NDF似乎诱导了NRE位点上Sp1和其他蛋白质的复合物形成。
一种约60 kDa的NDF可刺激激酶磷酸化Sp1，并被冈田酸抑制。
为了测试NDF增加Sp1磷酸化进而导致NRE反式激活的情况，我们使用凝胶内激酶分析了NDF处理的P-19细胞的提取物。作为凝胶内磷酸化的底物，我们使用了一种重组Sp1蛋白，以与GST融合蛋白的形式。变性和复性后，凝胶溶解的蛋白质与[γ]孵育-32P] ATP原位检测Sp1特异性激酶。在分离的提取物中观察到三条主要的激酶活性带。其中，NDF快速诱导约60kDa的显著条带，其活性持续（图。). 在仅在GST存在下聚合的凝胶中也检测到第二个主要蛋白带（约84 kDa）（数据未显示），因此被认为对Sp1无特异性。重要的是，用0.5μM冈田酸预处理细胞，可以阻止NDF对60-kDa激酶活性的诱导（图。，比较通道2和7），与冈田酸对Sp1与NRE结合的抑制作用一致（图。A） ●●●●。有趣的是，第三条激酶带（约45kDa）对冈田酸表现出敏感性，并被NDF弱激活（图。)这意味着它在功能上与60-kDa激酶相关。总之，P-19细胞中存在一种可复性的Sp1特异性激酶，其活性可由NDF诱导。这种激酶可能用于在NRE中进行私有Sp1作用。
增强Sp1与NRE结合的激酶是NDFβ诱导和冈田酸敏感的。在无（−）或有（+）0.5μM冈田酸（在NDFβ前20分钟添加）的情况下，用NDFβ处理P-19细胞，时间间隔为指定的时间间隔。然后，通过使用重组形式的人Sp1蛋白和凝胶内激酶测定分析细胞提取物的激酶活性，如材料和方法中所述。由NDF诱导、冈田酸抑制的激酶的位置用箭头标记。分子量标记蛋白的位置以千计。
讨论
Sp1与特定反应元件的结合及其转录功能的转录激活受多种细胞外刺激调节。胰岛素样生长因子I通过破坏Sp1 DNA结合调节弹性蛋白基因(31)转化生长因子β增强α2（I）胶原基因的转录(28)和p15细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(42)通过Sp1共识网站。同样，胃泌素启动子的EGF刺激由Sp1介导(43). 本研究将后一项观察扩展到EGF家族的另一种生长因子NDF。我们对其他EGF-like配体的研究表明，Sp1在不同程度上介导ErbB受体大多数（如果不是全部）配体的转录调控。此外，表达四种ErbB受体不同组合的细胞株对NDF和EGF有反应，表明Sp1作用于所有ErbB蛋白的下游（图。以及我们未发表的观察结果）。一些独立的证据表明，Sp1在ErbB信号的传输中发挥作用。（i） 含有Sp1结合位点的全长启动子以及衍生的20-bp序列可以通过NDF激活活细胞中的两个报告基因（图。C） ●●●●。（ii）活细胞的NDF处理增加了抗Sp1抗体识别的核因子与最小NRE序列元素的结合（图。和). （iii）NDF可以提高Sp1的磷酸化的观察结果（图。C和D）间接支持该转录因子位于ErbB下游的概念。
我们确定为NDF-调控元件的序列不同于常见的Sp1结合位点、GC或GT盒(33). 然而，一个包含CCACCC元素三个重复序列的NRE相关序列被鉴定为白细胞介素-6启动子中与Sp1结合的基础和诱导序列(35). 另一个富含CA的序列，视网膜母细胞瘤控制元件，由视网膜母细胞癌蛋白（Rb）调节，定位于几个生长调节基因的启动子，如c-福斯和c-myc公司(52). 该元件结合几个转录因子，包括Sp1和Sp3(36,63)并且，取决于细胞环境，将被Rb抑制或刺激。已证明，由于对Sp1结合位点的竞争，Sp3可抑制Sp1介导的转录(25). 因此，Rb的作用可能取决于细胞中Sp1和Sp3分子之间的比率。然而，我们的初步分析没有检测到NRE中Rb和Sp1的功能相互作用。
NDF对Sp1反式激活的缓慢动力学可能反映了ErbB酪氨酸磷酸化启动的信号处理（图。). 然而，导致Sp1活化的确切分子机制尚不清楚。对Sp1结构和功能的分析表明，该蛋白可以分为离散的功能域：一个DNA结合域和四个控制转录激活的独立域(34). 我们的西南分析表明，Sp1反式激活可能不是由于单体Sp1 DNA结合域与NRE的亲和力增加所致（图。A） ●●●●。Sp1作为单体与单个GC盒结合。然而，Sp1单体之间的高阶复合物是通过直接的蛋白-蛋白质相互作用组装的，这种相互作用不涉及与DNA的额外接触，但需要两个N末端转录激活域(47). Sp1磷酸化可通过增加蛋白质相互作用的亲和力，从而在不改变单体DNA结合亲和力的情况下，促进DNA上Sp1多聚体的形成，从而避免对高局部蛋白质浓度的需要，如西南部分析所示（图。A） ●●●●。此外，如速率分析所示，Sp1的磷酸化可能影响与其他蛋白质形成复合物（图。B） 导致NRE场地上形成含Sp1的复合物。GBF是一种GC均聚物结合因子，被确定为与AChRα亚基E盒下游的GC盒（EMSA中迁移最快的复合物）结合的第二个因子(8). 该因子与Sp1之间的相互作用可能促进NDF刺激细胞NRE上复杂的形成，从而调节转录。
导致NRE结合的信号通路的药理学干预产生了一些新信息。使用通用抑制剂genistein或ErbB特异性酪蛋白抑制酪氨酸磷酸化可有效减少NRE上NDF依赖性复合物的形成（图。A） ●●●●。该观察结果与ErbB水平和导致MAPK激活的线性级联中酪氨酸磷酸化的要求一致。事实上，MAPK通过神经调节蛋白亚型AChR诱导活性参与了AChR两个不同亚单位的调节(57)和海格林(三). PKC的抑制并不影响Sp1与NRE的结合（图。A） 尽管作为PKC激动剂的TPA有效地激活了Sp1（图。). 同样，PKA特异性激动剂对Sp1-NRE复合物的形成没有影响（图。A） ，尽管之前已经证明PKA可以直接磷酸化Sp1(53). 可以想象，ErbBs与Sp1的功能联系是由MAPK介导的，而不是由PKC或PKA介导的。尽管这两种激酶可能通过其他细胞外刺激参与Sp1的激活。
冈田酸的抑制作用（图。A） 根据Sp1的去磷酸化增强其DNA结合活性的观察结果，这是很有趣的(39)用冈田酸治疗白血病细胞通过激活Sp1增强WAF1/CIP1的表达(10). 在这两种情况下，PP2A直接作用于Sp1，而在连接NDF和Sp1的途径中，冈田酸似乎作用于Sp1的上游。一些蛋白激酶与Sp1活性的调节有关，包括一种依赖于DNA的蛋白激酶，其Sp1的磷酸化不影响其反式激活或DNA结合活性(29). 此外，两个PKA(53)酪蛋白激酶II，对Sp1有抑制作用(4)，与之前的研究有关。然而，这些激酶中没有一个与我们使用凝胶内激酶分析检测到的60-65-kDa蛋白激酶活性相似（图。). 这种NDF-诱导蛋白激酶的特性及其激活途径尚不清楚。然而，以下事件序列可能先于Sp1与NRE结合的增强：NDF与ErbB蛋白结合后，酪氨酸磷酸化的快速刺激和级联的逐步激活导致MAPK激活。60至65 kDa的Sp1特异性蛋白激酶可能位于其中一种激酶的下游。通过PP2A或相关磷酸酶对Sp1上游的一种激酶进行去磷酸化，可能会激活Sp1磷酸化。或者，PP2A可以使Sp1中的一个或多个位点去磷酸化，这是激活Sp1和不同位点磷酸化所必需的（图。C） ●●●●。磷酸化后，该转录因子可能寡聚或与其他细胞成分结合，导致与NRE的结合增强。
NDF以及其他EGF-样配体的信号传导被导入一个复杂的信号网络，该网络对四种ErbB蛋白的10种同二聚体和异二聚体组合下游的有丝分裂和分化信号进行多样化和调节（参考文献综述2). 就像它在蠕虫中的原始版本(38)和苍蝇(50)，哺乳动物ErbB网络主要通过MAPK途径发挥作用。我们目前的结果表明，ErbB蛋白的大多数二聚体与Sp1反式激活偶联。与此概念一致果蝇属锌指转录因子，称为条纹，被证明作用于昆虫ErbB蛋白同源物的下游(20). 此外，Krox-20(61)和Egr-1(40)两个不同于Sp1的锌指转录因子分别受NDF和EGF的转录和翻译控制。可以想象，ErbB下游的信号机制通过控制多个锌指转录因子将细胞外信号转化为不同的基因表达程序。这种机制可能介导由NDF和ErbB蛋白调节的许多诱导过程，包括神经和雪旺细胞之间的相互作用(45)非神经元细胞对神经元的存活作用(64)实质器官中间质-上皮细胞的相互作用(67)以及突触部位的神经元和横纹肌(19). 最后一个例子更容易理解：除了锌指蛋白之外(8)，GABP，一种Ets类转录因子，调节神经肌肉突触处烟碱AchR的空间表达(54).
如果所有ErbB蛋白都与Sp1激活偶联，如何维持信号特异性？通过修饰糖基化可以赋予基因表达的特异性(30)或磷酸化(29)Sp1状态或ErbB-Sp1信号模块成分的组织特异性表达。然而，四种Sp1蛋白中的三种普遍表达削弱了Sp1表达的时空控制赋予NDF信号特异性的可能性。或者，Sp1可以作为支架蛋白(9)这有助于结合或增强其他转录因子的转录激活，而这些转录因子的表达并不普遍。再次，来自烟碱AchR的ɛ和δ亚基的转录可以作为一个例子：除了NRE外，这两个启动子还包含一个E-box元件（图。A） 结合肌生成因子如肌生成素和Myf-5(18). 根据最近的一份报告，AchRα亚单位的调控受到肌源性和非肌源性转录因子的复杂控制，包括Sp1、Sp3和其他三种不同的因子(7). 最近，研究表明Sp1可能与组蛋白脱乙酰酶相互作用，从而主动抑制转录。这种相互作用可能由Sp1磷酸化调节，这将导致其与组蛋白脱乙酰化酶分离，从而减轻抑制(59). 因此，与NRE结合的Sp1可能是导致NDF靶基因与组织和阶段特异性因子协同转录激活的复杂级联事件的一部分。
