多PDZ结构域蛋白维持感觉毛细胞顶端细胞骨架的模式

MPDZ缺失导致发育中毛细胞的顶端缺陷

我们得到了一个姆帕兹敲除小鼠项目（KOMP）的小鼠突变体（C57BL/6N-姆普兹^{em1（IMPC）J}/Mmucd，以后姆帕兹^DEL公司). 这种菌株携带一种吲哚姆帕兹外显子6，预计会导致移码，导致蛋白质在13个PDZ结构域中的第一个结构域之后提前截断。我们在姆帕兹^{交付/交付}动物，而以前姆帕兹突变体在3-4周龄时死亡(Feldner等人，2017年;Milner等人，2015年;Yang等人，2019). 然而，正如预期的那样，MPDZ抗体信号在姆帕兹^{DEL公司/DEL公司}听觉上皮(图1A） ●●●●。脉络丛上皮细胞中也没有信号，之前报道过MPDZ带有相同抗体(图S1A) (Yang等人，2019)，建立姆帕兹^DEL公司作为合适的功能损失模型（参见讨论和表S1以总结小鼠品系之间的差异）。

基于其定位，我们研究了MPDZ是否参与心尖部HC的形态发生。我们首先利用结合的指骨样蛋白成像胚胎和出生后阶段的发束，以揭示F-肌动蛋白。在E17.5，静纤毛组织在姆帕兹耳蜗基部的突变体和窝友控制(图1C） ●●●●。然而，在出生时（P0）和P4时，外HC（OHCs）中的顶端HC缺陷是明显的，其中发束缺乏其特征性的V形，并且经常分裂(图1C） ●●●●。因为在平板安装中突出的静纤毛的三维组织可能会混淆，所以我们用TRIOBP抗体标记P6处的静纤毛根(Katsuno等人，2019年). 我们发现在姆帕兹突变体(图1D） ●●●●。立体纤毛也形成了不完整的多余行，在P6时在束的侧面最明显(图1D、 箭头）。内部HCs（IHCs）表现出类似的缺陷，但较轻微，P0(图1C、 D）。有缺陷的发束仍能吸收P4中的苯乙烯染料FM 1-43姆帕兹突变体，机械感觉通道功能异常的标志(图S1B). 总之，这些结果表明，MPDZ作用于形成的发束外的顶膜，对产后HCs中静纤毛的正确定位和内聚、排列组织很重要。

用ZO1标记心尖连接显示P4的HC周长异常圆姆帕兹突变体与对照窝友的比较(图1E） ●●●●。我们量化了HCs患者的心尖表面积，并观察到姆帕兹突变体位于耳蜗基底部和耳蜗尖P4，而非P0(图1F） ●●●●。已知HC顶面在P0后减少，同时细胞周长重塑，这与发束的发育密切相关，并从圆形过渡到花生形(Etournay等人，2010年). 接下来，我们量化了HC顶点域的圆度。在P4，OHC处于姆帕兹与对照组相比，突变体保持了更圆的形状（更高的圆度），但在P0(图1G） ●●●●。中的IHC姆帕兹突变体在P0时圆度略有下降，但在P4时没有。MPDZ可能因此调节HC顶面重塑，影响静纤毛的位置和HC连接的形状。GNAI和GPSM2在裸区共享MPDZ定位，并且对于定义形成发束的侧面轮廓也至关重要(Bhonker等人，2016年;Ezan等人，2013年;Tarchini等人，2013年)以及高度和恒等性在静纤毛行之间的不对称(Mauriac等人，2017年;Tadenev等人，2019年;Tarchini等人，2016年). 接下来，我们分析了GNAI-GPSM2在姆普兹突变体。

MPDZ的丢失导致GNAI-GPSM2在毛细胞表面的逐渐离域

我们在出生后的第一周评估了HCs的GNAI定位。在P0或P2(图2A） ，GNAI在姆帕兹整个耳蜗的变异HCs。相反，在P4，许多耳蜗基底部的OHC表现出GNAI的内侧离域，而位于耳蜗中部和顶部位置的HC保持正常的GNAI分布。在P7，所有位于底部的OHC和许多位于中间位置的OHC显示出离域GNAI，而位于顶点的HC保持正常的GNAI分布。我们的结论是，随着HC分化在时间和空间上沿着耳蜗顶基梯度进行，MPDZ的丢失会逐渐改变心尖GNAI的分布(McKenzie等人，2004年). P4 OHC中GNAI信号强度的量化证实了从发束外侧到内侧的剧烈离域。与对照相比，GNAI在侧面裸露区的富集度下降，而在姆帕兹突变体(图2B） ●●●●。

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图2。

在没有MPDZ的情况下，GNAI和GPSM2的顶端富集逐渐减少并离域。（A） GNAI免疫标记（品红色）在出生后不同阶段和耳蜗沿线的位置（最大投影）。在姆帕兹突变体，GNAI在侧裸区和邻近静纤毛的富集在耳蜗基底部P4处受到损害（箭头所示），该缺陷在P7处延伸至耳蜗中部。（B） 在P4 OHC中，GNAI在外侧（裸区）和内侧根尖表面富集。姆帕兹^DEL公司/+N个=3只动物，n个=34欧姆；姆帕兹^{交付/交付}N个=3,n个=43欧姆(Kruskal–Wallis与Dunn的多重比较测试；裸区与内侧：姆帕兹^DEL公司/+, ****P（P）<0.0001,姆普兹^{交付/交付},P（P）>0.9999;姆帕兹^DEL公司/+与姆帕兹^{德尔/德尔}：裸露区和内侧****P（P）<0.0001). （C） 三种不同根尖基底部P4的GNAI标记z（z）同一共焦叠加的水平（耳蜗基底部的OHC1-2场）。F-actin标记静纤毛，afadin（AFDN）标记顶端连接。在姆帕兹突变体，GNAI富集通常减少，通常在平坦的HC顶点（箭头）中部离域，部分在静纤毛（填充箭头）中丢失。GNAI也可在平坦顶点（未填充箭头）下方的内侧顶点连接处检测到。（D） P4 OHC裸区的GNAI富集。该示意图描述了GNAI的富集情况，与HC连接和控制中的发束相比姆帕兹突变体。将OHC顶面分为三个等宽的亚区（a、b、c），通过亚区测量GNAI信号。姆帕兹^DEL公司/+N个=3,n个=34欧姆；姆帕兹^{交付/交付}N个=3,n个=43欧姆.Sidak多重比较检验的双向方差分析(姆帕兹^DEL公司/+：a与b****P（P）<0.0001; b与c***P（P）=0.0003；a与cP（P）=0.1503;姆帕兹^{交付/交付}：a与b**P（P）=0.0025; b对c**P（P）=0.0042; a与cP（P）=0.9984). （E） 两个具有代表性的P4 OHC和IHC（耳蜗基底部；最大投影）在高倍放大下的GNAI富集。注意如何进入姆普兹突变HCs，GNAI信号减少，特别是在平坦的HC顶点。在OHC中，GNAI仅保留在邻近GNAI保留在裸区外围区域（白色箭头）的外围静纤毛子集中。或者，GNAI在HC平面（橙色箭头）的中间位置离域，而在发束中完全缺失。（F） GNAI（绿色）和乙酰化微管蛋白（ACTUB，红色）的联合免疫标记显示P4（耳蜗基底；最大投影）处的激肽细胞。与对照HC一样，激肽菌（箭头）位于姆帕兹突变OHC，即使GNAI在中部离域（箭头）。（G） P4 OHC（耳蜗基底）中GNAI-GPSM2联合标记。非本地化GNAI和GPSM2（箭头）仍在姆帕兹突变体。在F和G中，选择HC周长。A.U.，任意单位。比例尺：10µm（A）；5µm（C，E-G）。

接下来，我们试图更准确地定义GNAI是如何在姆帕兹突变HCs。在耳蜗基底部P4突变体OHC中，GNAI在裸区中心和静纤毛尖端处不断耗竭，但通常保留在裸区外围(图2C） ●●●●。有趣的是，GNAI是在内侧根尖膜外发现的（1）(图2C、 箭头）和（2）在内侧HC连接处与标有afadin（AFDN）的相邻支持细胞相连(图2C、 未填充的箭头）。我们通过测量沿纵轴裸露区三个相等亚区的GNAI富集来量化这一趋势(图2D类；区域a、b、c）。与对照动物的外周亚区（a、c）相比，中央亚区（b）的GNAI信号低约20%，这可能反映了基底体附近缺乏GNAI。相比之下，中央亚区（b）的GNAI信号比外围亚区（a，c）低约60%姆帕兹突变体。我们还量化了发束内侧三个相等亚区的GNAI富集(图S2). 异位GNAI信号在姆帕兹突变体.这些结果表明，从P4开始，GNAI对裸露区的限制首先在基底体附近的中央受损，并且GNAI逐渐侵入内侧根尖膜，可能从外侧向内侧重新扩大。

有趣的是，静纤毛尖端存在或不存在GNAI在空间上与单个OHC裸区相邻部分存在或不出现GNAI一致(图2E） ●●●●。当GNAI仅维持在裸区外围时(图2E、 白色箭头），GNAI仅维持在发束中的外周静纤毛尖端(图2E、 白色箭头）。在发束外完成GNAI的内侧重定位(图2E、 橙色箭头）与几乎完全失去GNAI的提示相匹配。在HC成熟期间，裸区GNAI-GPSM2富集逐渐减少(Tarchini等人，2013年). P4 IHC裸露区的GNAI含量低，导致平面离域，并与尖端难以评估的结果配对。然而，我们确实观察到，在姆帕兹与对照组相比，IHC突变，静纤毛尖端的GNAI损失与OHC相似但不太严重(图2E） ●●●●。中HC隔间GNAI的空间配对姆帕兹突变体支持我们的工作模型，即之前GNAI-GPSM2在裸区的富集指示其选择性地贩运到第一排相邻的静纤毛(Tadenev等人，2019;Tarchini等人，2016年).

因为受损的发束形态模糊了发束的方向姆帕兹突变体，我们接下来在P4免疫标记激肽菌。与对照HC一样，激肽菌系统地位于姆普兹突变体(图2F、 箭头）。这澄清了GNAI向内侧顶点的逐渐离域并不反映HC方向的变化。正如预期的那样，GNAI绑定合作伙伴GPSM2也以类似于GNAI的方式在姆帕兹突变体(图2G） ●●●●。

在缺乏MPDZ的情况下，毛细胞顶端蓝图被全面破坏

裸区的INSC-GNAI-GPSM2与内顶面的aPKC拮抗，这两个顶膜室之间的边界与形成发束的外侧边缘重合(Bhonker等人，2016年;Ezan等人，2013年;Tarchini等人，2013年). 与GNAI和GPSM2类似，aPKC在姆帕兹突变体。在P4的耳蜗基底部，aPKC仅局限于对照组OHC和IHC的内侧HC顶点，但在外周的整个顶面上发现姆帕兹突变体(图3A） ●●●●。通过测量发束两侧的aPKC富集度，证实突变体的外侧裸露区和内侧之间的比率明显高于对照组(图3B） ●●●●。值得注意的是，以前曾报道过异位aPKC侏儒和每平方加仑灭活(Ezan等人，2013年;Tarchini等人，2013年)表明PKC侵犯外侧心尖姆普兹突变体可能继发于GNAI-GPSM2的下调(图2). 相反，aPKC在P4时局限于耳蜗尖内侧(图3C） 在姆帕兹突变体，如对照HC。

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图3。

无MPDZ时，心尖膜的aPKC内侧限制消失。耳蜗基底部（A）和顶点（C）P4处（A-C）aPKC标记（洋红色）。顶端连接处标有afadin（AFDN；绿色）。（A） 对照组侧裸区无aPKC信号，显示异位aPKC姆帕兹OHC和IHC中的突变体（箭头）。（B） 耳蜗基部HC顶表面的aPKC富集。绘制了裸区（BZ）和内侧的信号强度比。姆帕兹^DEL公司/+N个=3,n个=11 IHC，n个=40欧姆；姆普兹^{交付/交付}N个=3,n个=13 IHC，n个=41 OHC（曼·惠特尼U型-测试；OHC和IHC：****P（P）<0.0001). （C） 在耳蜗尖部，aPKC通常被排除在姆帕兹突变体。下面板放大了方框区域（A1-A4；C1-C4）。比例尺：10µm。

总之，我们的结果表明，MPDZ对于P4后成熟HCs中的GNAI-GPSM2和aPKC结构域的正确极化和分离至关重要，而不是启动。平坦HC表面的去定域GNAI-GPSM2富集及其在静纤毛尖端的相应损失可能导致静纤毛排列紊乱和通常的发束畸形(图1C、 D）。然而，我们已经在P0处观察到了发束缺陷(图1C） 表明MPDZ也通过其他蛋白质影响顶端HC形态发生。

MPDZ定义了毛细胞和脉络丛细胞顶膜上的Crumbs复合体

先前报道MPDZ定位于上皮细胞紧密连接处并发挥作用(Adachi等人，2009年;Hamazaki等人，2002年;Tetzlaff等人，2018年). 相反，我们的结果揭示了MPDZ在HC顶膜上的作用，它通过顶交界将HC与其支持细胞邻居隔开。MPDZ是INADL的paralog(Adachi等人，2009年)是CRB3-MPP5/PALS1-INDL Crumbs复合体的成员，众所周知，该复合体可调节上皮发育和顶-基底极化(Charrier等人，2015年;Roh等人，2003年;Straight等人，2004年;Whiteman等人，2014年). 接下来，我们比较了MPDZ和其他Crumbs复合体成员在新生儿HCs中的定位，使用ZO1作为顶端连接和表面标记(xy公司)和投影(x赫兹)共焦叠加视图。

在P0和P4处，MPP5在裸露区富集程度最高，但在发束处也检测到中等浓度的MPP5，几乎没有信号(图4A） ，该分布与MPDZ的分布几乎相同(图1A） ●●●●。此外，在HC根尖交界处也检测到MPP5(图4A、 箭头）。投影视图证实MPP5（而非MPDZ）与ZO1在OHC支持细胞连接处共定位(图4B、 箭头）。偶尔出现的固定伪影将HCs和邻近支持细胞的质膜分离，这表明MPP5在这两种细胞类型中是连接的(图S3A)正如支持细胞-支持细胞接触处和听觉上皮外的连接MPP5分布所预期的那样(图4A） ●●●●。接下来，我们获得了针对CRB3细胞内表位的有效抗体(Szymanik等人，2015年). 虽然信号强度较低，但我们观察到CRB3在HC根尖膜和根尖连接处富集，MPP5也一样(图4C） ●●●●。与Crumbs复合体的其他成员相比，在HC顶膜上未检测到INADL(图S3B)，似乎仅限于支持细胞的顶端连接处(图S3B、C). 总之，这些结果表明CRB3-MPP5-MPDZ复合物特异性占据HC顶膜。

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图4。

MPDZ与MPP5和CRB3相一致，并且是它们在毛细胞顶膜上正确分布所必需的。（A-C）平板免疫标记(xy公司)和投影(x赫兹)P0和P4之间的听觉上皮视图。（A） MPP5免疫标记显示与MPDZ相似的蛋白质分布（参见图1A). （B） 投影图还显示了MPP5与ZO1在HC支持细胞连接处的共同富集（绿色箭头）。MPP5在HC和支持细胞连接处均富集（参见图S3A). 相反，MPDZ与ZO1在心尖交界处（红色箭头）未同时检测到。（C） CRB3的分布类似于MPP5（A，B）的分布，包括根尖膜和根尖连接（绿色箭头）。当ZO1信号被抗原回收程序破坏时，AFDN被用于可视化C的顶端连接。P0中的（D，E）MPP5标记姆帕兹突变体。在没有MPDZ的情况下，MPP5在裸露区域丢失（箭头），并在发束中异位发现（填充箭头）。MPP5保留在顶点连接处（未填充的箭头）。D中的方框区域在E（F，G）耳蜗基底部P0 HCs中MPP5的顶端富集中被放大。绘制了发束和裸区（F）的MPP5信号与内侧根尖交界处（G）的MPP 5信号的比值。（F）姆帕兹^DEL公司/+N个=3,n个=13ihc时，n个=49欧姆；姆帕兹^{交付/交付}N个=3,n个=11 IHC，n个=38 OHC（曼·惠特尼U型-测试；IHC和OHC：****P（P）<0.0001). （G）姆帕兹^DEL公司/+N个=3,n个=15 IHC，n个=52欧姆；姆帕兹^{交付/交付}N个=3,n个=13 IHC，n个=36 OHC（曼·惠特尼U型-测试；国际控股公司：**P（P）=0.0044; 职业健康保险：*P（P）=0.0175). 耳蜗底部（A，C左，D，E），耳蜗中部（B，C右）。A.U.，任意单位。比例尺：10µm（A、C左、D）；5µm（B，C右侧，E）。

与CRB3-MPP5不同，MPDZ在HCs中的分布不包括顶端连接，但MPDZ的丢失可能通过破坏紧密连接部分破坏室管膜和脉络丛细胞的屏障完整性(Feldner等人，2017年;Yang等人，2019). 为了研究这一可能的悖论，我们在野生型小鼠脉络丛（第四脑室）P3和P13-P15免疫标记MPDZ、CRB3和MPP5。有趣的是，我们发现，与听觉上皮一样，MPDZ在脉络丛上皮细胞的ZO1阳性细胞连接处缺失，但在连接处附近的顶膜上发现(图S4A、D、H). 相反，MPP5除了在心尖膜外，在心尖连接处也能清楚地检测到，就像HCs一样(图S4B、E). CRB3信号较低，但似乎在两个阶段都覆盖了根尖膜，P13处的根尖连接处(图S4C、F). 未检测到INADL(图S4G). 我们的结论是，在听觉和脉络丛上皮细胞中，CRB3-MPP5-MPDZ代表一种Crumbs复合物，专门定位于顶膜。在这两种细胞类型中，MPP5和CRB3也占据顶端连接，可能与其他伴侣占据。

MPDZ将MPP5和CRB3锚定在毛细胞顶点

MPDZ被认为是携带PDZ结合域的伴侣蛋白的锚定蛋白，MPDZ和MPP5被认为直接相互作用(Adachi等人，2009年;Assemat等人，2013年). 我们想知道，除了GNAI-GPSM2之外，失去MPDZ是否会扰乱Crumbs复杂合作伙伴(图2)和aPKC(图3). 在P0，MPP5在姆帕兹突变体，在发束中发现(图4D、 E，实心箭头）。测量裸区和发束之间的MPP5强度比证实了在姆帕兹突变体(图4F） ●●●●。相反，MPP5仍在HC交界处富集姆帕兹突变体(图4D、 E，未填充箭头），与交叉处缺少MPDZ一致(图4B） ●●●●。测量MPP5连接信号显示姆普兹突变体(图4G） 然而，这表明心尖膜和连接处不同的MPP5复合物相互影响。连接完整性在姆帕兹突变体，尤其是HCs和支持细胞在听觉器官中的精确嵌入不受影响(图S5A). 与MPP5一样，我们观察到CRB3在裸区丢失，而在P0的毛发束中发现姆帕兹突变体(图S5B、C). 正如预期的，INADL定位于支持细胞连接处，在姆普兹突变HCs(图S5D).

正如我们观察到MPP5和CRB3在早期（P0）比GNAI-GPSM2和aPKC在姆帕兹突变体，我们得出结论，MPDZ直接需要将其Crumbs复合物伙伴MPP5-CRB3锚定在HC顶膜上。反过来，平顶膜上Crumbs复合体的丢失破坏了GNAI-GPSM2和aPKC的极化和分离。P0处已观察到发束缺陷(图1C、 D）可能由CRB3-MPP5在静纤毛中的异常定位引起。

GNAI-GPSM2和MPDZ-MPP5在毛细胞顶膜上相互影响

MPDZ需要保持GNAI-GPSM2在P4根尖膜的侧向极化(图2)与中间HC表面相比，CRB3-MPP5-MPDZ在裸区富集程度更高(图1A和​和4A-C）。4A-C）。因此，我们推断，GNAI-GPSM2可能反过来影响MPDZ和MPP5的分布。为了测试这个预测，我们分析了一个本构关系每平方加仑突变体(每平方加仑^DEL公司) (Tarchini等人，2013年)我们通过表达百日咳毒素的催化亚单位（PTXa），在全球范围内下调HCs中的GNAI活性阿托1克里(Tarchini等人，2016年). 在P4，每平方加仑突变HCs在裸露区失去了对MPDZ的优先富集(图5A） ●●●●。测量发束内侧与外侧的信号强度之比证实，GPSM2缺失后，MPDZ在顶面上的分布更加均匀(图5B） ●●●●。然而，令人惊讶的是，这些量化结果还表明，MPDZ信号强度在每平方加仑突变体，只是内侧更剧烈(图5C） ●●●●。

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图5。

GNAI-GPSM2促进MPDZ和MPP5在心尖膜的平面极化。（A） MPDZ标记（洋红色）在P4（耳蜗尖）。在没有GPSM2的情况下，MPDZ在侧面裸露区缺乏较高的富集度。（B，C）MPDZ在P4（耳蜗尖）HCs中富集。绘制了内侧和外侧（裸区）MPDZ信号（B）以及裸区（C，顶部）和内侧顶点（C，底部）的单个信号之间的比率。注意MPDZ信号如何在两个隔室中增加每平方加仑突变体，但在内侧顶点更强烈。对于所有图形：姆帕兹^DEL公司/+N个=3,n个=13 IHC，n个=52欧姆；姆帕兹^{交付/交付}N个=3,n个=18 IHC，n个=62 OHC（曼·惠特尼U型-测试；（B） 国际控股公司：**P（P）=0.0014，OHC：****P（P）<0.0001; （C） 横向IHC：**P（P）=0.0064，横向OHC：****P（P）<0.0001; 内侧IHC和OHC：****P（P）<0.0001). （D） 百日咳毒素（PTXa）表达HCs中MPDZ标记（品红色）位于P4（耳蜗尖）。当GNAI被PTXa灭活时，MPDZ在裸区缺乏较高的富集度。GNAI失活会引起分级OHC定向错误，因此PTXa OHC中的裸区区域（箭头）并不总是横向的。（E，F）MPP5标签（品红色）英寸千磅/平方米^{德尔/德尔}（E） 和PTXa（F）HCs位于P4（耳蜗尖）。与MPDZ（A-D）一样，当GPSM2或GNAI失活时，MPP5在顶膜上的富集更加均匀。在E中，用afadin（AFDN）代替ZO1标记顶端连接。比例尺：10µm。

我们还观察到，在P4表达PTX的HCs中，MPDZ在HC顶点的分布更加均匀(图5D） ●●●●。值得注意的是，PTXa在OHC定向方面引发严重缺陷(Kindt等人，2021年;Tarchini等人，2013年,2016)因此，裸区不再系统地位于听觉上皮的外侧。接下来我们将免疫标记MPP5每平方加仑和PTXa突变体，因为MPP5结合(Adachi等人，2009年;Assemat等人，2013年)并在HC表面与MPDZ共定位。与MPDZ一样，年废除了裸露区的优先MPP5富集每平方加仑(图5E） 和PTXa(图5F） P4突变HCs。最后，CRB3在HC顶膜的富集在每平方加仑突变体，CRB3也向裸露区失去极化(图S6). 总之，我们的结果表明，CRB3-MPP5-MPDZ和GNAI-GPSM2之间的相互作用确保在裸区维持适当数量的每个蛋白复合物。在没有GPSM2的情况下，发束两侧MPDZ的富集增加可能表明GNAI-GPSM2在某种程度上限制了允许占据顶膜的MPDZ总量。

免疫荧光和抗体

对于胚胎期和新生儿期，分离颞骨，在4%多聚甲醛（PFA）中4°C下固定1小时之前，立即进行显微解剖以暴露感觉上皮，或者在解剖之前在10%三氯乙酸（TCA）中冰上培养10分钟，具体取决于使用的抗体（如下所示）。在用PBS冲洗后，去除顶盖膜，在应用初级抗体之前，用0.5%Triton X-100和1%牛血清白蛋白在室温下封闭样品并在PBS中渗透至少1小时。对于CRB3标记，我们使用了以下抗原回收程序：出生后内耳在4%PFA中于室温下进行显微解剖前固定1小时。然后按照上述方法暴露、封闭和渗透听觉上皮20分钟，然后在50°C下在0.8M尿素中孵育1小时，然后在65°C下孵育20分钟。

对于P7后的出生后阶段，分离颞骨，在4°C或室温下，在4%PFA中浸泡固定1小时之前，在耳蜗尖端穿刺以便于接触固定剂。用PBS冲洗后，在室温下将颞骨在0.11M EDTA中孵育过夜，用于脱钙，然后剥离以暴露听觉上皮。然后按照与早期阶段相同的方案对样品进行封闭和渗透。

在P3、P13或P15处解剖后脑（第四脑室）脉络丛，并在4°C下在4%PFA中固定1h。用PBS冲洗后，在应用初级抗体之前，样品被封闭并在室温下用0.5%Triton X-100和1%牛血清白蛋白在PBS中渗透至少1小时。

一级和二级抗体分别在4°C的PBS中孵育过夜。荧光染料结合的卵磷脂与二级抗体一起添加。每次抗体孵育后，样品用PBS+0.05%Triton X-100清洗三次，然后在室温下在4%PFA中最终固定1小时。然后将样品平放在显微镜载玻片上（Denville，M1021），直接放在18×18 mm#1.5盖玻片（VWR 48366-045）（耳蜗）下，或使用办公胶带作为间隔物（脉络丛）。使用Moviol作为安装介质（Calbiochem/MilliporeSigma，4759041）。在25%（w/v）甘油和0.1 M Tris-HCl（pH 8.5）中制备莫维醇。

使用的主要抗体为：兔抗MPDZ(Poliak等人，2002年)（来自魏茨曼科学研究所埃利奥·贝利斯的礼物；PFA）；兔抗CRB3(Szymaniak等人，2015年)（波士顿大学鲍勃·瓦雷拉斯赠送；PFA）；兔抗TRIOBP/TARA（Proteintech，16124-1-AP；PFA）；兔抗GNAI1/2/3（Santa Cruz Biotechnology，sc-262；PFA；我们实验室的结果表明，该试剂对单个GNAI paralog没有特异性，并且至少GNAI2和GNAI3在毛细胞中顶部共定位，因此我们使用“GNAI”表示获得的信号）；兔抗GPSM2（Sigma-Aldrich，{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“A41537”，“term_id”：“105868”，“term_text”：“pir||A41537“}}A41537型; PFA）；小鼠抗aPKC/PRKCZ（Santa Cruz Biotechnology，sc-216；PFA）；绵羊抗AFDN/AF-6（研发系统，AF7829；PFA）；大鼠抗ZO1（发育研究杂交瘤库，R26.4C；TCA或PFA）；兔抗MPP5（Santa Cruz Biotechnology，sc-33831；PFA）；兔抗INADL（LifeSpan BioSciences，LS-C410011-50；TCA）；兔抗MYO6（变形杆菌生物科学，25-6791；PFA）；小鼠抗乙酰化微管蛋白（Santa Cruz Biotechnology，23950；PFA）。在山羊或驴身上培养出二级抗体，并与Alexa Fluor（AF）488、555或647偶联[赛默飞世尔科技公司，驴抗兔488（A-21206）、555（A-31572）、647（A-3157）、驴抗鼠555（A-31570）、646（A-31171）、驴防羊647（A-21448），驴抗鼠488（A-21208）]。我们使用荧光共轭的类生殖器肽来揭示F-actin（Thermo Fisher Scientific，AF 488，A12379；Biotium，CF405，89138-126）。

FM 1-43染料摄取

在PBS中分离P4内耳并进行显微解剖以暴露感觉上皮。取下侧壁，小心地将感觉上皮从蜗牛上取下，并在先前涂有聚-D-赖氨酸（10µg/ml）的玻片上滴入一滴DMEM-F12。用1×HBSS（无钙或镁）冲洗外植体。然后将外植体培养在冷冻的FM 1-43中，在HBSS（最终浓度5µM）中稀释10 s，然后在HBSS中冲洗6次。然后将移植体装入HBSS（含HEPES、钙和镁）并立即成像。

图像采集和量化

使用LSM800线扫描共焦显微镜（使用Zen2.3或Zen 2.6软件）、常规共焦模式下的Airyscan探测器和63×1.4 NA油物镜（卡尔蔡司公司）拍摄图像。使用DM5500B荧光显微镜，使用Leica Application Suite X（LAS X）和40×空气物镜（Leica）捕获FM 1-43信号。除非图例中另有说明，否则所有图像均显示单个光学平面。使用Adobe Photoshop（CC 2020）对图像进行处理，并在同一实验中对不同基因型或条件进行相同的图像处理。在所有实验中，量化包括每个基因型至少三只动物。研究中绘制的所有实验值，以及动物队列大小和毛细胞数量，详见表S2其中每个表格报告一个实验。所有动物(N个)和细胞(n个)分析的数字也显示在图例中。所有三个OHC行的结果被汇总，因为我们没有观察到特定行的趋势。

测量毛细胞顶端表面积和毛细胞顶端周长的圆度(图1F、 G），z（z）-每个样品的底部或顶部都有一系列堆叠z（z）根据交界ZO1信号选择切片。使用斐济/ImageJ追踪毛细胞的ZO1阳性轮廓，并测量表面积和圆度。表面积单位为µm²圆度是介于0和1之间的值，其中1是一个完美的圆。为了测量免疫标记信号强度，选择显微镜视野，将毛细胞尽可能平放，以避免伪影。Z-使用相同的激光强度和增益，在耳蜗基底部对所有样本（突变和对照同窝）和单个样本（z（z）选择信号最强的切片/光学平面。用ZO1或AFDN标记顶毛细胞连接，用静纤毛束基底（指骨样蛋白）区分顶膜裸露区（外侧）和内侧。斐济/ImageJ用于测量感兴趣区域（ROI）的平均灰度值，定义如下。对于每个图像，对背景信号进行采样并求平均值，然后从同一图像上的所有毛细胞数量中减去。

测量GNAI信号强度姆帕兹突变体(图2D） 外侧（裸区）和内侧隔被分成三个等宽的ROI（裸区为a、b、c，内侧为D、e、f，见图2D） ，并测量每个区域的平均灰度值。获取整个裸露区域和内侧隔间的平均灰度值(图2B） ，对三个ROI中的值进行平均。测量aPKC(图3B） 和MPP5(图4F） 信号输入姆普兹突变体，定位一个固定的ROI，覆盖约50%的心尖隔室（裸区、内侧心尖、发束）。测量接合处的MPP5强度(图4G） ，0.15µm的矩形ROI²（1.5×0.1µm）位于内侧毛细胞交界处。测量MPDZ强度单位平方英寸突变体(图5B、 C），圆形ROI为1.054µm²位于外侧（裸区）和内侧根尖室。

扫描电镜

将颞骨从颅骨中分离出来，在耳蜗尖穿刺一个孔，并将样品在4°C的2.5%戊二醛+4%PFA（电子显微镜科学）中浸泡在1 mM MgCl中至少过夜来固定₂，0.1 M二碳酸钠，20 mM氯化钙₂缓冲区。在PBS中冲洗后，用0.11 M EDTA将样品脱钙过夜，并将听觉上皮切割成三块（耳蜗底部、中部和顶部）。在乙醇系列中逐步脱水解剖样品（30-50-70-80-90-100%，每次至少20分钟）。使用六甲基二硅氮烷（HMDS；电子显微镜科学，50-243-18）进行化学样品干燥。然后，使用双面碳胶带将干燥样品安装在铝短棒上，并在日立3000N VP电子显微镜上成像之前，用金钯溅射涂层。图像是在20千伏电压下用5倍放大镜拍摄的。

ABR测试

通过腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪混合物（每10 g体重分别为10 mg和0.1 mg）对小鼠进行麻醉，并使用加热垫（FHC）将体温保持在37°C。所有测试均在消声室中进行。使用与RA4PA 4通道美杜莎放大器（Tucker-Davis技术；TDT系统）耦合的RZ6多输入/输出处理器系统进行ABR测试。使用TDT系统产生8、16、32和40 kHz的音频脉冲，使用皮下针作为电极，将活性电极插入颅骨顶点，参考电极插入左耳下方，接地电极插入右大腿。通过将声压级（SPL）在90至20 dB之间降低5 dB，以确定在哪个声压级下可以识别ABR，从而获得每个刺激的听觉阈值。姆帕兹^{德尔/德尔}突变体和姆帕兹^DEL公司/+在P21至P24岁之间对对照窝友进行测试。测试了两种性别（参见表S2)因为性别对阈值没有影响，所以性别被纳入图6E.公司。

我们非常感谢Elior Peles博士（魏茨曼科学研究所）分享MPDZ抗体，感谢Xaralabos Varelas博士（波士顿大学）分享CRB3抗体。Mpdz小鼠模型由杰克逊实验室的Steve Murray领导的KOMP项目制作，并由Patsy Nishina小组共享。