CAR T细胞机制和功能的最新进展和发现

CAR零件和组件

CAR的细胞外部分通常来自可变光（V_L（左）)和可变重（V_H（H）)针对感兴趣肿瘤靶点的抗体（scFv）区域(图1). 这两个结构域之间的连接体通常来自重复的甘氨酸和丝氨酸残基，但也使用了其他连接体分子（即Whitlow连接体¹³). 为了克服与scFv相关的结构和聚合问题，一些CAR被设计为使用单域V_{HH（小时）}骆驼抗体、天然配体或人工蛋白结合结构^14–16铰链（也称为间隔区）将抗原识别胞外结构域连接到跨膜区域。为了让单链抗体结构域结合其同源抗原，这个铰链需要一定的灵活性。CAR设计中使用了多种铰链区域，包括从CD28和CD8开发的域¹⁷CAR的跨膜部分跨越细胞膜脂质双层，通常也来自CD28或CD8。据认为，该结构域可以影响CAR之间的分子相互作用，根据原始蛋白质的内源性跨膜结合形成同型二聚体或三聚体^18,19。所有当前美国FDA批准的CAR T细胞产品都是具有CD28或4–1BB共刺激域的第二代设计^11,12.除CD28外²⁰和4–1BB²¹，其他常见的共刺激结构域包括OX40²²，CD27²³和诱导性T细胞共同刺激物（ICOS）²⁴。如果在一个构造中使用两个协同模拟域，则这被视为第三代CAR²²CD3ζ细胞质域是CAR最远端的细胞内部分。该分子包含三个免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAM），它们在磷酸化时发出信号²⁵一些研究人员将T细胞功能增强的CAR称为“第四代”CAR，特别是当它们产生额外的蛋白质分子，如细胞因子或拥有额外的受体，如共刺激配体时。这些也被称为TRUCK（为通用细胞因子杀伤而重定向的T细胞）或装甲车^26,27.

当单链抗体识别抗原时，CAR T细胞被激活，导致CAR分子聚集和固定。CD3ζ链上ITAM结构域的磷酸化通过酪氨酸激酶ζ相关蛋白70 kDa（ZAP70）启动信号传导，类似于TCR信号传导²⁸这会释放T细胞效应器反应，包括增殖、释放细胞因子、代谢改变和细胞毒性。CAR T细胞被认为主要通过分泌颗粒酶和穿孔素发挥细胞毒功能，但有数据表明，死亡受体也被利用，这是基于下游分子的激活，如BH3-相互作用域死亡激动剂（BID）和FAS相关死亡域蛋白（FADD）^29–31来自共刺激域的信号依赖于所选域的特定功能，并且可以通过典型序列中的特定突变进行调节^32,33.

繁殖能力

在CD19-靶向CAR的临床研究中，患者血液中可检测到的CAR T细胞扩增与反应相关⁴⁶一项非常特殊的案例研究揭示了CAR T细胞持续增殖有益的进一步证据。一名慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者在接受两次CAR T细胞治疗后，最初在骨髓中显示肿瘤进展。然而，第二次输注两个月后，血液中CAR T细胞膨胀达到峰值，相应的肿瘤消退最终导致完全缓解。在进一步研究CAR T细胞扩增后，确定单个CAR T淋巴细胞克隆扩增，导致抗肿瘤反应延迟。该细胞具有tet-甲基胞嘧啶双加氧酶2的双等位基因断裂(TET2测试)该基因是由于慢病毒在一个等位基因中整合，而在另一个基因中发生了低形态突变。这个TET2测试双重敲除导致表观遗传景观的改变，导致细胞增殖增加，并形成更中心的记忆样表型，从而产生强大的抗肿瘤反应⁴⁷在人类原代T细胞中进行的全基因组CRISPR筛选确定了额外的基因，如果删除这些基因，可能具有类似的效果：细胞因子信号传导抑制剂1(SOCS1系列)，转录延伸因子B多肽2(TCEB2型; 亦称为ELOB公司)，RAS GTPase激活蛋白2(RASA2公司)、和CBLB公司（编码E3泛素连接酶）。这些基因的破坏在增殖和体外对肿瘤细胞的细胞毒性⁴⁸对患者CAR T细胞中病毒整合位点的进一步研究表明，应答者丰富了细胞吞噬和染色质修饰途径中编码蛋白质的基因的插入突变，从而促进增殖。基于这些数据，研究人员能够创建一个模型，在该模型中，可以根据载体整合位点预测临床结果⁴⁹这些研究表明，CAR T细胞在编码影响增殖的蛋白质的基因发生改变后，可能会产生更有效的细胞产物，但这需要与潜在致癌转化的担忧相平衡。

CAR T细胞具有更强的增殖和生存能力，已被证明在多种疾病情况下都是有益的。CD8（CD8）⁺CLL患者的T细胞受损，其特征是刺激后葡萄糖摄取减少⁵⁰这些受损的T细胞反应被认为是导致CLL患者对CAR T细胞的反应率低于其他B细胞恶性肿瘤的原因；有趣的是，对CAR T细胞有完全反应的CLL患者的CD8中线粒体生物发生增强⁺T细胞，与CAR T细胞的扩张和持久性相关⁵⁰在多发性骨髓瘤中，与复发性或难治性疾病患者相比，早发性疾病患者的T细胞更适合制造CAR T细胞，并可能具有更好的疗效⁵¹.

协同仿真中的差异

CAR中具有不同共刺激域的CAR T细胞具有不同的动力学特征，与CD28共刺激域相比，存在4–1BB共刺激域时扩张较慢，持续时间更长，导致快速扩张，但耐久性较差^52,53这种差异的分子基础尚不清楚，但以前的研究表明，基于CD28的CAR T细胞表现出更像效应器的记忆表型，糖酵解代谢增强，而基于4–1BB的CAR T细胞具有更中心的记忆表型并依赖脂肪酸代谢^54–56此外，已经表明细胞毒性CD8⁺接受4–1BB共刺激的淋巴细胞具有良好的增殖能力，体外扩增为记忆CD8⁺T细胞，与CD8相比，细胞溶解活性增强⁺CD28共刺激T细胞⁵⁷最近对这两种共刺激途径之间差异的研究表明，4–1BB CARs而不是CD28 CARs在配体结合后激活非经典核因子-κB（NF-kB）信号。通过显性阴性突变体（NF-κB诱导激酶（NIK；也称为MAP3K14）的C末端）的过度表达干扰这种信号传导，这是一种广泛使用的阻断非经典NF-kB信号的策略），由于凋亡信号分子BIM（也称为BCL2L11）的表达增加，减少了基于4–1BB的CAR T细胞的增殖和存活⁵⁸除了NF-κB外，4-1BB信号也依赖肿瘤坏死因子（TNF）受体相关因子（TRAFs），TRAFs影响CAR T细胞的活性、扩增和细胞毒性，部分原因是调节NF-κ的B。TRAFs在基于4–1BB的CAR T细胞中的过度表达增强了其功能⁵⁹4–1BB与CD28之间的另一个比较使用了磷酸化蛋白方法，表明基于CD28的CAR T细胞的效应样表型与快速激活和蛋白质磷酸化程度的较大变化相关。这种信号的强度部分是由于酪氨酸激酶LCK与CD28细胞内CAR结构域的组成性关联。相反，RNA测序表明，激活的4–1BB型CAR T细胞磷酸化程度较低，与CD28型CAR T细胞相比，记忆相关基因表达较高^33,60此外，Li等人。⁶¹研究表明，通过限制CAR的泛素化（通过突变CAR分子中泛素靶向赖氨酸残基），可以进一步增强基于4–1BB的CAR T细胞的持久性和记忆表型。CAR分子的循环增加而不是其降解，由于内体4–1BB信号增强，从而增强了氧化磷酸化⁶¹.

相反，当试图设计监管T（T_规则)具有保护组织功能的细胞，诱导理想表型的协同刺激被逆转。汽车T_规则细胞受益于CD28结构域，该结构域保留了其抑制活性体内针对期望的目标。这与基于4–1BB的CAR T不同_规则细胞，由于协同刺激的作用，其细胞毒性会越来越强⁶².

CD28和4–1BB以外的各种共刺激域已与CD3ζ信号结合用于CAR T细胞治疗。最近的研究表明，ICOS增加了CAR T细胞的持久性⁶³此外，ICOS结合4–1BB共刺激作为第三代CAR设计，在实体瘤小鼠模型中显示出优于基于4–1PB的第二代CAR的疗效。有趣的是，膜近端细胞内共刺激结构域在第三代CAR T细胞中具有主导作用⁶³.

克服疲劳

随着免疫检查点阻断技术的发展，癌症免疫治疗领域发生了革命性的变化。程序性细胞死亡蛋白1（PD1）激活后在T细胞上上调，并结合其天然配体PD1配体1（PDL1），以抑制T细胞的增殖和效应功能反应¹¹¹研究表明，阻断PD1–PDL1轴可以克服肿瘤中PDL1表达导致的T细胞抑制¹¹²这转化为美国食品药品监督管理局批准了针对PD1和PDL1的单克隆抗体，这两种抗体在肿瘤学领域取得了巨大的临床成功¹¹³通过免疫检查点阻断克服T细胞耗竭所学到的知识，目前正在应用于CAR T细胞，包括组合治疗、CAR T淋巴细胞自分泌抗免疫检查点分子、CAR T细胞自身免疫检查点基因的遗传扰动。例如，Cherkassky等人。¹¹⁴研究表明，用PD1抗体对CAR T细胞进行组合治疗，可以在小鼠模型中恢复CD28为基础的CAR T淋巴细胞效应器功能，在这些小鼠模型中，细胞通常会耗尽。目前有许多正在进行的临床试验评估了CD19-靶向CAR T细胞组合免疫检查点阻断（靶向PD1或PDL1）的效果(NCT02650999号¹¹⁵,NCT02706405号¹¹⁶,NCT02926833号¹¹⁷,NCT03310619号¹¹⁸). 早期结果表明，联合治疗是安全的，毒性低。一份病例报告甚至证明了联合治疗的益处：一名进行CD19-靶向CAR T细胞治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者在输血后第26天接受了抗PD1治疗。到第45天，观察到明显的肿瘤消退，到PD1阻断三周后，患者能够恢复工作¹¹⁹为了避免需要两种不同的治疗方法，研究人员还测试了CAR T细胞在临床前模型中对免疫检查点分子（包括抗PD1和抗PDL1）的抗体的固有分泌^120,121观察到与联合治疗类似的益处，包括延长T细胞功能和限制衰竭。局部分泌针对免疫检查点分子的抗体的额外好处是可以限制全身毒性¹²²另一种方法是将CAR T细胞设计为对PDL1具有抗性。一项研究表明，通过将带有PD1显性负受体的CAR T细胞转化为汇来减少PD1通过内源性受体的信号传递，可以限制衰竭¹¹⁴另一种方法是使用CRISPR–Cas9敲除CAR T细胞中编码PD1的基因。这可以提高抗肿瘤免疫力体外和内部体内存在PDL1的模型⁺肿瘤¹²³这种基因敲除方法在临床上也被证明是可以耐受的，PD1敲除T细胞在患者体内持续存在长达9个月⁴⁵.

还利用了其他非直接针对免疫检查站的方法来克服疲劳。与CAR一起表达构成性信号IL-7受体有利于在抗原暴露后增强CAR T细胞，但避免刺激旁观者细胞（与分泌细胞因子的CAR T淋巴细胞不同）。具体而言，该受体与CAR的共同表达增加了T细胞的增殖、持久性和抗肿瘤反应，而没有T细胞功能障碍¹²⁴在CAR紧张信号传导的小鼠模型中，研究了限制疲劳的另一种方法。疲劳与激活蛋白1（AP1）转录因子基序的可及性增加有关，这导致T细胞的终末分化。典型AP1因子JUN的过度表达可对抗衰竭，从而提高CAR T细胞的功能能力和抗肿瘤效力¹²⁵.

实体瘤：泛癌

CAR T细胞治疗领域的一个主要关注点是其在血液恶性肿瘤之外的适用性。许多因素阻碍了为实体肿瘤制造有效的CAR T细胞，包括但不限于缺乏肿瘤特异性抗原和免疫抑制性TME。该领域的许多领导者认为，除了CD19之外，还有不到十几个可行的CAR T细胞靶点，而确定在肿瘤中具有高、同质表达但在健康组织中没有表达的靶点（以限制靶向和非肿瘤毒性）已被证明是困难的。

B7-H3（也称为CD276）免疫检查点分子在过去几年中一直是一种流行的免疫治疗靶点，有一些很有前景的临床试验是以单克隆抗体为靶点的分子(NCT02982941号^144,145,NCT02381314号^146,147,NCT03406949号^148,149,NCT02628535号^150,151,NCT03729596号^152,153). 然而，提出以B7-H3为靶点的CAR T细胞产品的一个主要问题是，由于在正常组织中的低表达导致靶向毒性¹⁵⁴Majzner等人。¹⁵⁴基于这种特异性单链抗体设计了一种CAR T细胞，以限制低水平B7-H3表达的健康组织的靶向毒性。他们表明，在高抗原密度的情况下，包括髓母细胞瘤、骨肉瘤和尤因肉瘤在内的几种儿童癌症，B7-H3靶向的CAR T细胞是有效的体外和体内然而，当抗原密度低时，B7-H3靶向的CAR T细胞具有低得多的活性，这表明在临床上可能存在有效、无毒的B7-H3靶向的CAR T细胞治疗的治疗窗口¹⁵⁴.

He等人。¹⁵⁵设计了一种所谓的237CART，可以识别多种癌症特异性抗原。237CART细胞基于一种最初用于识别Tn-糖基化足蛋白（Tn-PDPN）的抗体。237CART细胞对肿瘤特异性识别的基础是肿瘤细胞功能缺失突变的结果中远集团，编码一种分子伴侣，被认为是表达活性T合成酶所必需的，而活性T合合成酶是粘蛋白型O-聚糖生物合成过程中唯一一种半乳糖基化Tn抗原的酶。这种由COSMC突变导致的Tn半乳糖基化的差异模式已被证明发生在卵巢癌、白血病、乳腺癌、肉瘤和神经母细胞瘤中。由于这种泛癌识别，237CAR T细胞特别有趣。此外，He等人已经证明237CART细胞可以识别许多Tn-糖肽，而不仅仅是Tn-PDPN。这对237CART细胞治疗的有效性是有希望的，因为可以避免抗原逃逸¹⁵⁵.

近年来，针对间皮素的CAR T细胞被用于多种适应症，包括胰腺癌、肺癌和卵巢癌。临床前模型前景看好，目前正在进行一些临床试验¹⁵⁶初步结果表明，以间皮素为靶点的CAR T细胞是安全的，并且有抗肿瘤活性的证据，这对CAR T淋巴细胞用于实体肿瘤的未来很有希望^157,158其他临床研究正在评估是否可以通过联合免疫检查点阻断来增强间皮素靶向CAR T细胞治疗，以增强T细胞反应¹⁵⁷最近，早期阶段I结果(NCT03907852号)使用基于间皮素靶向T细胞受体融合构建物（TRuC）的CAR宣布¹⁵⁹该CAR的scFv与TCR亚单位融合，缺乏传统的共刺激域。这些CAR保持其细胞毒性，但与传统的CAR T细胞相比，细胞因子释放更低，功效更高¹⁶⁰.

改善效应细胞类型

目前的制造工作使用来自患者的异质性T细胞（CD4除外⁺T细胞和CD8⁺在某些情况下，T细胞分离）。然而，有证据表明某些T细胞亚群可能比其他亚群更有效。已使用中央记忆T细胞进行临床试验，以制造基于CD28的CD19-靶向CAR T细胞(NCT01318317号¹⁷⁹,NCT01815749号¹⁸⁰). 初步结果表明，与批量生产的CD19-靶向CAR T细胞相比，这些细胞是有效的，但不一定具有更强的持久性。然而，有人认为共刺激结构域对持久性的影响比T细胞表型更强¹⁸¹虽然有兴趣从其他更罕见的亚群（如T记忆干细胞（T_{供应链管理}))，商业化成为一个困难，因为需要大规模生产具有良好生产规范（GMP）质量的细胞分选试剂¹⁸².CD26^高的CAR T细胞也已被研究，因为它们在实体肿瘤模型中具有优越的功能，这是由于细胞因子（IL-17A、IFNγ、IL-2、肿瘤坏死因子（TNF）和IL-22）、记忆、干样特性（β-连环蛋白和淋巴增强因子1（LEF1）增加所致表达）和贩运（CCR2和CCR5表达升高）¹⁸³γδT细胞是另一个潜在的优势亚群。绝大多数（95-99%）典型的CAR T细胞输注产品是αβT细胞¹⁸⁴两种亚群表现出同等水平的细胞毒性；然而，γδCAR T细胞不太容易衰竭，激活后T细胞免疫球蛋白粘蛋白受体3（TIM3）和PD1表达水平较低。此外，γδCAR T细胞表达共刺激和抗原呈递分子（CD86和人类白细胞抗原-DR（HLA-DR）），并被证明在TME中向其他T细胞交叉呈递肿瘤抗原¹⁸⁵也许最令人信服的是，肿瘤中γδT细胞的浸润与良好的预后相关¹⁸⁶.

有几种方法可以使CAR T细胞产品更像“一刀切”的药物(图4). 其中一种方法仍然需要自体细胞产品，但利用一种载体实现多种抗原特异性，这就是带有“zip”系统的分裂、通用和可编程（SUPRA）CAR，以调节T细胞反应。CAR T细胞在细胞外表达一部分“拉链”蛋白，带有细胞内信号结构域。然后，可以使用附着在相应搭档拉链上的各种蛋白质疗法来改变CAR的靶点和信号强度。还有一种组合方法，其中使用了两种不同的zip系统，一种具有CD3ζ信令域，另一种具有协同模拟¹⁸⁷其他潜在的通用CAR包括基于生物素结合免疫受体的二聚体系统¹⁸⁸和带有新epitope标签的交换机模块^189,190这些CAR针对特定标签，如异硫氰酸荧光素（FITC）或生物素。然后，该系统依赖于针对目标肿瘤抗原的第二抗体治疗；该抗体与标签结合，使抗抗原CAR识别它并对标记的肿瘤激活。

M.V.M由NIH R01 CA238268、R01 CA252940、白血病和淋巴瘤学会、抗癌协会和Damon Runyon癌症研究基金会资助。R.C.L.由NIH T32 GM007306资助，目前由NIH T22 AI007529资助。