脂肪酸去饱和酶1通过调节肝脏脂质平衡PPARα‐FGF21轴线

道德声明

这项研究是根据《赫尔辛基宣言》进行的。动物实验得到了德克萨斯农工大学（IACUC‐2014‐0335）和韦恩州立大学（IAPUC‐18‐08‐0759）动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

细胞系和治疗

本研究使用细胞系HepG2和HuH7以及原代人类肝细胞。在实验之前，用微卫星标记基因分型对细胞进行鉴定。原代肝细胞（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）在解冻后使用一次。稳定的HepG2细胞FADS1型击倒（KD）按照支持方法中的描述进行构建。为了研究FADS1状态对脂质积累和细胞损伤的影响，稳定的FADS1‐KD细胞也被表达FADS1或对照腺病毒的腺病毒载体瞬时转染。在不同的实验中，用混合棕榈酸（PA）和油酸（OA）、DHA、FGF21和/或PPARα激动剂处理细胞（支持方法）。

HepG2细胞中PUFAs的脂质组学分析

为了验证FADS1‐KD对培养物中PUFA代谢的影响，HepG2细胞（对照、KD和过度表达）通过在常规培养基（补充10%胎牛血清的罗斯韦尔公园纪念研究所1640培养基）中培养72小时来扩大。然后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗细胞两次，并用橡皮警察收集。根据Folch等人的方法提取总脂质。^{( 14 )}简言之，使用一维薄层色谱法在硅胶（60石膏）板上分离总磷脂，使用氯仿/甲醇/乙酸/水（90:8:1:0.8 vol/vol/vol/vol）作为展开溶剂。然后在76°C至80°C的温度下，将分离的总磷脂在6%甲醇盐酸中酯交换过夜，然后进行我们团队先前建立的气相色谱-质谱分析。^{( 15 )}实验分为四个重复。

中性脂质的BODIPY染色和定量

HepG2稳定细胞（2×10⁴)（对照组、FADS1‐KD和过度表达）接种到35 mm玻璃底细胞培养皿中。培养24小时后，取出培养基，用含有载体（牛血清白蛋白）、PA+OA（PA 0.3 mM，OA 0.4 mM）或PA+OA+DHA 25μM的新鲜培养基替换，再培养24小时。然后用PBS清洗细胞两次，并用4%多聚甲醛固定10分钟。用PBS进一步洗涤细胞两次，并用含有5μg/mL BODIPY和1μg/mL Hoechst 33342的溶液进行染色（用于细胞核染色）。在37°C下培养30分钟后，用PBS清洗细胞两次。使用蔡司激光扫描显微镜800共焦显微镜（德国卡尔蔡司）拍摄图像。ImageJ软件通过分析六个场来量化荧光信号。

油红O染色用于油脂积累

用福尔马林固定培养细胞，用新制备的油红O（ORO）染色剂染色，然后用异丙醇萃取，并在492 nm处读取。然后用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞进行染色。然后将ORO读数归一化为DAPI读数。

TGs和总胆固醇的定量

采用改进的异丙醇：己烷萃取法提取总脂质。^{( 16 )}使用Infinity TG试剂（Thermo Fisher Scientific）定量干燥脂质中的TG含量。对于胆固醇，用氯仿：异丙醇：NP‐40（7:11:0.1）从肝匀浆中提取脂质。用分析缓冲液溶解干燥的脂质。根据制造商的说明（马萨诸塞州剑桥市Abcam），使用胆固醇检测试剂盒测量总胆固醇水平。细胞或肝组织中的TG和胆固醇水平表示为细胞裂解物/组织匀浆中的总TG或胆固醇含量与裂解物/匀浆中的总蛋白质水平的比率。

总抗氧化物测定、活性氧生成和脂质过氧化分析

通过Cu的转化，使用比色法测定每个样品中的总抗氧化剂水平²⁺到Cu^{+ ( 17 )}（阿布卡姆）。用CM‐H评估活性氧（ROS）生成₂DCFDA、Hoechst 33342和MitoSOX红（Thermo Fisher Scientific）染色，然后用ImageJ定量。

基因表达、Western印迹和酶联免疫吸附试验

用实时聚合酶链反应（PCR）定量关键标记基因的mRNA水平。引物序列在支持表中列出S1和S2使用实验室制定的标准方案，用蛋白质印迹法证明蛋白质水平（详见支持方法）。所有一级抗体，抗-FADS1（ab126706）、抗-PPARα（ab97609）、抗β-actin（ab6276）和抗FGF21（ab171941）均购自Abcam。根据制造商的方案（#DF2100；明尼苏达州明尼阿波利斯研发系统公司），使用酶联免疫吸附试验（ELISA）测量细胞培养基中的FGF21水平。

电泳迁移率变化分析

采用电泳迁移率偏移分析（EMSA）验证了不同条件下PPARα与FGF21启动子的结合。简单地说，核蛋白是使用Thermo Scientific NE‐PER核和细胞质提取试剂盒中的试剂提取的。使用LightShift化学发光EMSA试剂盒（Thermo Fisher Scientific）和合成探针（支持表）中提供的试剂组分制备结合反应第3章).

FADS1‐KD诱导脂质积聚的基因表达变化

为了阐明FADS1下调后HepG2细胞中脂质积聚的分子机制，我们量化了与脂肪酸摄取有关的关键基因的表达，从头开始脂肪生成（DNL）、脂肪酸氧化和TG合成和分泌（图。​（图3A）。3A级). DNL主转录因子固醇调节元件-结合转录因子1的可比表达水平(SREBF1)在FADS1‐KD和对照细胞之间观察到。相比之下，脂肪酸合成酶的表达(FASN公司)基因(P（P）<0.01）在FADS1‐KD细胞中显著上调。更值得注意的是，脂肪酸氧化标记的表达，包括PPARα肉碱棕榈酰转移酶基因(CPT1A公司和CPT2型)，羟酰辅酶A（CoA）脱氢酶三功能多酶复合物亚单位α(HADHA（二十二碳六烯酸）)基因和烯酰基-CoA水合酶(ECH1标准)基因(P（P）<0.001），在FADS1‐KD细胞中显著下调。脂肪酸摄取转运体的表达在FADS1‐KD和对照细胞之间具有可比性，但清道夫受体的显著下调除外CD36型(P（P）<0.001）和长链脂肪酸转运蛋白溶质载体家族27成员1的显著上调(SLC27A1型) (P（P）与对照细胞相比，FADS1‐KD细胞<0.001）。参与TG合成的基因编码酶，二酰甘油O-酰基转移酶1(DGAT1公司)基因(P（P）<0.001）和脂滴包衣蛋白、紫苏素2(物价指数2)基因(P（P）<0.001），两者在FADS1‐KD细胞中均显著上调，而TG分泌的标记物，包括载脂蛋白B(亚太经合组织)基因(P（P）<0.001）和跨膜6超家族成员2(TM6SF2型)基因(P（P）<0.001），均显著下调。另一方面，我们研究了FADS1过度表达和DHA治疗对脂肪稳态相关基因水平以及与FADS1‐KD相关的其他肝细胞损伤的影响。瞬态再表达FADS1型在FADS1‐KD HepG2细胞中SREBF1和FASN公司然而，当用DHA处理FADS1‐KD细胞时，两种标记物-SREBF1(P（P）<0.01）和FASN公司(P（P）<0.01）-显著下调。两者的过度表达音量1DHA治疗可以有效地使脂肪酸氧化相关基因的表达正常化（例如。，PPARα、CPT1A、CPT2、HADHA、ECH1). 我们还观察到SLC27A1型(P（P）<0.05）和上调CD36型(P（P）<0.001），当FADS1型该基因过表达或当细胞被DHA处理时。两者的过度表达FADS1型DHA治疗可以有效降低DGAT1公司表达式。然而，PLIN2、APOB、，和TM6SF2型只有当FADS1型重新表达，但在用DHA处理时没有表达（图。​（图3A）。3A级). 综上所述，FADS1‐KD可能通过调节参与脂肪酸氧化和TG合成和分泌的关键基因来增加脂质积累。通过恢复FADS1或DHA补充剂的表达，这种效果可以在很大程度上正常化。

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图3

FADS1‐KD效应的逆转FADS1型HepG2细胞中的过量Exp或DHA治疗。（A） 标记基因在对照细胞、FADS1‐KD细胞、FADS 1-KD过度表达的细胞和用DHA（25μM）处理的FADS1−KD的细胞中的mRNA表达。细胞在常规培养基中与载体或DHA一起培养24小时。这里显示的是显著的基因(*P（P）<0.05）与对照细胞相比，FADS1‐KD细胞中的FADS1−KD基因发生了改变，这也被FADS1过度表达和DHA治疗（基因名称用粗体表示(^# P（P）<0.05）或DHA治疗(^ƚ P（P）<0.05）（标有星号的基因名称）。（B） 使用CM‐H评估HepG2对照细胞和FADS1‐KD细胞的ROS生成₂DCFDA（一般氧化应激指标）和MitoSOX Red（线粒体ROS指标）。使用Hoechst 33342对细胞核进行染色。（C，D）细胞活性氧和线粒体活性氧水平的量化。（E）通过以Cu转化为指标的比色测定法测量的总抗氧化剂水平²⁺到Cu⁺在FADS1‐KD和对照HepG2细胞中，用载体（NT）或含有PA/OA的培养基（所有其他三组）处理24小时。（F） 24小时内，载体（NT）中FADS1‐KD和对照HepG2细胞中的总TG水平以及添加中等水平PA/OA的培养基（其他三组）*P（P）<0.05时**P（P）<0.01，或***P（P）与对照shRNA细胞相比<0.001；^# P（P） < 0.05,^## P（P）<0.01，或^### P（P）与PA/OA处理的FADS1‐KD细胞相比<0.001。显示了三个独立性能的代表性实验（一式三份）的数据。缩写：AO，抗氧化剂；FA，脂肪酸；IRE，肌醇需要酶；线粒体活性氧。

FADS1 KD和其他蜂窝挑战

我们着手进一步探讨FADS1下调对肝细胞损伤潜在的其他细胞变化的潜在影响，包括脂质过氧化、炎症细胞因子水平、抗氧化能力和内质网应激标记物。与对照细胞相比，FADS1-KD细胞中的总丙二醛（MDA）（一种PUFA过氧化和氧化应激标志物）水平没有显著差异（数据未显示）。然而，FADS1‐KD细胞中的细胞间和线粒体ROS水平均显著高于对照细胞（图。3B‐D公司). 此外，未经处理和经PA/OA处理的FADS1‐KD细胞的总抗氧化水平均显著低于对照细胞（图。​（图3E）。第三方). 这与抗氧化介质核红细胞2 p45相关因子2的显著下调一致(NRF2级)基因(P（P）<0.001）在FADS1‐KD单元中（图。​（图3A）。3A级). 同时，我们观察到ER应激标记物显著上调，激活转录因子6(ATF6型)基因(P（P）<0.001）和C/EBP同源蛋白(CHOP）基因(P（P）<0.05）（图。​（图3A）。3A级). 炎症标志物白细胞介素-6的表达显著增加(IL‐6公司) (P（P）<0.001）（图。​（图3A）3A级)在FADS1‐KD单元中。同样，通过FADS1过表达或DHA处理，改变的总抗氧化水平和FADS1‐KD细胞中大多数标记基因的转录被标准化（图。​（图3）。三). 总之，这些数据表明FADS1‐KD显著降低了细胞抗氧化水平，增加了对内质网应激和肝脏炎症的敏感性。

FADS1‐KD导致PPARα‐FGF21轴改变

我们进一步着手研究导致药物敏感性增加的分子机制FADS1型缺乏细胞导致脂质积聚。鉴于PPARα通过FADS1在我们的模型中的表达，我们假设PPARα是FADS1依赖性脂质积聚的关键介质。PPARα是一种配体激活因子，在调节脂肪酸和脂质代谢中起重要作用。EPA、DHA和二十二碳五烯酸已被确定为PPARα的天然配体诱导剂。^{( 18} ， ^{19 )}PPARα调节众多基因，其中FGF21是最重要的效应因子之一。^{( 20} ， ²¹ ， ²² ， ^{23 )}两者都有PPARα(P（P）<0.001）和FGF21号机组(P（P）与对照细胞相比，FADS1‐KD HepG2细胞中的mRNA表达显著下调（图。​（图4）。4). 当音量1当用DHA处理FADS1-KD细胞时，该基因在FADS1-WD细胞中过度表达（图。​（图4A）。4A级). 当用western blot分析PPARα和分泌型FGF21蛋白表达时，也观察到类似的结果（图。​（图4B）第4页)和ELISA（图。​（图4C），4摄氏度)分别是。这些结果表明FADS1型缺陷调节两者PPARα和FGF21号机组mRNA和蛋白质表达水平。因此，PPARα‐FGF21轴对于维持FADS1对脂质积聚的保护作用至关重要。

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图4

FADS1功能调控后PPAR‐α和FGF21的表达。（A） 对照组、FADS1-KD、FADS1‐KD过度表达的FADS1−KD和DHA处理的HepG2细胞中PPAR‐α和FGF21的定量PCR mRNA表达。用中等水平的PA/OA处理细胞24小时。在与（A）相同的条件下处理后，细胞（B）中PPAR‐α（western blot）的蛋白水平和收集的培养基中分泌的FGF21（ELISA）（C）*P（P）<0.05时**P（P）<0.01，或***P（P）与对照组相比，<0.001；^# P（P） < 0.05,^## P（P）<0.01，或^### P（P）与PA/OA处理的FADS1‐KD细胞相比<0.001。显示了三个独立性能的代表性实验（一式三份）的数据。缩写：ACTB，肌动蛋白β。

PPARα是调节FGF21转录的主转录因子。^{( 21} ， ²² ， ²³ ， ^{24 )}为了进一步阐明PPARα对FGF21的调节和转录活性，我们检测了过氧化物酶体增殖物反应元件（PPRE）在细胞内的结合活性FGF21号机组我们的FADS1‐KD和使用EMSA的对照细胞中的启动子区域。为此FGF21号机组含有先前鉴定的启动子寡核苷酸探针^{( 21} ， ²² ， ²³ ， ^{24 )}采用PPRE结合序列。与对照组细胞核提取物相比，FADS1‐KD细胞细胞核提取物的结合活性显著降低（图。​（图5A）。5A级). 以下FADS1型基因在FADS1‐KD细胞中的过度表达，或当FADS1−KD电池用DHA处理时FGF21型与FADS1‐KD细胞相比，启动子探针及其核提取物显著增强（图。​（图5A）。5A级). 这一发现表明，FADS1功能的降低降低了LC-PUFA的数量，如DHA，这进一步降低了PPARα与FGF21号机组发起人，反过来受到下调FGF21号机组表达式。

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图5

FADS1调节PPAR‐α与FGF21启动子的结合亲和力。（A） 对照组、FADS1-KD、FADS1‐KD+过表达和FADS1−KD+DHA处理的HepG2细胞的核提取物与含有PPRE基序的FGF21启动子探针的结合活性。使用过多的未标记探针进行竞争。（B） 用不同浓度的FF（PPARα激动剂）处理的对照组和FADS1‐KD HepG2细胞的核提取物与FGF21启动子PPRE探针的结合活性。（C） 对照组和经对照组和PPAR‐αsiRNA处理的FADS1‐KD细胞的核提取物与FGF21启动子PPRE探针的结合活性。显示了两个独立性能的代表性实验（一式三份）的数据。

为了进一步确认PPARα介导FGF21号机组在FADS1‐KD细胞的核提取物中观察到的启动子结合差异，用PPARα激动剂非诺贝特（FF）处理FADS1−KD和对照细胞（图。​（图5B），5亿)或转染PPARα小干扰RNA（siRNA）（图。​（图5C）。5摄氏度). 在连续浓度FF存在的情况下，FADS1‐KD和对照细胞的核提取物均表现出剂量依赖性增加FGF21号机组启动子与FF浓度增加的结合，证实PPARα与FGF21号机组发起人。相反，当FADS1‐KD和对照细胞转染PPARαsiRNAFGF21号机组FADS1‐KD和对照细胞中的启动子结合活性均显著降低，证实了FGF21号机组基因表达减少导致的启动子结合PPARα这些结果共同表明FADS1型减少FGF21号机组通过下调两者的启动子结合活性PPARα表达和活动。然而，以下是FADS1型重新引入FADS1‐KD细胞，或当FADS1−KD电池用DHA处理时FGF21号机组启动子结合活性恢复。

用PPARα激动剂或FGF21蛋白处理细胞减少FADS1‐KD依赖性脂质积聚

调查是否上调了PPARα‐FGF21在FADS1-KD细胞中，我们检测了FF和FGF21蛋白在改善FADS1-WD细胞中脂质积累方面的作用。FF（50 nM）与PA/OA联合用药可减少FADS1‐KD细胞中的脂质积聚并使其正常化(P（P）<0.01）至对照组水平（图。​（图6A）。第6页). 这表明，增加FADS1‐KD细胞中PPARα的表达和活性可以使细胞免于脂质积聚增加。同样，当用两种不同浓度的PA/OA和FGF21蛋白处理FADS1-KD细胞时，FADS1-WD细胞中的脂质积累水平显著降低(P（P）<0.001）并标准化为控制水平（图。​（图6B）。6亿). 这进一步证实了FADS1‐KD细胞中PPARα和FGF21表达和活性的降低增加了细胞对脂质积聚的敏感性。增强PPARα‐FGF21轴FADS1型缺乏细胞对脂质积聚起保护作用。

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图6

FF（A）或FGF21（B）治疗逆转FADS1-KD效应。对照组或FADS1‐KD HepG2细胞用载体（NT）、中等PA/OA、中等PA/OA+FF（50 nM）或中等PA/OA+FGF21蛋白（10 nM和30 nM）处理24小时*P（P）<0.05时**P（P）<0.01，或***P（P）与对照shRNA细胞相比<0.001；^# P（P） < 0.05,^## P（P）<0.01，或^### P（P）与PA/OA处理的FADS1‐KD细胞相比<0.001。显示了独立性能的代表性实验（一式三份）的数据。

传真1暴露于高脂肪饮食后，空白小鼠表现出肝脂肪增多和高甘油三酯血症

在喂食高脂肪饮食（HFD）长达8周后，野生型（WT）、杂合型（Het）和空白小鼠的体重相似（支持图。S1（第一阶段）A） ●●●●。在HFD 0周、4周或8周时，零小鼠、Het小鼠和WT小鼠的肝脏重量或肝-体重比没有显著差异（支持图。S1（第一阶段）B、 C）。组织学评估用于比较传真1null和WT鼠标。苏木精和伊红染色的肝脏切片显示，在HFD喂养的4周和8周，小鼠没有出现炎症、气球状突起或纤维化（图。​（图7A）。第7章).传真1与喂食HFD 4周的WT小鼠相比，空白小鼠的肝脂滴染色（ORO）增加，与肝脏TG水平升高一致（图。​（图7B）。7亿). 同样，肝脏TG水平的变化与组织学评估一致，显示出从WT到空白小鼠的4周和8周肝脏TG增加的线性趋势（线性趋势P（P）=0.0001和P（P）分别=0.045）（图。​（图7C）。7摄氏度). 有趣的是，在第4周和第8周，肝脏总胆固醇水平也显示出从WT到空白小鼠的线性增加趋势（线性趋势P（P）=0.014和P（P）分别=0.05）（图。​（图7D）第7天)与WT小鼠相比，空白小鼠的肝脏总胆固醇水平显著升高。

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图7

Fads1‐KO对肝脏组织学（A）、脂滴形成（B）、肝总TG（C）和总胆固醇水平（D）的影响。苏木精和伊红染色显示肝脏组织学，ORO染色显示脂质滴。这两种材料均来自喂食HFD 4周的小鼠，组织切片在放大×20倍的条件下观察总TG水平FADS1型用HFD喂养4周和8周的null、Het和WT小鼠*P（P）<0.05或**P（P）与WT小鼠相比，P<0.01。（C，D）数据是通过一次实验生成的，共三次。缩写：wk，weeks。

为了进一步分析传真1空白小鼠，我们测量了WT、Het和空白小鼠的总MDA和总抗氧化水平。WT、Het和空白小鼠的总MDA水平没有显著差异，这在HFD喂养的所有时间点都可以观察到。同样，在喂食HFD 4周和8周时，WT、Het和空白小鼠的总抗氧化水平没有显著差异（数据未显示）。

传真1空白小鼠表现出与脂质代谢相关的基因表达增加

在补充性肝脏分析中，我们分析了4周治疗组小鼠中与脂肪酸氧化、脂肪生成、TG合成和分泌有关的关键基因。的表达式斯雷布1(P（P）<0.05）和Fasn公司(P（P）<0.05）显著上调流行趋势1与WT小鼠相比，为null小鼠。与我们的类似在体外发现，一个关键转录因子Pparα(P（P）<0.001）和脂肪酸氧化转运体Cpt2号机组(P（P）<0.01）在传真1使鼠标无效。的表达式数据网关1(P（P） < 0.05),普林2(P（P）<0.05），以及第4层(P（P）<0.05）在传真1与WT小鼠相比，空白小鼠的TG合成和脂滴形成增加。然而，与TG分泌有关的标记物没有显示出任何显著变化。综上所述，这些结果表明传真1敲除（KO）小鼠通过改变脂肪生成、脂肪酸氧化、TG合成和储存相关基因的功能，导致TG积累增加。此外，两种炎症标记物的表达，镉68(P（P）<0.001）和伊尔-6(P（P）<0.01），在传真1与WT小鼠相比，尽管未观察到肝脏切片中的炎症组织学变化，但结果为null小鼠。此外，ER应激标记的表达没有显著差异附件6Fads1 null和WT小鼠之间的表达水平（图。​（图8A8安).

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图8

Fads1‐KO对null和WT小鼠（喂食HFD 4周）肝组织中标记基因表达（定量PCR mRNA水平）（A）以及Ppar‐α和Fgf21蛋白水平的影响（B）*P（P）与WT相比<0.05。数据是通过一次实验生成的，共三次。缩写：缩写：Actb，actin beta；Scd1，硬脂酰辅酶A去饱和酶。