疟疾人群基因组学的进展和机遇

摘要

介绍

疟疾是由该属的寄生原生动物引起的疾病疟原虫由该属雌性蚊子在脊椎动物宿主之间传播按蚊. The疟原虫生命周期包括脊椎动物宿主的单倍体无性生殖阶段和蚊子的二倍体阶段，一对或多对相同、近交或远交配子之间发生性重组¹个体寄生虫通常专门感染范围狭窄的脊椎动物和蚊子宿主。感染人类的主要疟疾寄生虫(恶性疟原虫和间日疟原虫)在1万到6万年前进化而来^2,三，使疟疾成为最古老的人类传染病之一，也是最致命的传染病之一⁴2019年，疟疾导致40多万人死亡，其中大多数是撒哈拉以南非洲的幼儿，估计全世界有32亿人易受感染⁵虽然疟疾年死亡率在过去20年中下降了一半以上，但药物和杀虫剂耐药性、缺乏高效疫苗以及新冠肺炎疫情等干扰因素可能会阻止或逆转这些增长⁵。

疟疾是一种古老的疾病，对儿童造成不成比例的死亡，它给人类人口提供了强大的进化压力，迫使他们抵抗感染和疾病⁴反过来，人类免疫系统和抗疟药物对寄生虫施加了强大的进化压力。随着人类在世界各地携带疟原虫，疟原虫已经进化，通过不同地区的当地疟原虫媒介物种来增强其传播能力⁶在过去的一个世纪里，由于杀虫剂的使用，他们自己也受到了巨大的选择压力⁷人类之间复杂的共同进化史，疟原虫寄生虫和按蚊蚊子被写入每个有机体的基因组中，基因组工具和数据对于理解疟疾的基本遗传基础和制定消除疟疾的新战略至关重要。事实上，每一种现代疟疾干预措施，包括抗寄生虫药物和杀虫剂，已经遇到了可以通过基因组变异进行研究的进化反应。此外，未能开发出高效疟疾疫苗的部分原因是编码最具免疫原性寄生虫抗原的基因的极端变异⁸人口基因组学因此可用于帮助开发有效的新干预措施，以及通过耐药性监测支持现有疾病控制措施的有效部署⁹，跟踪寄生虫和载体的移动¹⁰并使用人群基因组反应指标测量传播强度的变化¹¹。

在这篇综述中，我们简要介绍了人群基因组学在疟疾研究中的应用历史，并讨论了最近的进展，重点是寄生虫和病媒。我们描述了大规模高效数据生成的创新，以及旨在将此类数据用于基因组流行病学的分析。我们确定了疟原虫载体参考基因组组合可用性方面的差距，这些差距阻碍了对这一古老而多样的蚊子属的关键疾病传播成员的理解。最后，我们提出了一个使用流行病学数据分析技术的案例，该技术考虑了重组引起的变异，从而能够比较不同的基因组数据集，并补充和扩展考虑等位基因频率差异的传统变异分析。这篇文章并没有讨论在理解人类或载体基因组对疟疾的适应、功能基因组学、实验进化或寄生虫或载体转录组学方面的进展，最近的其他综述已经讨论了这些进展^12——14。

疟疾种群基因组学的发展

疟疾基因组时代始于西非3D7克隆的测序和组装恶性疟原虫，于2002年出版（参考文献。¹⁵)经过桑格中心（现为威康桑格研究所）、基因组研究所（TIGR）、斯坦福基因组技术中心和海军医学研究中心近十年的合作努力¹⁶（图1). 这23 Mb参考基因组揭示了恶性疟原虫携带近5300个基因，包括在var、rifin和stevor基因家族中与免疫逃避相关的200多个基因，定位于亚群。超过60%的预测蛋白质与其他生物体中的蛋白质没有序列相似性，也无法分配功能¹⁵。在发布恶性疟原虫基因组，多个小组开始表征该物种的基因组变异，并使用桑格测序法对地理上不同的分离物进行分析^17——19在稍后应用于的模板中间日疟原虫和其他寄生虫种类^20,21这些研究确定了足够多的遗传变异，以允许针对性和高通量的单核苷酸多态性（SNP）基因分型恶性疟原虫寄生虫^22——24促进对选择和人口历史的深入分析。

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图1

1995-2020年疟疾种群基因组学出版物。

的时间表疟原虫和按蚊基因组学出版物和重点出版物。一|疟原虫基因组学出版物。越来越多的疟原虫随着时间的推移，基因组学论文的标题和/或摘要中也包含了表示人口多样性的术语。突出的里程碑包括第一个恶性疟原虫2002年参考基因组组装。¹⁵)，联合出版物报告了2007年全基因组多样性的特征（参考文献^17——19)2019年发布Pf6K数据集（参考。¹⁷⁰). ‘所有基因组学数据都代表了1995年1月1日至今发表的NCBI PubMed数据库中的文章，其中包括标题或摘要中的搜索词“Plasmodium”和“genom*”群体基因组学的数据代表“所有基因组学”的文章，在标题或摘要中还包括搜索词“人口”、“流行病学”、“多态性”或“多样性”。b条|按蚊基因组学出版物。越来越多的按蚊随着时间的推移，基因组学论文也包含了表示人口多样性的术语。突出的里程碑包括第一个冈比亚按蚊2002年参考基因组组装。²⁵)，第一个全基因组单核苷酸多态性（SNP）基因分型阵列冈比亚按蚊2005年（参考。¹⁷¹)以及2017年AG1000G项目的发布（参考。²⁹). 如上所述搜索查询，替换为“疟原虫“使用”按蚊”。

第一个蚊子参考基因组组装，冈比亚按蚊2002年出版（参考。²⁵)，与恶性疟原虫汇编出版，由赛莱拉基因组公司和不同学术机构的研究人员合作推动。冈比亚按蚊是撒哈拉以南非洲地区最重要的疟疾传播媒介，可能是世界上最有能力的疟疾传播载体，因为它偏好人类喂养，喜欢在室内叮咬，并且容易感染疟原虫感染²⁶278 Mb基因组冈比亚按蚊被发现含有约14000个基因，其中许多基因与免疫、嗅觉和其他有助于疟疾媒介能力的性状有关²⁵虽然编码主要杀虫类靶标的基因在本次测序项目之前已经确定^27,28，的冈比亚按蚊参考基因组组装为任何蚊子提供了第一个完整的代谢基因目录，后来证明对确定该物种中多种非靶点抗药性机制至关重要^29,30。

努力构建第一个冈比亚按蚊参考基因组组装确定了极高水平的遗传变异。尽管所有蚊子都来自一个单独的圈养群体，但根据汇集的DNA测序，在蚊子中发现了近50万个SNP²⁵这种蚊子群落（称为PEST群落）是由两种细胞学形式的杂交种群建立的，即莫普蒂和萨凡纳，它们后来被区分为兄弟物种严格意义上的冈比亚和科鲁齐按蚊分别为³¹它们都是物种综合体的一部分，现在至少包括八个成员³²这两个高度多态性的姊妹物种在最初的参考装配项目中的混合有助于激发许多后续研究来区分种内多样性¹⁸形态相同的隐秘物种之间的基因组差异^32——36这些研究首次从基因组角度探讨了按蚊蚊子物种迅速辐射到新的分类群中，这一直是研究物种形成的生物学家感兴趣的问题。半个多世纪以来，由于隐秘物种的存在，使得从表型和基因上测量杀虫剂抗性的努力陷入混乱^37——39形态相同物种的基因组描述对疾病控制具有巨大价值。

参考程序集恶性疟原虫和冈比亚按蚊这只是迈向疟疾人群基因组学的第一步。虽然疟疾被称为一种单一疾病，但该术语包括由一系列寄生虫引起的感染，这些寄生虫至少由40种按蚊蚊子。在它们各自的血孢子虫寄生虫和按蚊分支中，其中许多都不是密切相关的姊妹物种（图2). 传播疟疾的疟原虫的不同进化谱系在大约1亿年前发生了分化⁴⁰当大陆相互分离时；类似地疟原虫感染人类的寄生虫物种属于一个古老的多倍体属的不同分支，该属包括感染范围广泛的灵长类、啮齿动物、鸟类、爬行动物和有蹄类的物种。寄生虫和病媒谱系的深刻分歧使得很难概括出有关该病许多方面的生物学知识，因此有必要对其不同病原体进行基因组研究。许多疟疾寄生虫和按蚊媒介的参考组件恶性疟原虫和冈比亚按蚊自2002年以来已被描述（参考文献^{三,41——45})（图2). 然而，除了恶性疟原虫,间日疟原虫和A.冈比亚/A.coluzzii。

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图2

用于疟原虫寄生虫和按蚊蚊子。

疟疾是一种由多种寄生虫引起的疾病，这些寄生虫来自不同的亚属和远古和多倍体群体疟原虫属（血孢子虫目）。疟原虫疟原虫通过不同的疟蚊媒介传播，这些媒介上一次共有一个共同的祖先大约在1亿年前（mya）⁴⁰。亚属或类群标签后面括号中的数字表示每个谱系中正式描述的寄生虫或蚊子种类的近似数量。所有物种都有参考基因组组合，除非另有说明。一|系统发育树疟原虫寄生虫，拓扑结构由Galen等人。¹⁷²以及Otto等人。^三.感染哺乳动物的成员的共同祖先疟原虫据估计，蝙蝠的存在时间不到60mya，因为蝙蝠被假设为原始哺乳动物宿主，这是翼手目辐射的估计日期¹⁷³感染人类的物种以粗体显示。b条|系统发育树按蚊参考可用基因组资源的蚊子。Foster等人提供的拓扑。¹⁷⁴和Neafsey等人。⁴²。缺少参考基因组组合科尔特斯齐亚以及美洲的其他亚属，限制了比较基因组机会来了解载体能力和许多载体谱系中杀虫剂抗性的基因组调查。巴布亚新几内亚巴新；不锈钢,严格的感觉。

在过去十年中，疟疾基因组学的进展主要是由高通量下一代测序（NGS）的出现以及使用上述参考基因组来分析这种方法产生的短读操作所推动的。NGS吞吐量的增加扩大了疟疾基因组学的应用范围，包括捕获世界各地自然人群中寄生虫和病媒遗传多样性的大规模数据集^21,29,46,47为识别和追踪药物和杀虫剂抗性标记提供了新的战略^48,49以及改进我们对疟疾流行病学的理解的新方法。

生成基因组数据的挑战

在大规模寄生虫和载体测序能够充分发挥其潜力之前，必须解决几个技术挑战⁵⁰这些挑战包括从寄生虫和蚊子样本中获取高质量的DNA，以及与载体基因组中的高度杂合性竞争。寻找应对这些挑战的解决方案一直是疟疾基因组学界创新的一个主要重点，并且已经出现了一些切实可行的解决方案。下面我们将详细介绍其中的一些挑战和创新。

使用疟疾人群基因组数据

过去15年来，疟疾寄生虫和病媒参考集合和多态性数据集的创建提高了我们对疟疾生物学各个方面的理解，而来自自然人群的基因组数据可以为控制和消除疟疾战略提供信息。我们在下面介绍了这些数据集的一些用途。

基因组多样性特征

在寄生虫和载体中，基因组变异以各种方式表现出来。”在参考基因组组装可用之前开发的基因前方法，如微卫星⁷²和等位基因特异PCR⁷³用琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增子大小多态性⁷⁴，由于其简单性和低成本，继续得到使用。基因后方法包括小型SNP基因分型小组^75——78，大型SNP基因分型阵列^23,79，扩增子的靶向测序^80——84或分子反转探针（MIP）⁸⁵和鸟枪全基因组测序（WGS）。这些方法^{46,86——88}在方框中总结1。

大规模重测序研究，确定跨基因组的SNP恶性疟原虫和间日疟原虫来自世界各地的血液样本显示人口结构国家和大洲内部和之间^{19,21,46,47,88}寄生虫基因组多样性的范围和性质反映了史前传播水平、殖民时期的人类和寄生虫运动以及上个世纪控制工作造成的人口瓶颈^{21,46,47,50,88,89}.非洲各地疟疾媒介遗传多样性的类似努力——主要是冈比亚按蚊和A.科鲁齐伊-揭示了整个大陆令人难以置信的人口多样性和结构²⁹在WGS不可行的情况下，此类重新排序研究为开发地理目标基因分型小组提供了一个框架。这些大规模多样性目录的主要应用如下所述。

方框1生成中的群体基因组数据疟原虫和按蚊

除了全基因组测序外，还有多种其他技术用于寄生虫和载体的定向测序或基因分型。

msp/glurp公司 基因分型

巢式PCR分析已用于检测基因的多态性裂殖子表面蛋白1和裂殖子表面蛋白2，编码高度多态性恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1和2及其基因胶合板编码富含谷氨酸的蛋白质。常见的应用包括在人群遗传学研究中估计感染的复杂性，以及在疗效研究中区分复发感染和新感染^73,74虽然这些方法简单且价格低廉，但其分辨率低于测序方法。

微卫星基因分型

多种生物的主要基因分型方法，包括疟原虫和按蚊尤其是在前基因组时代^143,176显示长度多态性的串联重复序列的扩增和测序或基于凝胶电泳的特征可以读出等位基因长度，并且遗传变异的每焦点计数较高。等位基因长度估计不准确会使解释复杂化，并限制微卫星标记面板的可扩展性。微卫星用于识别恶性疟原虫从亚洲到非洲的抗疟疾药物耐药等位基因⁷²最近，跨越大湄公河次区域东部^177,178。

SNP基因分型

对于之前通过全基因组测序发现的单核苷酸多态性（SNP）位点的基因分型，存在多种技术。疟疾基因组学领域采用了包括Sequenom/Agena、Taqman和高分辨率熔化曲线在内的方法，对大量寄生虫或载体样本中的单个双等位基因SNP进行基因分型¹⁷⁹SNP基因分型在规模上成本低廉，但需要专门的仪器。SNP基因分型微阵列首次揭示了物种形成的染色体结构冈比亚按蚊和科鲁齐按蚊¹⁷¹。

PCR扩增子测序

短PCR扩增子（100–300 bp）的下一代测序（NGS^82,85如果扩增子的目标是显示高密度SNP的短窗口，则单倍型水平的等位基因丰富度可能很高，即使组成SNP只是双等位基因。高度单倍型多样性抗原的扩增子测序为复杂感染的研究提供了线索⁸²和疫苗效力¹²²，并已用于监测耐药位点的已知和新等位基因^180,181。

基于捕获/杂交的测序

寄生虫全基因组的杂交捕获已用于对以宿主DNA为主的临床样本中的寄生虫DNA进行选择性测序^56,57并可用于寄生虫和载体基因组内信息标记面板的定向测序。分子反转探针（MIP）已被应用于捕获、扩增寄生虫基因组中数千个短靶点（100–150 bp）并对其进行测序。与多重扩增子测序相比，MIP捕获和测序非常适合对更多基因组区域进行靶向测序，但灵敏度较低。MIP最近提供了耐药等位基因流行和恶性疟原虫刚果民主共和国的人口连通性¹⁸²。

寄生虫耐药性位点的鉴定和监测

疟疾寄生虫对所有广泛使用的抗疟药物产生了耐药性⁹⁰在某些情况下，耐药性已在全球蔓延，而对于其他化合物，耐药性仍很少见，且分布不均匀。在直接测量患者表型的机会过去很久之后，回顾性基因组耐药性监测可以帮助我们了解耐药性是如何产生的，并且比基于单个当地人的调查具有更高的分辨率⁹¹前瞻性基因组监测可以在确定特定耐药位点之前，以选择性扫描的形式识别新出现的耐药特征⁹²寄生虫对氯喹的耐药性有助于破坏世界卫生组织1955年至1969年的全球消除疟疾运动（参考文献。⁹³). 2000年，主要负责介导氯喹耐药性的基因，功率因数校正电路-编码ATP-结合盒转运体-在寄生虫中被鉴定⁹⁴随后的耐药性监测工作显示，对氯喹的耐药性在东南亚和南美重新出现后，在全球范围内传播⁹⁵.抗磺胺多辛/乙胺嘧啶⁷²-作为一线治疗药物氯喹的继任者，也首先出现在东南亚和南美，在与耐药性相关的基因（二氢叶酸还原酶、，脉冲多普勒频率和二氢蝶酸合成酶，pfdhps公司)可以被发现⁹⁶。

最近出现了对青蒿素的耐药性^97,98，目前的一线治疗（结合各种伙伴药物）恶性疟原虫世界上许多地方都有疟疾。体外抗药性选择和显示对青蒿素体外敏感性降低的寄生虫株系的WGS导致了青蒿素抗药性分子标记的鉴定⁹⁹含有Kelch结构域的蛋白PfK13的螺旋桨结构域中的突变（由13号染色体上的基因编码，pfkelch13号机组)尤其是该区域的C580Y突变已被证实是降低青蒿素敏感性的因素。这种关联的基因组证据来自等位基因替换研究¹⁰⁰，全基因组关联研究^48,101、连锁群选择实验¹⁰²和选择扫描^92,103,104.全球基因组监测正在进行pfkelch13号机组突变和在其他基因座的上位性或适合性补偿突变恶性疟原虫基因组，包括用于联合治疗的伙伴药物的耐药突变¹⁰⁵.尽管pfkelch13号机组已证实突变发生在大湄公河次区域（GMS）首次起源以外的地理位置^{61,62,106,107}监测表明，在撒哈拉以南非洲、南美洲和新几内亚，这种情况仍然罕见，这使人们对追溯⁹¹和当前的基因组监测工作^{85,88,108,109}可以通过指导当地有效的治疗政策，为耐药性管理工作提供信息，从而限制对青蒿素类联合疗法的耐药性在全球的传播。例如，鉴于人口基因组学已经证明pfkelch13号机组^C580年GMS内外的等位基因都是由数十种复发性从头突变驱动的^{61,62,91,104,106}从长远来看，如果其他地方没有平衡的阻力监测工作，在大湄公河次区域采取遏制阻力的战略可能是行不通的^110——112。

蚊虫抗药性位点的鉴定与监测

种群基因组学有可能实现对蚊媒抗药性的循证管理¹¹³在过去20年中，在降低疟疾死亡率方面取得的大部分进展归功于病媒控制¹¹⁴和按蚊共同进化出对目前用于成年期控制的四种化学杀虫剂的抗性，即拟除虫菊酯、有机氯、氨基甲酸酯和有机磷酸盐¹¹³早期使用PCR在已知的农业害虫抗药性位点发现编码杀虫剂结合靶点的基因突变：敲除vgsc公司，一种编码电压门控钠通道的基因，对拟除虫菊酯类和滴滴涕等有机氯杀虫剂具有耐药性²⁷而乙酰胆碱酯酶基因的敲除ace1号机组赋予对氨基甲酸酯和有机磷化合物的抗性^28,115。

基于全基因组的方法揭示了杀虫剂结合靶点以外的一系列迷人的抗性机制，包括细胞色素P450基因和谷胱甘肽突变或上调编码的代谢抗性S公司-转移酶基因¹¹⁶; 通过改变不安全角质层的厚度或特性来抵抗屏障¹¹⁷; 行为抵抗——例如，避免使用杀虫剂处理过的蚊帐或墙壁——以及其他更具体的机制，例如与拟除虫菊酯高度亲和力结合的感觉附属物蛋白（SAP2）的过度表达¹¹⁸人口基因组数据揭示了如何通过SNP、基因复制和其他结构变异实现多样性适应³⁰以及这种突变是如何在不同地区密切相关的物种之间渗入的²⁹例如，拷贝数变量出现在冈比亚按蚊与代谢抗性相关的基因家族，具有较高的群体频率和单倍型结构，表明它们是通过阳性选择传播的³⁰这一观察驳斥了通过对目标基因中SNP的简单基因分型可以诊断耐药性的观点，并表明WGS和用于拷贝数变异检测的改良生物信息学方法在追踪杀虫剂耐药性方面将是无价的³⁰。

帮助疫苗开发

群体基因组方法表明，寄生虫抗原多样性在降低疫苗效力中起作用¹¹⁹.许多候选人开始努力发展恶性疟原虫前基因组时代的疫苗，当时已经测量了寄生虫靶点的免疫原性，但没有测量其多样性。尽管恶性疟原虫总的来说，基因组多样性中等，许多编码抗原的基因，如环子孢子蛋白（CS）、顶膜抗原1（AMA1）和血小板反应蛋白相关黏附蛋白（TRAP）的基因，表现出极高的多态性（图三). 迄今为止，大多数基于这些抗原的单价肽疫苗在临床试验中显示出有限到中等的疗效，部分原因是它们针对单个寄生虫等位基因，并对其他寄生虫等位蛋白诱导了不完善的交叉保护免疫¹²⁰在针对AMA1蛋白的单价肽疫苗的第二阶段试验中恶性疟原虫，总有效率为20%，而对具有与疫苗等位基因匹配的等位基因的寄生虫感染的有效率为64%¹²¹同样，在RTS的第三阶段试验中，S/AS01——第一个也是唯一一个获得许可的疟疾疫苗——疫苗对寄生虫感染的效力，其等位基因与RTS的疫苗结构相匹配恶性疟原虫CS蛋白为50%，而具有非匹配等位基因的寄生虫感染为33%¹²²据推测，这些基因的高度多样性是通过寄生虫种群瓶颈得以维持的，或随后在高度等位基因特异性免疫保护的驱动下，通过免疫介导的平衡选择得以恢复¹²³。

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图3

免疫介导平衡选择的种群多样性估计和证据恶性疟原虫疫苗靶点。

许多单价蛋白亚单位疫苗的开发工作在许多血型和肝型抗原的广泛多样性得到认可之前就开始了。每个点代表一个恶性疟原虫蛋白质；半透明的灰色圆点表示疫苗未针对的蛋白质，不透明的橙色圆点表示在临床试验.gov自2000年起（参考。¹⁷⁵). 水平轴表示平均氨基酸非同义配对多样性的估计值，π。纵轴表示田岛的估计D类，基于变体站点频谱的中性统计，其中负值表示低频变体的过量，正值表示高频变体的过量，这可以指示平衡选择。使用序列集合计算估计值恶性疟原虫来自马拉维的寄生虫Pf3k资源与非候选疫苗相比，候选疫苗通常表现出更高水平的多样性（Wilcoxon秩和检验，W公司 = 8322.5,P（P） = 0.0001），并显示平衡选择的证据（Wilcoxon秩和检验，W=8967，P（P） = 0.0002). 较新的基因组后血型疫苗靶点RH5的多样性大大降低，阻断传播疫苗的几个靶点（P230、P25和P48/45）也是如此。

群体基因组学将在未来疫苗开发工作中发挥重要作用，方法是绘制不同群体之间疫苗靶点多态性的差异，并确定在任何地理区域都不具有高度多态性的免疫原性蛋白靶点。有趣的是，所谓的传播阻断疫苗（P230、P25和P48/45）的几个靶点，其目的不是保护受试者，而是降低继续传播的可能性¹²⁴与寄生虫群中大多数感染抑制疫苗靶点相比，显示出低水平的多样性（图三)可能是由于自然免疫选择减少。此外恶性疟原虫网织红细胞结合蛋白同源物5（RH5）蛋白在红细胞入侵中起着重要作用，种群基因组数据表明其在寄生虫种群中表现出低多样性¹²⁵表明以RH5为靶点的疫苗可以避免等位基因特异性保护问题。已发现对RH5产生的抗体对恶性疟原虫¹²⁶类似地，与表位结合的单克隆抗体恶性疟原虫位于蛋白质N末端区域和重复区域交界处附近的CS蛋白已被证明可以防止感染¹²⁷。该表位在寄生虫种群中表现出极低的多样性，这促使人们努力评估针对该区域的抗体所赋予的保护作用¹²⁸。

了解感染和传播

历史上，对传播强度和传播动态的了解依赖于诸如病例发生率和流行率等常规测量，以及来自患者旅行历史的信息。虽然这些数据至关重要，但来自自然人群中寄生虫的基因组数据有潜力提高对疟疾传播的了解，并指导控制疟疾传播的策略^10,11需要进一步研究，以了解基因组特征作为传播强度指标的性质、可推广性和实用性。

虽然疟疾寄生虫是单倍体单细胞生物，除了蚊子的短暂二倍体阶段外，疟疾寄生虫的种群可能在单个人类和蚊子宿主中表现出相当大的基因组异质性，这种异质性可以提供对疾病传播性质和强度的了解。在抗药性标记和其他感兴趣的位点研究蚊子体内寄生虫基因组变异的工作尚处于早期阶段^129,130; 然而，利用微卫星和msp/glurp公司前基因组时代的基因分型，近年来，使用PCR扩增子的NGS和单细胞WGS。使用NGS对PCR扩增子进行深度测序可以敏感地表征宿主内寄生虫的遗传多样性；当扩增子以单倍型多样性高的区域为目标时，这尤其有效，因为宿主体内不同的寄生虫不太可能在目标区域拥有相同的序列^80——83。

一项关于泰国-缅甸边境地区本地传播下降的调查发现，与传播下降相关的最强遗传信号是宿主体内寄生虫遗传多样性的丧失，这是通过复杂感染比例的下降来衡量的¹³¹-表明这一指标可以代表当地的传播强度¹³²复合感染是指包含具有一个以上不同基因组序列的寄生虫的感染，其中不同基因组序列数量为感染的复杂性（COI）。复合感染可能是由蚊子单独叮咬引起的，这个过程称为二次感染和/或在一个叫做共同传输（图4). 根据COI估计值确定传播强度水平需要假设新的复合感染是如何产生的。不同基因的寄生虫可能有亲缘关系（共享一些最近的共同祖先）或无亲缘关系。由于在寄生虫种类繁多的高传播环境中，重复感染预计会更频繁，因此在不同叮咬中传播的寄生虫可能是无关的。同时，共同传播的基因不同的寄生虫更有可能是相关的而非无关的，因为在单个蚊子中的一对或多对配子重组后，有多种方法可以采集基因不同的人类感染子孢子，然而，只有当两对或多对不相关的配子自交后，才能采集到不相关的子孢子。

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图4

复杂感染、寄生虫交配和血统鉴定。

复合感染是由多次蚊虫叮咬（重叠感染）和/或单次蚊虫叮咬（共同传播）引起的。蚊子以复杂感染的宿主为食后，可以发生基因不同的疟疾寄生虫之间的重组；否则，通过自交繁殖。基因组数据可用于观察共享相同等位基因的基因座（状态相同（IBS）），并推断最近共同祖先的后代基因座（血统相同（IBD））。一|高传播率，显示有三只蚊子，每只蚊子都感染了来自同一血统的寄生虫，通过重叠感染在两个人身上发现了相互关联的复杂感染。在这些复杂感染中发育的配子细胞被蚊子吸收，随后在其中重组。展示了两种说明性的场景：一种是同时发生自交和异交，另一种是只发生异交。这些蚊子在随后的两个个体中发现了内部和相互关联的复合感染，这次是通过共同传播。b条|低传播，显示蚊子自交后两个不同但相关的寄生虫基因组序列的克隆繁殖。每个圆圈代表一个或多个共享相同基因组序列的寄生虫。不同的圆圈代表不同的基因组序列；不同的颜色代表不同的遗传谱系。

单个宿主可能经历共同传播和重叠感染事件，从而导致与遗传相关和无关寄生虫的复杂感染。直到最近，共同传播被认为不太可能导致大多数复杂感染。这是因为，每次感染后，各种瓶颈都会减少存活寄生虫的数量，从而减少存活寄生虫中不同基因组序列的数量。例如，蚊子通常每次叮咬只注射10–100个子孢子阶段的寄生虫¹³³只有20%的子孢子可能离开皮肤接种部位¹³⁴其中只有一小部分能够避免脾脏和免疫反应的清除，从而成功感染肝脏并建立血型感染¹³⁵然而，最近使用寄生虫感染的宿主红细胞的单细胞WGS进行的研究表明，寄生虫的串联共传播可能很常见^136——138.对数百个单一寄生虫感染细胞的寄生虫基因组进行分析，确定了寄主内最近的共同祖先水平和寄生虫之间的重组水平，这些水平被认为过高，无法单独用重叠感染来解释，这表明寄主之间的相关寄生虫谱系存在多轮共同传播^136——138并提出了新的感染是否通常由比先前假设更多的子孢子引起的问题。需要对蚊子唾液腺内子孢子阶段的寄生虫基因组多样性进行单细胞测序研究，以调查疟疾感染是否是由比以前认为的更多的寄生虫接种引起的。

利用基因组学控制疟疾

疟疾基因组数据的几个应用涉及基于其遗传特征的寄生虫种群空间差异¹³⁹寄生虫独特的基因组特征允许调查寄生虫种群之间的联系，以确定以前未经认可的感染源和感染汇，并评估低传播地区的病例是否由本地传播或输入引起——需要不同的干预策略和这种差异对实现或保持官方疟疾消除地位具有影响。为公共卫生有意义地实施疟疾基因组学方法需要认真考虑当前的操作挑战¹⁴⁰包括可持续的数据生成和分析能力、各地区之间数据和分析方法的协调、试剂供应链、时间表和成本以及信息本身的实际价值。

数据分析

测序和基因分型方法的普及以及数据生成的分散满足了不同用户和应用程序的需求，但使不同研究和公共卫生工作之间的数据互操作性问题复杂化。概括群体内或群体间等位基因频率变化的描述性统计因数据类型而异，因为不同类别的多态性，例如SNP和微卫星，其突变率相差1000倍¹⁴³因此，这些广泛使用的统计数据包括π-种群内多样性的度量¹⁴⁴这通常被用作人口规模的相关性¹⁴⁵-和固定指数(F类_装货单)-测量种群间分化¹⁴⁶有时被用作基因流的关联¹⁴⁷-不适用于具有不同输入数据类型的研究和元分析。虽然随着疟疾流行病学基因组数据生成技术的进步，随着时间的推移，可能会导致进一步的数据互操作性问题，甚至在地理区域内，数据生成器之间的方法可能会出现一些趋同。

基于相关性的分析桥接基因组数据类型

相关性是一种基于重组的测量两个人最近共同祖先的方法¹⁴⁸这是一个可以在不同类别的基因型多态性之间进行比较的测量方法的例子。虽然无法估计不同数据类型样本之间的相关性，但可以利用相关性的传递性和/或某些数据类型的嵌套性，例如WGS数据中的SNP条形码，比较不同数据集之间的一些样本，这是未来研究的机会。

相关性是疟疾基因组流行病学的一个有用指标，因为它是基于重组的。与π和F类_装货单这反映了等位基因频率的可变性，异交重组打破了相关性，从相同克隆的一个到完全无关的生物体的零个。对于一对单倍体疟原虫，亲缘性定义为在基因组上的任何给定位点上，两个等位基因血统相同的（IBD）¹⁴⁹对于二倍体蚊媒，根据IBD在任何位点的四个等位基因之间的模式，有许多相关测量¹⁵⁰如果等位基因是某些祖先群体中最近共同祖先的后代，则为IBD；血统上的同一性也可以根据染色体片段来定义，这些染色体片段是从最近的共同祖先原封不动地继承下来的，通过重组而未被破坏¹⁵¹IBD片段可用于检测药物或其他未知试剂选择的基因组区域^88,89,91,152根据它们的长度，它们还可以用来区分亲缘关系密切和远缘交配的对，以及亲缘关系较远但近亲繁殖的对，尽管在最近几代人中长度分布很广¹⁵³然而，IBD分段推理并不能解决在数据类型之间实现相称推理的问题，因为分段推理特别需要WGS数据¹⁴⁹，而相关性可以在使用更适度数据的统计模型下推断^152,154（图5)。

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图5

在远交和近交群体中，随着时间的推移，血统的身份下降。

这是一个连续几代的重组如何按血统分解同一染色体片段（按血统相同（IBD）片段）并降低相关性（IBD概率）的示例。在包括选择检测在内的各种应用中使用的IBD片段需要全基因组测序（WGS）数据来估计，而在包括种群连接性特征描述在内的应用中使用到的相关值不需要WGS数据来估计。前三个面板显示了一个种群中的蚊子或寄生虫迁移到另一种群中的蚊虫或寄生虫时，IBD片段在世代之间的分解。垂直条表示接收人群中采样的个体（蚊子或寄生虫）的染色体基因组序列。原始移民和取样个体之间的IBD用彩色填充物表示。浅灰色表示非IBD序列。“零代”代表了原始移民与自身的比较。此后，我们显示了移民与其最近亲属之间的IBD。IBD片段在连续几代中分解；分解取决于异交的机会，这在近交群体中是有限的，尤其是寄生虫群体，因为寄生虫会间歇性地自我交配。对于前三个面板中描述的每种情况，底部面板显示了相关性的相应降低。

基于不同数据类型的相关度估计值彼此具有可比性，并且有助于直接比较不同研究，前提是不确定性测量值用于解释不同数据类型之间信息量的变化。对于具有不同近亲繁殖率和自交率的种群，对高亲缘性的观察应该有不同的解释，然而，从直觉上看，高亲缘度不太可能暗示近亲繁殖种群中最近的共同祖先。高相关度阈值已被用于在研究中对相关度估计进行信息对比，早期对无阈值方法的努力可能有助于使这些总结在研究中更加相称¹⁵⁵需要注意的是，在两个个体之间按状态相同（IBS）-那些共享相同序列的序列-是关联性的关联；然而，基于IBS的相关性测量并没有考虑到等位基因频率的差异，因此在不同数据类型之间并不相称¹⁴⁹。

相关性在疟疾研究中的应用

估计和解释成对样本之间的相关性可以应用于多个流行病学用例。当异交重组率足够高时，IBD的分解速度比等位基因频率变化的累积速度更快，因此根据IBD进行测量，包括相关性，与基于等位基因频率变化（如π或F类_装货单（图6). 在基因组流行病学中，通常不进行性重组的RNA病毒和其他可测量进化病原体的快速突变率被用于系统发育推断，以研究病原体传播¹⁵⁶。疟原虫寄生虫表现出真核生物典型的SNP突变率，约为10⁻⁹（参考。¹⁵⁷)到10⁻¹⁰（参考。¹⁵⁸)每代每个站点的替换。使用敏感的测序和分析技术捕获罕见的从头变异，可以在短时间内推断疟疾传播网络¹⁵⁹然而，这对疟疾不如对病毒和细菌那么实用¹⁵⁶因为疟原虫寄生虫与这些病原体相比，因为疟原虫寄生虫性重组使系统发育推断复杂化，并且由于在高负担环境中传播链采样不够密集。至于上述等位基因频率的变化，突变发生的速度不够快，无法区分疟原虫在相隔数十公里的距离尺度或数月至数年的时间尺度的种群之间的移动，然而，检测样本之间的相关性可以在这些时空尺度上测量人口连通性^10,160划定不相连的人口单位，并迅速告知疾病消除干预措施。

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图6

使用相关性与等位基因频率变化来测量群体连通性。

一个说明性的例子是，通过使用遗传分化、固定指数和基因频率变异，在时间尺度上，通过血统一致性概率（IBD）的度量，相关性如何揭示蚊子种群之间的连接性，这一时间尺度与流行病学应用的相关性比等位基因频率变异更大(F类_装货单)作为等位基因频率变化的一个示例。行代表不同的蚊子种群。蚊子代表采样的个体，按其优势谱系着色，边缘连接表明其亲缘关系很高，因此在不同种群的成对蚊子之间发生IBD的可能性很高。具有较高连接性的种群容易共享更多高度相关的边。在基因型标记的等位基因频率有或没有明显的群体间变异的情况下，群体之间的相关性可能会发生变化。等位基因频率由直方图表示，纵轴表示等位基因的频率，横轴表示标记。F类_装货单描述了种群间等位基因频率的变化，连接不良的种群预计会表现出更多的等位基因变异频率。相对于重组，遗传漂变、迁移和/或选择通常需要更多的时间在孤立群体中转移次要等位基因频率，如果异交率足够高，预计这将迅速耗尽亲缘关系。

已观察到寄生虫样本间IBD的证据与寄生虫传播的减少呈正相关^11,101，而媒介种群规模的瓶颈同样会导致近亲繁殖²⁹，表明该特征作为评估传播强度和媒介种群规模变化的指标的效用。在渔业和保护生物学领域，亲缘关系流行率长期以来一直被用作评估特定物种丰度的工具，例如通过近亲标记再捕获技术^161,162虽然疟原虫和按蚊的生命周期不同，需要对亲缘关系进行不同的解释，但相关个体更有可能在较小的人群中共同取样，这一基本前提使得这项技术同样适用于寄生虫和媒介生物。相关性推断还有其他应用，正在疟疾背景下开始探索。例如，克隆100%相关的证据已被用于分类恶性疟原虫复发为新获得或治疗失败的产物¹⁶³，并且有证据表明50%的亲缘关系与异交兄弟姐妹有关，这有助于分类间日疟原虫肝病复发时的复发¹⁶⁴最后，相关性估计可以进行下游分析，包括各种聚类算法和统计模型，这些算法和模型可以明确阐明疟疾流行病学的假设¹⁶⁵。

结论和观点

疟疾界有幸积累了丰富的基因组数据资源和分析方法，以支持从基础疟疾生物学到应用疟疾控制战略的应用。许多研究表明，这些资源在确定抗药性和抗杀虫剂性的标记物和机制以及用基因组数据补充病例数、发病率和旅行史等传统流行病学疾病指标方面具有价值，以便告知当地传播与病例输入的相对比率，人群之间的联系以及寄生虫和病媒干预的效果。

毫无疑问，研究界将继续使基因组数据更实用，以便在防治疟疾中生成和使用，下一个要解决的问题是如何管理由于在疾病流行国家加强寄生虫和病媒监测工作而产生的所有分布式数据生成。在实现基因组流行病学在实际疟疾控制和消除战略中的潜力方面仍然存在三个关键差距：第一，当地专家应能够在没有高度专业化和资源充足的机构的广泛支持下进行数据生成、分析和解释；第二，为了具有实用价值，基因组信息必须按操作相关的时间尺度生成；第三，必须通过鼓励数据集之间的互操作性和在利益相关者之间建立网络，促进跨基因组数据集的分析和与流行病学指标的集成。

考虑到当前数据生成的能力和数据计算的局限性，我们预计来自靶向方法的信息，例如基于PCR扩增或基于MIP的测序和基于SNP的基因分型，可以预见，这将成为马拉维国家内大多数数据生成工作的基础，因为这些工作仍然可以在比WGS资源更低的环境下大规模实施。合作机构可以生成这些数据类型，以支持国家和研究伙伴，并用于研究发现目的。与此同时，我们预计，WGS数据将继续为全基因组范围内全球遗传多样性和动力学的理解提供信息，并不断改进针对性测序和基因分型方法的设计策略和数据解释框架。

使用重组引起的变异作为解释疟疾基因组数据和告知疾病干预策略的框架的潜在价值，而不是使用突变引起的变异（如在可测量进化病原体的基因组流行病学中）或等位基因频率的变异（如π和F类_装货单)，已经影响了针对相关性推理优化的目标测序方法的发展。例如，有针对性的重新测序工作已经开始将重点放在紧密聚集的SNP变体上，这些SNP变体会产生许多不同的单倍型¹⁴²，以便更好地为关联推理提供信息¹⁴⁹需要在分析和可视化层面进行额外投资，以进一步识别和利用疟疾基因组数据中与公共卫生决策相关的信号。这项工作的关键是存储、存储和共享数据的方法，以及支持生成流行病学数据的研究和监测工作的分析工作流的方法^10,166,167除了NCBI序列读取档案和欧洲核苷酸档案外，疟疾领域长期受益于寄生虫基因组数据存储库（PlasmoDB）¹⁶⁸和向量（VectorBase）¹⁶⁹，最近已合并到一个名为VEuPathDB（车辆路径数据库）这些数据库提供了参考基因组集合和注释的宝贵管理，与功能和转录组数据集成，以提供对基因作用的深入了解。然而，他们的主要受众一直是研究人员；基因组监测方法的实施可能需要一种独特的方法来管理、分析和共享基因组数据，以服务于公共卫生界的利益相关者。

尽管有许多技术方面的考虑需要解决，但最大的一个问题可能是数据共享。作为一个社区，我们必须追求开放数据共享的未来，以造福全球健康，同时对阻碍数据共享和发布的复杂性保持敏感。我们还必须支持各国努力了解共享基因组数据的风险和益处，为未来制定政策，同时务实地满足当前需求。有了这一点，人口层面的基因组变异数据将有能力推动全球公共卫生的变革性影响。

鸣谢

词汇表

作者贡献

D.N.和B.M.撰写了手稿的初稿。D.N.和A.T.设计了这些数字。所有作者都编辑并审阅了手稿。

竞争性利益

作者声明没有相互竞争的利益。

脚注

参与者信息

Daniel E.Neafsey，电子邮件：ude.dravrah.hpsh@yesfaen。

Bronwyn L.MacInnis，电子邮件：gro.etutitsnidaorb@nywnorb。

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