单元格代表。2021年5月11日;35(6): 109101.
染色质可及性控制癌症和T细胞对精氨酸饥饿的不同反应
,1,8 ,2,8 ,2,8 ,三 ,2 ,2 ,2 ,4 ,1 ,1 ,5 ,6 ,1 ,2 ,2 ,2 ,2 ,6 ,7 ,1 ,三 ,1,9,10,∗和2,9,11
尼古拉斯·T·克拉姆
1英国牛津大学拉德克利夫医学系血液学主题NIHR牛津生物医学研究中心MRC Weatherall分子医学研究所MRC分子血液学组
安德烈亚斯·哈季尼科劳
2英国牛津OX3 9DS牛津大学MRC Weatherall分子医学研究所MRC人类免疫学单元
蒙霞
2英国牛津OX3 9DS牛津大学MRC Weatherall分子医学研究所MRC人类免疫学单元
约翰·沃尔斯比挠痒痒
三英国牛津大学化学系化学研究实验室OX1 3TA
乌齐·吉莱迪
2英国牛津OX3 9DS牛津大学MRC Weatherall分子医学研究所MRC人类免疫学单元
陈继立(Ji-Li Chen)
2英国牛津OX3 9DS牛津大学MRC Weatherall分子医学研究所MRC人类免疫学单元
Mashiko Setshedi公司
2英国牛津OX3 9DS牛津大学MRC Weatherall分子医学研究所MRC人类免疫学单元
拉尔斯·奥尔森
4丹麦林格比丹麦技术大学DTU健康技术生物信息科
刘一军(I-Jun Lau)
1英国牛津大学拉德克利夫医学系血液学主题NIHR牛津生物医学研究中心MRC Weatherall分子医学研究所MRC分子血液学组
劳拉·戈弗雷
1英国牛津大学拉德克利夫医学系血液学主题NIHR牛津生物医学研究中心MRC Weatherall分子医学研究所MRC分子血液学组
林恩·奎克
5英国伦敦SE5 8AF记忆巷SGDP中心伦敦国王学院癌症与药物科学学院
Zhanru余
6英国牛津大学诺菲尔德医学系药物发现中心目标发现研究所,牛津OX3 7FZ
埃里卡·巴拉比奥
1英国牛津大学拉德克利夫医学系血液学主题NIHR牛津生物医学研究中心MRC Weatherall分子医学研究所MRC分子血液学组
迈克·巴恩科布
2英国牛津OX3 9DS牛津大学MRC Weatherall分子医学研究所MRC人类免疫学单元
乔治·纳波利塔尼
2英国牛津OX3 9DS牛津大学MRC Weatherall分子医学研究所MRC人类免疫学单元
马里奥利娜·萨利奥
2英国牛津OX3 9DS牛津大学MRC Weatherall分子医学研究所MRC人类免疫学单元
哈希姆·库伊
2英国牛津OX3 9DS牛津大学MRC Weatherall分子医学研究所MRC人类免疫学单元
贝内迪克特·凯斯勒
6英国牛津大学诺菲尔德医学系药物发现中心目标发现研究所,牛津OX3 7FZ
斯蒂芬-泰勒
7英国牛津大学Radcliffe医学系MRC Weatherall分子医学研究所MRC WIMM计算生物学中心
帕雷什·维亚斯
1英国牛津大学拉德克利夫医学系血液学主题NIHR牛津生物医学研究中心MRC Weatherall分子医学研究所MRC分子血液学组
詹姆斯·斯科·麦库拉
三英国牛津OX1 3TA牛津大学化学系化学研究实验室
托马斯·A·米尔恩
1英国牛津大学拉德克利夫医学系血液学主题NIHR牛津生物医学研究中心MRC Weatherall分子医学研究所MRC分子血液学组
文森佐·塞伦多洛
2英国牛津OX3 9DS牛津大学MRC Weatherall分子医学研究所MRC人类免疫学单元
1英国牛津大学拉德克利夫医学系血液学主题NIHR牛津生物医学研究中心MRC Weatherall分子医学研究所MRC分子血液学组
2英国牛津OX3 9DS牛津大学MRC Weatherall分子医学研究所MRC人类免疫学单元
三英国牛津OX1 3TA牛津大学化学系化学研究实验室
4丹麦林格比丹麦技术大学DTU健康技术生物信息科
5英国伦敦SE5 8AF记忆巷SGDP中心伦敦国王学院癌症与药物科学学院
6英国牛津大学诺菲尔德医学系药物发现中心目标发现研究所,牛津OX3 7FZ
7英国牛津大学Radcliffe医学系MRC Weatherall分子医学研究所MRC WIMM计算生物学中心
8这些作者的贡献相等
9高级作者
10引线触点
11已故的
收到日期:2020年6月15日;2021年3月1日修订;2021年4月16日验收。
这是一篇CC BY许可下的开放存取文章(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
结果
AML细胞而非T细胞使用瓜氨酸作为替代精氨酸来源
为了模拟T细胞对精氨酸限制的反应,我们刺激了原代人CD4+T细胞并监测完全(+Arg,~1 mM精氨酸)或无精氨酸(−Arg)RPMI 1640的生长。在精氨酸饥饿状态下未观察到细胞增殖,添加精氨酸前体瓜氨酸也无法挽救细胞增殖(A) ●●●●。细胞对刺激作出反应,因为CD25是一种晚期T细胞激活标记物,在−Arg培养基刺激的T细胞中上调(图S1A) ●●●●。然而,细胞表面CD3共受体水平和干扰素-γ(IFNγ)表达降低(Munder等人。,2006;罗德里格斯等人。,2002;Zea等人。,2004)指示未完成激活(图S1B和S1C)。无法使用瓜氨酸促进生长是人类CD4的一个普遍特征+T细胞,就像我们在孤立的原始、中央记忆(Tcm)和效应记忆(Tem)T细胞中看到的一样(A、 对,以及S1(第一阶段)D) ●●●●。AML患者的血浆精氨酸水平有时较低,但不为零(Mussai等人。,2015;Mussai等人。,2019). 与其他工作相比(沃纳等人。,2017)我们发现,无论是否存在瓜氨酸,低(20μM)精氨酸都不能恢复T细胞的显著生长(图S1E和S1F),表明低和−Arg水平都具有免疫抑制作用。
T细胞和THP1细胞对精氨酸饥饿表现出不同的反应
(A) 左图:受刺激CD4的生长+在含有(−Arg+Citr)或不含(−Arg)瓜氨酸的完整(+Arg)或无精氨酸培养基中培养的人T细胞。数据表示为平均值±SD;n=4。右:原始、中央记忆(Tcm)和效应记忆(Tem)T细胞(请参见图S1D代表分类策略),然后在指定的培养基中培养96小时并计数。数据是0小时时细胞数的倍数增加;平均值±SD;n=2。
(B) THP1细胞在指定培养基中的生长。数据表示为平均值±SD;n=4。
(C) 健康(对照)患者血浆和AML患者血浆或骨髓中瓜氨酸的浓度。中心栏显示平均值±SD。∗∗∗∗p<0.0001(未配对t检验)。
(D) 在+Arg或−Arg培养基中培养72小时的THP1或刺激T细胞中mRNA的微阵列分析。每个柱代表一个复制。指示了基因的类别分配(I–VI)。
(E) T细胞和THP1细胞中差异表达基因的重叠,显示类别分配(I–VI)。
(F) 精氨酸饥饿后各类差异表达基因中KEGG途径富集分析,如(D)所示。点大小与显著性成正比(Wallenius方法)。
另请参见图S1和表S1和S2系列。
部分AML患者血清精氨酸降低(Mussai等人。,2015,2019)这表明,与T细胞不同,AML肿瘤细胞可以耐受这种环境。为了了解这种差异背后的机制,我们使用了AML细胞系THP1。虽然THP1细胞不能在缺乏精氨酸的培养基中生长,但补充瓜氨酸可以挽救细胞的增殖(B) 这表明它可以作为替代精氨酸来源。这是通过在用重组人ARG2处理的+Arg培养基中孵育THP1细胞来概括的(图S1G) 模拟AML患者的血浆状况(Mussai等人。,2013). 测试瓜氨酸的可用性体内,我们测量了AML患者血浆中的水平,发现与健康献血者相比显著升高(C) ,浓度足以使精氨酸保护的THP1细胞生长在体外(图S1H) ●●●●。这表明,这些AML患者血浆中的瓜氨酸可以使癌细胞合成精氨酸,但不能使T细胞合成精氨酸。
精氨酸饥饿导致大规模转录变化
为了了解精氨酸饥饿的反应,我们分析了在+Arg或−Arg培养基中培养的受刺激T细胞和THP1细胞的转录谱(表S1). 我们鉴定了5445个精氨酸饥饿反应的差异表达基因(D) 其中875个在THP1和T细胞中反应相似,4454个仅在一种细胞类型中反应(E和S1(第一阶段)一) ●●●●。T细胞(4577)的差异表达量比THP1细胞(1627)大得多,表明精氨酸损失的反应更强。5329个基因分为六类:在两种细胞类型中上调或下调(分别为I和II;D和1E)、仅THP1细胞(III和IV)或仅T细胞(V和VI)。THP1和T细胞(II类;F) ,符合生长抑制(A和1B)。T细胞受体信号通路基因在T细胞(VI类;F和S1(第一阶段)J;表S2),与−Arg细胞中激活标记的丢失相匹配(图S1B和S1C)。
精氨酸的细胞内可用性取决于氨基酸转运蛋白和/或从头开始瓜氨酸和其他尿素循环前体的合成(A) 这表明肿瘤和T细胞行为之间的差异可能反映了这些过程中的差异。精氨酸转运体基因SLC7A1型(类别1)(Closs等人。,2004)THP1和T细胞上调(B、,S2系列A、 和S2B),认为差异不是由于无法进口精氨酸。SLC1A5(ASCT2)和SLC7A5(LAT1)是中性氨基酸转运蛋白,后者与瓜氨酸摄取有关(沃纳等人。,2017). 为了验证这一点,我们分别用SLC1A5和SLC7A5抑制剂GPNA和BCH处理THP1细胞(克里斯滕森,1990年;Esslinger等人。,2005;Kim等人。,2002). 每种转运蛋白都会导致瓜氨酸依赖性生长的适度减少,并通过联合治疗而增强,这表明这两种转运蛋白对瓜氨酸摄取都很重要(图S2C) ●●●●。质谱分析证实THP1细胞可以吸收细胞外瓜氨酸并生成细胞内精氨酸从头开始(图S2D) ●●●●。SLC7A5型与精氨酸饥饿的T细胞相比,THP1细胞中倾向于更强地上调(B和S2系列A) ●●●●。然而,这三种转运体在T细胞激活时均上调(图S2B) ,精氨酸保护的THP1和T细胞的表达水平具有可比性(图S2A) 这表明转运蛋白的可用性可能无法解释差异反应。
ATF4诱导的ASS1系统上调促进THP1细胞的瓜氨酸依赖性生长
(A) 精氨酸吸收和生物合成中的关键蛋白质。
(B) 基于微阵列分析显示基因表达变化的森林图(参见D) ●●●●。水平条显示四分位范围。
(C)ASS1系统和自动变速箱4健康供体原发性AML母细胞或非转化单核细胞和髓细胞中的表达(Quek等人。,2016). 样品由捐赠者着色。条形图显示平均值±SD。∗∗p<0.01,∗∗∗p<0.001(Mann-Whitney检验)。
(D) 在完全培养基(+)、含有20μM精氨酸(低)或缺乏精氨酸的培养基(-)中培养72 h的受刺激T细胞和THP1细胞中ASS1和ATF4的Western blot。为了清晰起见,显示了ASS1斑点的两次曝光。五个重复的代表。
(E) (D)的定量,标准化为GAPDH,相对于+Arg T细胞。为了清晰起见,T细胞中的表达以较小的比例显示。数据表示为平均值±SEM;n=5。∗p<0.05,∗∗p<0.01,∗∗∗p<0.001(Dunnett多重比较试验)。ns,不显著。
(F) 对照(NT)THP1细胞生长或KD后ASS1系统或自动变速箱4在所指示的媒体中。数据表示为平均值±SD;n=4。
(G) 对照(NT)THP1细胞或KD后ASS1和ATF4的代表性western blotASS1系统或自动变速箱4在有(+)和无(−)精氨酸的情况下维持72小时。右:定量,相对于+Arg NT细胞归一化为GAPDH。数据表示为平均值±SEM;n=3。∗p<0.05(Dunnett多重比较试验)。
(H) CTV标记的CD8+T细胞用GFP公司-ASS1系统共表达质粒。96小时后,在指定的培养基中分析细胞的GFP和CTV水平。显示了三个技术副本。
(一) (H)分析中GFP阳性细胞的比例,归一化为−Arg比率。数据表示为平均值±SD;n=5来自两个捐赠者。∗∗p<0.01(配对t检验)。
另请参见图S2。
ASS1表达驱动THP1细胞对精氨酸饥饿的耐受性
THP1细胞而非T细胞上调参与精氨酸生物合成的基因(F) ,这可能允许饥饿耐受。在尿素循环基因中,ASS1系统,调节通路的速率限制步骤(Haines等人。,2011),显示精氨酸饥饿后THP1细胞的RNA水平显著增加,但T细胞的RNA水平没有增加(B和S2系列E) 这表明在缺乏精氨酸的情况下,它在促进生长方面起着关键作用。AML患者RNA测序(RNA-seq)数据(Quek等人。,2016)也显示升高ASS1系统表达式(C) ●●●●。的级别ASS1系统精氨酸保护的THP1细胞的蛋白质也增加了,但T细胞的蛋白质没有增加,因为T细胞的基础水平已经很低(D和2E)。与以前的报告类似(沃纳等人。,2017),我们观察到ASS1系统在低精氨酸条件下,大量T细胞以及分离的原始、Tcm和Tem细胞中(D、 2E、,S2系列E、 和S2F)。
ASS1系统敲除(KD)强烈干扰THP1细胞利用瓜氨酸进行生长的能力(F和2G),证明其在精氨酸饥饿反应中的关键作用。由于无法表达ASS1系统似乎可以解释缺乏瓜氨酸驱动的T细胞生长,我们询问是否可以通过外源性ASS1系统表达。的确,刺激CD8的转导+带有ASS1系统-GFP公司利用瓜氨酸作为另一种精氨酸来源,质粒使GFP阳性而非非转导GFP阴性细胞生长(H和2I)。这与最近的工作一致,表明ASS1系统-表达CAR-T细胞在靶向肿瘤细胞方面更有效体内(Fultang等人。,2020)提出了一种潜在的治疗策略,以挽救精氨酸缺乏患者的T细胞生长。
ASS1系统转录是由ATF4结合的增强子诱导的
THP1细胞(III类)上调基因的TF结合位点分析;D) ATF4基序的显示丰富性(图S2G) ●●●●。两者都有ATF4型及其约束伙伴CEBPB公司(Ameri和Harris,2008年;Vinson等人。,1993)精氨酸保护的THP1细胞上调(B) 、和自动变速箱4在初级爆破中上调密码1-表达AML患者(C) ●●●●。ATF4蛋白在THP1和T细胞中均被强烈诱导(D和2E)对精氨酸限制的反应(Harding等人。,2000;Lu等人。,2004;Vattem和Wek,2004年).自动变速箱4KD废除了这两项ASS1系统THP1细胞的表达和瓜氨酸依赖性生长(F和2G),涉及ATF4ASS1系统归纳。重要的是,观察到ATF4在T细胞中也上调,但没有诱导ASS1系统(D和2E),表明其激活靶基因的能力在T细胞中受到限制。
测试ATF4是否直接激活ASS1系统,我们进行了参考正常染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)(Orlando等人。,2014)用于+Arg、低精氨酸或−Arg培养基中THP1和T细胞中的ATF4和CEBPβ。ATF4和CEBPβ结合ASS1系统在THP1细胞的第一个内含子内(A) 与ATF4/CEBPβ基序相关(图S3A) ●●●●。In−Arg T细胞,其中ASS1系统未表达,仅观察到低水平的ATF4和CEBPβ结合(A和第3章B) 。相反,ATF4和CEBPβ都结合在SLC7A1型在T细胞和THP1细胞中处于可比水平(B和第3章B) 。这与SLC7A1型,但不是ASS1系统,在精氨酸保护的T细胞中(B) 并建议额外的控制层调节ATF4在ASS1系统。
ATF4激活ASS1系统通过内含子增强子转录
(A) ATF4和CEBPβ的参考标准化ChIP-seqASS1系统刺激T细胞和THP1细胞在指定培养基中孵育72小时,以及H3K4me3、H3K27ac和H3K4me1的ChIP-seq在+Arg培养基中培养(Godfrey等人。,2019). 灰色条显示qPCR引物的位置。
(B) ATF4和CEBPβ的参考标准化ChIP-seqSLC7A1型,如(A)所示。
(C) 亲本(野生型[WT])和突变THP1细胞中增强子区域的序列。PAM序列下划线。
(D) 在+Arg或−Arg培养基中培养72 h,对WT和突变THP1细胞中的ATF4和H3K27ac进行ChIP-qPCR。数据表示为平均值±SEM;n=3。
(E) WT和突变THP1细胞中ASS1和ATF4的Western blot,在+Arg或−Arg培养基中培养72小时。三个重复的代表。
(F) WT和突变THP1细胞的生长,在指定的培养基中培养。数据表示为平均值±SD;n=3。
另请参见图S3。
ATF4结合位点位于ASS1系统以H3K4me1和H3K27乙酰化(H3K27ac;A) 在THP1细胞中,这表明它可能是密码1CRISPR-Cas9介导THP1细胞中该区域的缺失(C和第3章C) 破坏ATF4和CEBPβ结合,特别是在ASS1系统增强子,并在启动子和内含子处强烈还原H3K27acASS1系统,但不在SLC7A1型(D和第3章D) ●●●●。突变克隆不能诱导ASS1系统表达式(E、,第3章E、 和S3F)或使用瓜氨酸代替精氨酸进行生长(F和第3章G) ●●●●。根据以下结果拍摄自动变速箱4KD(分子量)(G) ,这有力地证明ATF4/CEBPβ结合位点ASS1系统作为基因的增强子。
ASS1系统在T细胞中被抑制
在低精氨酸条件下的T细胞中,ATF4与ASS1系统增强子但CEBPβ结合低于THP1细胞(A和第3章B) ,这不会强烈激活ASS1系统表达式(D和2E)。我们问什么可以监管ASS1系统T细胞中ATF4/CEBPβ的表达和结合。ASS1系统精氨酸营养缺陷性肿瘤中的DNA甲基化通常被抑制(Miraki-Moud等人。,2015;Nicholson等人。,2009;Syed等人。,2013). 然而ASS1系统启动子和增强子要么在THP1和T细胞中几乎完全非甲基化,要么在细胞类型或条件之间没有明显差异(图S4A) ●●●●。因此,DNA甲基化不太可能调节ATF4/CEBPβ结合或ASS1系统T细胞中的表达。
我们使用高通量测序(ATAC-seq)检测转座酶可及染色质,以了解THP1和T细胞在ASS1系统与染色质可及性相关。THP1细胞在启动子和增强子上都显示出可接近的区域(A) ●●●●。峰值出现在+Arg培养基中的细胞中,其中ATF4结合相对较弱ASS1系统表达,表明可及性先于TF结合和转录。在T细胞中ASS1系统三种处理(+Arg、low Arg和−Arg;B) ,这可能解释了在低精氨酸条件下,当ATF4结合(A) ●●●●。在精氨酸饥饿条件下,启动子和增强子都显示出轻微的致密性(B) ,表明可及性降低可能阻断ATF4的结合。相反SLC7A1型在THP1和T细胞中,在所有三种精氨酸条件下都可以获得(图S4B) 与ATF4/CEBPβ结合诱导两种细胞类型的转录一致。
ASS1系统在T细胞中被抑制
(A) ATAC-seq网址:ASS1系统在所示培养基中培养72小时的THP1细胞中,显示来自−Arg细胞的ATF4 ChIP-seq以进行比较。底部:ATAC-seq记录道叠加在突出显示的区域ASS1系统,三个重复的平均值。
(B) ATAC-seq网址:ASS1系统在受刺激的T细胞中,如(A)。
(C) 刺激T细胞和在指定培养基中培养72小时的THP1细胞中H3K9me3、H3K27me3和H3K4me3的ChIP-qPCR数据表示为平均值±SEM;n=4。
(D) 在完全培养基(+Arg)、含有20μM精氨酸、没有(低Arg)或(低Arg+2HG)添加500μM 2HG或缺乏精氨酸(−Arg)的培养基中培养72小时的受刺激T细胞中,对H3K9me3、H3K27me3和ATF4进行ChIP-qPCR。数据表示为平均值±SEM;n=4。
(E) ASS1和ATF4在所示培养基中培养72小时的受刺激T细胞中的代表性western blot。非特异性条带用星号表示。右:量化,根据GAPDH标准化,相对于+Arg。数据表示为平均值±SEM;n=5。**p<0.01,∗∗∗∗p<0.0001(Dunnett多重比较试验)。
(F) 的模型ASS1系统精氨酸耗竭对T细胞和THP1细胞的调节。THP1单元内的可访问性ASS1系统允许ATF4在低和−Arg条件下结合,诱导ASS1系统表达。在T细胞中,ATF4结合和ASS1系统表达由两个相互竞争的过程调节:ATF4在低Arg或−Arg条件下是活性的,但ASS1系统启动子被抑制。在−Arg下,H3K9me3/H3K27me3升高ASS1系统阻止ATF4绑定。
另请参见图S4。
了解导致差异的原因ASS1系统表达、染色质可及性和TF结合,我们寻找抑制性组蛋白修饰的存在。基因启动子和增强子的H3K9me3和H3K27me3水平ASS1系统在T细胞中明显高于THP1,与抑制的水平相匹配HOXC8型基因,在SLC7A1型(C) ●●●●。相反,H3K4me3是活跃和稳定基因的标志,在ASS1系统T细胞启动子与THP1的比较(C) ●●●●。这表明H3K9me3/H3K27me3在ASS1系统可以解释ATF4/CEBPβ不能强烈诱导T细胞表达。
除了高基础水平的H3K9me3和H3K27me3外ASS1系统在T细胞中,精氨酸饥饿导致甲基化显著增加(C) ●●●●。我们询问这是否在限制ATF4结合和ASS1系统用去甲基化酶抑制剂2-羟基戊二酸(2HG)人工诱导甲基化表达(Chowdhury等人。,2011;Xu等人。,2011). 在低精氨酸条件下用2HG处理T细胞,H3K9me3和H3K27me3明显增加,与精氨酸饥饿的效果相当(D) ●●●●。引人注目的是,2HG治疗在ASS1系统,模拟−Arg条件(D) ●●●●。ASS1系统表达下调至接近精氨酸保护水平(E和S4系列C) ●●●●。综上所述,这表明在低精氨酸条件下T细胞中ATF4结合不能强烈上调ASS1系统由于H3K9me3/H3K27me3的高基础水平和较差的可及性而表达。在精氨酸保护的T细胞中,抑制性组蛋白修饰水平升高会破坏ATF4在ASS1系统和沉默转录(F) ●●●●。
CD8中2HG上调+缺氧条件下的T细胞,增加H3K27me3(Tyrakis等人。,2016). 我们询问精氨酸饥饿是否通过类似机制导致H3K9me3/H3K27me3升高。然而,我们发现在+Arg或−Arg培养基中刺激的T细胞之间的2HG水平没有显著差异(图S4D) 表明不同的过程调节H3K9me3/H3K27me3。
ASS1系统诱导与多肿瘤细胞株对精氨酸饥饿的耐受性相关
我们询问ATF4依赖性ASS1系统使用从液体和固体肿瘤建立的癌细胞系,包括AML(HL60、MOLM-13和OCI-AML3)、急性早幼粒细胞白血病(NB4)、急性淋巴细胞白血病(RS4;11)和前列腺癌(LNCaP)、膀胱癌(RT112)和宫颈癌(HeLa),THP1 AML细胞具有独特的诱导作用,或扩展到其他肿瘤。这些细胞系都使用瓜氨酸代替精氨酸进行增殖(A) ,他们提高了监管水平密码1in−Arg介质(B) 。因此,上调ASS1系统对于从头开始精氨酸合成可能使多种癌症类型在精氨酸饥饿状态下增殖。
ASS1系统上调是一种常见的肿瘤对精氨酸饥饿的反应
(A) 肿瘤细胞系在指定培养基中的生长。急性髓细胞白血病;急性早幼粒细胞白血病;急性淋巴细胞白血病。数据表示为平均值±SD;n=4。
(B) qRT-PCR用于ASS1系统在指定的细胞系中,在+Arg和−Arg培养基中培养。数据标准化为间隙,相对于每个细胞系中的+Arg,表示为平均值±SD;n=4或6(HeLa)。***p<0.001,∗∗∗∗p<0.0001(Šidák的多重比较试验)。
(C) 对照(NT)HeLa细胞或KD后ASS1和ATF4的代表性western blotASS1系统或自动变速箱4在指定的培养基中培养72小时(右)定量,相对于+Arg NT细胞归一化为GAPDH。数据表示为平均值±SEM;n=3。∗p<0.05(Dunnett多重比较试验)。
(D) 对照(NT)HeLa细胞生长或KD后ASS1系统或自动变速箱4,在指定的培养基中培养。数据表示为平均值±SD;n=3。
(E) ChIP-qPCR检测THP1和HeLa细胞在指定培养基中培养72小时后ATF4和CEBPβ水平。数据表示为平均值±SEM;n=3。
(F) HeLa细胞中H3K9me3和H3K27me3在指定培养基中培养72小时后的ChIP-qPCR。数据表示为平均值±SEM;n=3。
另请参见图S5。
我们进一步在HeLa细胞中对此进行了研究,其中ASS1系统和自动变速箱4KD破坏了瓜氨酸依赖性增殖(C和5D)。与此一致,ATF4和CEBPβ都与ASS1系统−Arg HeLa细胞中的增强子(E) 。令人惊讶的是,ATAC-seq在增强子处没有显示染色质可及性的峰值(图S5A) ,尽管标有H3K27ac(图S5A) 组蛋白甲基化被抑制(F) ●●●●。启动子很容易获得(图S5A) ,与强诱导表达的ASS1系统(图S5B) 。综上所述,这些数据表明ATF4驱动的诱导ASS1系统精氨酸饥饿反应并非AML细胞独有。
精氨酸保护T细胞中抑制性染色质限制ATF4/CEBPβ结合全基因组
已证明T细胞的精氨酸饥饿增加抑制性组蛋白甲基化,并破坏ATF4结合ASS1系统,我们问这是否是一种更全球化的行为。我们使用参考标准化ATF4和CEBPβChIP-seq比较不同精氨酸条件下全基因组的结合谱。THP1细胞中ATF4和CEBPβ结合位点的数量明显高于T细胞,表明T细胞通常表现出更严格的结合环境(A) ●●●●。引人注目的是,ATF4结合在−精氨酸T细胞中不太常见,其峰值比低精氨酸T细胞少5倍(A、 2853对14480)。然而,在THP1细胞中没有观察到这种效应,在每种条件下,峰的数量大体相当。+Arg T细胞中ATF4结合较弱(图S6A) 与蛋白质含量低一致(D和2E)。在低精氨酸和−精氨酸T细胞下,ATF4蛋白水平大致相当(D和2E),因此减少了峰值计数(A) 认为精氨酸饥饿会限制T细胞中ATF4的结合,但不会限制THP1细胞中的ATF4结合。
精氨酸缺乏的T细胞显示ATF4/CEBPβ结合和染色质可及性降低
(A) 左:在指定培养基中孵育72小时的受刺激T细胞和THP1细胞的ChIP-seq中识别出的ATF4和CEBPβ峰数。右:在低Arg或−Arg条件下T细胞中识别到的ATF4-ChIP-seq峰重叠。
(B) 在所示培养基中孵育的T细胞和THP1细胞ATF4(左)和CEBPβ(右)的参考正常化ATIP-seq水平达到ATF4峰值(彩色线)。显示T细胞ATF4峰值的平均水平,该峰值仅在低精氨酸条件下、精氨酸饥饿条件下或在这两种条件下(常见)出现,如(A)所示。
(C) 在+Arg和−Arg培养基中培养的受刺激T细胞之间的染色质可及性差异。红点和蓝点表示−Arg下的ATAC峰值显著增加和减少;错误发现率(FDR)<0.05。
(D) T细胞ATF4处的染色质可及性(ATAC-seq)达到峰值,如(B)所示。
(E) 在所示培养基中孵育的T细胞ATAC峰值处的参考正常化ATF4和CEBPβChIP-seq水平。显示精氨酸缺乏T细胞中可及性降低(更封闭)、可及性增加(更开放)或无变化(未受影响)的峰值的平均水平,如(C)所示。
(F) T细胞ATAC峰值的参考正常化H3K27me3 ChIP-seq水平,如(E)所示。
(G) T细胞ATF4峰值处的参考正常化H3K27me3 ChIP-seq水平,如(B)所示。
另请参见图S6。
为了研究精氨酸限制条件下TF结合的差异,我们将ATF4峰分组(A) 基于它们是否仅在低精氨酸或−精氨酸条件下或在这两种条件下(常见)存在于T细胞中,并分析了各组的平均峰高(TF结合量)。低精氨酸T细胞中ATF4和CEBPβ结合在普通和低精氨酸峰均强于−Arg T细胞(B、 上部),与在ASS1系统(A) ●●●●。THP1细胞的情况并非如此,其中ATF4/CEBPβ的结合在每种条件下都是可比较的(B、 下部)。与减少的ATF4峰值数量一起考虑(A) 这进一步证明精氨酸饥饿限制了ATF4和CEBPβ在T细胞的一部分位点的结合,但在THP1细胞中没有。
我们假设TF结合减少可能与染色质可及性降低有关,这意味着精氨酸饥饿下染色质结构的全基因组差异。在+Arg和−Arg培养基中刺激的T细胞的ATAC-seq比较显示出显著差异,−Arg4倍于染色质致密化(C) ●●●●。为了确定可及性降低是否与ATF4/CEBPβ结合缺失相关,我们分析了ATF4结合位点的ATAC-seq水平(D) ●●●●。与维持结合的位点相比,仅在低精氨酸T细胞中ATF4结合位点的可及性要低得多(常见峰值;D) ●●●●。这可能解释了为什么只有在低Arg条件下才会发生粘结,因为即使压实度稍微增加也会使其无法接近。事实上,在−Arg T细胞的这些峰值处,可及性降低,与ATF4结合的丧失相关(D、 橙色与黑色线条)。在常见的ATF4峰值处,可及性也会降低,但其水平仍高于低Arg峰值(D) ●●●●。令人惊讶的是,与其他两个峰值集相比,仅在−Arg条件下绑定的峰值显示出更高的可达性水平。这可能是由于许多峰值出现在发起人处(图S6B) ,通常更容易访问。
互惠分析也获得了类似的结果:在−Arg T细胞中可及性降低的ATAC峰(更封闭)显示ATF4和CEBPβ结合强烈减少,而在未受影响的和更开放的ATAC峰值中结合的减少要小得多(E) 。总的来说,这些结果表明,在低精氨酸条件下,一部分位点被ATF4结合,但这些位点变得致密,在饥饿状态下无法支持结合。
我们使用参考正常化的H3K27me3 ChIP-seq来确定精氨酸饥饿下染色质可及性降低是否与抑制性组蛋白甲基化增加有关,这可以解释ATF4/CEBPβ结合减少的原因。引人注目的是,在精氨酸饥饿条件下,可及性降低的区域(更封闭的ATAC峰)H3K27me3升高,但未受影响和增加的ATAC峰值几乎没有变化(F) ●●●●。仅在低Arg条件下出现的ATF4峰值在饥饿时显示H3K27me3水平增加,而−Arg-only峰值在H3K17me3中没有变化(G) ●●●●。因此,H3K27me3增加、可及性降低和ATF4结合降低之间存在相关性,认为精氨酸饥饿引起的染色质变化可能导致TF结合和基因表达的明显重编程。
精氨酸饥饿破坏与T细胞活化相关的染色质重组
许多研究将T细胞行为的改变与染色质结构的重组联系起来(Bevington等人。,2016;Gray等人。,2017;Philip等人。,2017;Sen等人。,2016). 我们询问在精氨酸饥饿时观察到的可及性差异是否与T细胞无法完全激活有关(图S1B和S1C)。+Arg培养基中的T细胞刺激产生广泛的染色质重塑,在大多数差异峰处可接近性增加(A、 左)。易接近性增加的基因在多种信号通路中富集,包括T细胞受体信号(图S7A) 认为重塑可能在激活中发挥重要作用。
精氨酸饥饿破坏T细胞的染色质和代谢重编程
(A) 在指定培养基中刺激72小时后,T细胞的染色质可及性差异。红色和蓝色圆点表示刺激后ATAC峰显著增加和减少;FDR<0.05。
(B) K-表示在+Arg培养基(见A,左)中刺激后,使用来自未刺激的T细胞(US)和在所示培养基中刺激72小时的T细胞的ATAC-seq,差异ATAC峰的聚类(K=5)。每列是一个样本,每行是一个ATAC峰。
(C) (B)中ATAC-seq数据的主成分分析。每个点代表一个样本;n=3。PC,主要部件。
(D) 非刺激T细胞和T细胞中S6磷酸化(Ser235/Ser236)的代表性western blot,在+Arg、低Arg或−Arg培养基中刺激24小时,或在20 nM雷帕霉素(rapa)存在下刺激+Arg培养液。底部:量化,与GAPDH标准化,相对于未刺激T细胞。数据表示为平均值±SEM;n=4。∗∗p<0.01,∗∗∗∗p<0.0001(Dunnett多重比较试验)。
(E) 在指定培养基中刺激T细胞生长。数据表示为平均值±SD;n=5。
(F) 未刺激T细胞(US)和在指定培养基中刺激72小时的T细胞代谢物水平的层次聚类分析。每列为一个样本,每行为一个代谢物。
(G) (F)中代谢物数据的主成分分析。每个点代表一个样本;n=5。
(H) Seahorse分析未刺激T细胞和在指定培养基中刺激72小时的T细胞。数据是四个供体的平均值±SEM。∗∗p<0.01,∗∗∗p<0.001,***p<0.0001,在所有时间点与+Arg进行比较(Tukey多重比较试验)。
另请参见图S7和表S3。
与这些广泛的变化相比,在缺乏精氨酸的情况下刺激的效果大大降低(A、 右侧)。差异峰的数量低了5倍以上(A、 2453与14144),未刺激T细胞与−Arg T细胞之间的相似性更大(图S7B) 。K-指对+Arg介质中刺激作出响应的峰值可达性聚类(A、 左)将未刺激和−Arg细胞与在低精氨酸和+Arg培养基中刺激的T细胞分开分组(B) 。在该组中,未刺激T细胞和−Arg T细胞分别聚集。主成分分析显示,-Arg T细胞在未刺激T细胞和+Arg T细胞之间具有特征性中间产物(C) ●●●●。这表明精氨酸饥饿刺激的T细胞无法完成向更开放的染色质状态的过渡,并且不能完全激活。
T细胞活化诱导的途径之一是mTORC1信号传导(Powell等人。,2012)mTORC1活性依赖于精氨酸(Bar-Peled和Sabatini,2014年;Chantranupong等人。,2016). 精氨酸饥饿时核糖体蛋白S6磷酸化(mTORC1下游)显著降低(D) ●●●●。mTORC1抑制剂雷帕霉素治疗延迟受刺激T细胞增殖(E) 尽管效果不如精氨酸饥饿时明显。通过ATAC-seq,雷帕霉素刺激的T细胞与激活的T细胞更紧密地聚集在一起,远离未刺激的/−Arg T细胞(图S7C) ●●●●。因此,在缺乏精氨酸的情况下无法重塑染色质不仅仅是由于mTORC1信号的丢失,这表明其他过程也有作用。
精氨酸饥饿扰乱代谢过程
T细胞活化与大规模的代谢重编程有关,从单纯的氧化磷酸化转变为糖酵解、磷酸戊糖和谷氨酰胺分解途径(Carr等人。,2010;Chang等人。,2013;Frauwirth等人。,2002;Gubser等人。,2013;Wang等人。,2011). 考虑到补充精氨酸的T细胞代谢活性增加(Geiger等人。,2016),我们问精氨酸饥饿有什么影响。
我们测量了145种代谢物的细胞内水平,重点是氨基酸和高极性/离子化合物(表S3). 分层聚类将未刺激和−Arg刺激的T细胞(有一个例外)与低或+Arg条件下刺激的T淋巴细胞分开(F) ●●●●。在这一组中,未经刺激的T细胞和−Arg T细胞倾向于分开聚集,这表明精氨酸饥饿下的刺激会引起代谢变化,尽管程度不同于+Arg培养基。与ATAC seq一样(C) 主成分分析显示,在未刺激和+Arg/低Arg T细胞之间,−Arg T淋巴细胞的中间代谢物分布与部分活化一致(G) ●●●●。
与其他氨基酸一样,未经刺激的T细胞中精氨酸水平较低(图S7D) ●●●●。大多数氨基酸在所有刺激条件下都显示出相似的水平,这表明激活诱导的增加不依赖于精氨酸。我们观察到未刺激和−Arg细胞中的尿素循环中间产物减少(图S7E) 表明精氨酸代谢下调。之前的工作报告了ARG2系列T细胞激活后,细胞内精氨酸水平降低(Geiger等人。,2016). 然而,在我们手中参数2诱导不会导致精氨酸消耗(图S7D和S7F)。精氨酸饥饿被打破ARG2系列上调(图S7F) 这可能是为了保存细胞内的精氨酸,或由于不完全激活。我们观察到−Arg和未刺激T细胞中大多数核苷酸的减少(图S7D) ●●●●。活化T细胞中核苷酸合成上调(Geiger等人。,2016)这表明精氨酸饥饿可能通过限制能量可用性和/或DNA/RNA合成来阻止这一过程,这与T细胞活化受损一致。
许多三羧酸(TCA)循环中间产物在未刺激T细胞和−Arg T细胞中都被强烈耗尽(图S7G) 这表明精氨酸保护的T细胞无法上调线粒体基质的循环和/或净回输。与此相一致,反映线粒体代谢活性的耗氧率(OCR)在未刺激的和−精氨酸T细胞中要低得多(H) ●●●●。糖酵解活性,通过细胞外酸化率(ECAR;H) ,也显著减少。总的来说,−Arg T细胞的行为与静止、未刺激的T细胞更为相似,呼吸能力降低(图S7H) ●●●●。精氨酸饥饿条件下转录组差异分析(D) 糖酵解/糖异生、TCA循环和戊糖磷酸途径相关基因的下调(图S7我;表S2). 因此,代谢紊乱可能部分是由于无法上调代谢基因表达,这表明与染色质重塑的破坏有关。