从细胞质到内质网的乙酰辅酶A通量调节分泌途径的参与和质量

AT-1活性的改变导致ER、ERGIC和高尔基体的形态重组

接下来，我们使用上述小鼠模型中的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）来确定确定的蛋白质组变化是否影响分泌途径的功能组织。结构照明显微镜（SIM）显示AT-1 sTg MEF的粗略内质网内池扩大（图2a） ●●●●。成功折叠的内质网转运蛋白在被称为内质网出口位点（ERES）的特殊内质网结构中被捕获，然后由COPII包被的转运载体顺行转运至ERGIC，然后再转运至高尔基体^20–22为了确定粗略ER的膨胀是否与ERES/COPII结构的增加相一致，我们探索了COPII涂层的几个成员，包括第13节、第31节、第23节、第24节和第16节。然而，我们没有发现个别穿孔数量的主要差异（图2b–f，补充图。^{S1（第一阶段）}a-d），也不在Sec13和Sec31的共同定位中（图2g、 补充图。^{S1（第一阶段）}a） 反映了COPII外层的形成¹⁹或共同定位Sec23和Sec24（图2h、 补充图。^{S1（第一阶段）}b） ，反映了内部COPII涂层的形成²³同样，第31节和第24节的共同定位也没有变化（图2i、 补充图。^{S1（第一阶段）}c） 或Sec13和Sec16（图2j、 补充图。^{S1（第一阶段）}d） 反映了内涂层与外涂层的装配以及过渡ER处的萌芽事件²⁴总的来说，这些结果表明，在两种AT-1模型中，COPII货物结构的数量和装配没有重大变化。

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图2

异常AT-1模型中ER、ERGIC和高尔基体的形态学重组。(一)使用ER3-mCherry（比例尺，3µm）的初级培养MEF中具有代表性的ER形态。白色星号（*）表示核周粗面内质网内的池扩大。显示WT和AT-1 sTg的高放大区域（比例尺，2µm）。(b条–（f）)使用SIM显微镜对原代培养MEF中的点状突起进行量化(b条)第13节punta（n=14 WT；n=13 AT-1 sTg；n=10 AT-1^S113R型/+), (c（c）)第31节punta（n=25 WT；n=20 AT-1 sTg；n=21 AT-1^S113R型/+), (d日)第23节punta（n=4 WT；n=7 AT-1 sTg；n=5 AT-1^S113R型/+), (e（电子）)Sec24点（n=12 WT；n=15 AT-1 sTg；n=14 AT-1^S113R型/+), (（f）)第16节punta（n=19 WT；n=15 AT-1 sTg；n=14 AT-1^S113R型/+). (克–j个)使用SIM显微镜显示的原始培养MEF的皮尔逊点状系数(克)第31节和第13节punta（n=8 WT；n=7 AT-1 sTg；n=5 AT-1^S113R型/+), (小时)第23节和第24节punta（n=4 WT；n=7 AT-1 sTg；n=5 AT-1^S113R型/+), (我)第31节和第24节punta（n=8 WT；n=8 AT-1 sTg；n=9 AT-1^S113R型/+), (j个)泪点Sec13和Sec16（n=6 WT；n=6 AT-1 sTg；n=5 AT-1^S113R型/+). (k个)使用ERGIC-53抗体（比例尺，3µm）对原代培养MEF中的ERGIC形态进行检测，并使用Imaris重建穿孔体积和数量进行量化（n=7 WT；n=7 AT-1 sTg；n=7 AT-1^S113R型/+). (我)使用GM130抗体（标尺，3µm）对原代培养MEF中的高尔基体形态进行检测，并使用Imaris体积和面积重建进行量化（n=11 WT；n=12 AT-1 sTg；n=12 AT-1^S113R型/+). (米)WT、AT-1 sTg和AT-1 MEF的代表性电子显微镜^S113R型/+黄色表示高尔基体结构，橙色表示紊乱的分泌结构和小泡。（比例尺，500 nm）。每种基因型的3只生物独立动物的多个细胞MEF(b条–我). 单向方差分析*P<0.05**P<0.005。

接下来，我们将SIM与抗ERGIC-53和抗GM130抗体一起使用，以分别确定ERGIC和高尔基体水平的结构变化。结果显示AT-1 sTg中ERGIC室显著扩张（图2k） AT-1高尔基体的体积和表面积显著减少^S113R型/+（图2l） ●●●●。AT-1 sTg小鼠内质网和高尔基体附近存在大量类似ERGIC结构的小泡，AT-1中高尔基体结构紊乱且稍小，支持上述SIM发现^S113R型/+用电子显微镜观察小鼠（图2m） ●●●●。

总之，上述基于显微镜的研究揭示了AT-1 sTg中ER和ERGIC的扩张以及AT-1中高尔基体的减少^S113R型/+老鼠。总的来说，他们支持这样的结论，即乙酰辅酶A的细胞溶质到内质网流量的变化，由AT-1活性的增加或减少决定，调节分泌途径的组织。

AT-1活性改变扰乱正常蛋白质运输

为了确定上述分泌途径的结构重组是否突出了AT-1模型中蛋白质运输的变化，我们使用了一种先前表征的诱导型ER释放系统，该系统采用了条件聚集结构域（CAD）、FKBP（F_M（M）)融合到感兴趣的蛋白质^25,26.F_M（M）结构域在内质网中二聚并抑制内质网外的转运。这种二聚必须用CAD配体溶解，才能从内质网释放感兴趣的蛋白质。

检查ER的初始萌芽事件（图三a、 实验1），我们使用4×F_M（M）-mCh-NL1型²⁶，使得与mCherry结合的神经胶质蛋白可以在其离开ER时被可视化。使用这种策略，我们没有观察到货物速度的差异（图三b） 货物释放百分比（图三c） WT和任一AT-1模型之间。与COPII蛋白的显微镜观察结果一致（图2b–j，补充图。^{S1（第一阶段）}a-d），这些结果表明，在两个AT-1模型中，从过渡ER形成的COPII结构得到了全面保留。

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图3

异常的AT-1模型显示通过分泌途径改变了蛋白质运输。(一)用于评估分泌途径中蛋白质运输的三个实验示意图。实验1评估ER释放后的蛋白载体；依赖于增溶剂的货物发出荧光以进行可视化。实验2量化了ER货物在高尔基体中积累然后离开的时间；依赖增溶剂的DsRed货物运输至GFP标记的高尔基体。实验3量化了ER货物到达细胞表面的时间；在成像之前，添加HaloTag细胞不渗透染料，追踪含有HaloTag-配体的可溶性依赖性货物70分钟。(b、 c（c）)货物释放的最大速度(b条)以及货物放行百分比(c（c）)，在增溶剂诱导的MEFs中的货物释放后跟踪3分钟（对于每个基因型n＝14 WT，来自3只生物独立动物的多个细胞的MEFs；n=20 AT-1 sTg；n=18 AT-1^S113R型/+; 每组3只生物独立动物的MEF细胞(b条,c（c）). 学生的T测试。(d日)代表性货物（红色）每2分钟在高尔基（绿色）堆积一次，在WT、AT-1 sTg和AT-1的MEF中堆积30分钟^S113R型/+（比例尺，40µm）。(e（电子）)初级培养MEF中高尔基体中30分钟以上的货物积累（每个时间点每个基因型的3只生物独立动物的多个细胞的MEF，n=27 WT；n=22 AT-1 sTg；n=23 AT-1^S113R型/+). 在每个时间点表示SEM的平均值。(（f）)WT、AT-1 sTg和AT-1的MEF中L1CAM的代表性表面贩运^S113R型/+（比例尺，40µm）。(克)MEF中细胞表面的L1CAM强度（每个时间点每个基因型来自3只生物独立动物的多个细胞的MEF，n=42–76 WT；n=10–27 AT-1 sTg；n=19–34 AT-1^S113R型/+). 在每个时间点用SEM表示平均值。双向方差分析，在每个时间点进行多次比较(e（电子）,克). 紫色和橙色统计数据表明AT-1 sTg和WT之间以及AT-1之间的差异^S113R型/+和WT。灰色统计显示AT-1 sTg和AT-1之间的差异^S113R型/+.*P<0.05**P<0.005；^#P<0.0001。

接下来，评估ER-Golgi贩运（图三a、 实验2），我们使用DsRedExpress2-FKBP（LV）-GalNAcT2-msGFP2构建物表达DsRed货物蛋白和GFP结合的GalNAcT，该GalNAc T位于反式-高尔基。释放前，内质网中DsRed的分布和高尔基体中GFP的分布没有实质性重叠，表明两个探针成功隔离。CAD可用后2-4分钟，所有基因型都在高尔基体中积累。然而，在18分钟及以后，WT显示货物从高尔基体分散，而at-1 sTg和at-1^S113R型/+没有（图三d、 e），强调了两种AT-1机型退出高尔基器械的延迟。

最后，评估蛋白质向质膜的转运（图三a、 实验3），我们使用了4xF_M（M）-HaloTag-L1CAM构造包含HaloTag，在细胞表面用细胞不渗透染料标记。添加DDS以启动货物释放，从释放后20到70分钟，每10分钟观察一次细胞。在WT-MEFs中，细胞表面L1CAM表达强度随时间稳步攀升（图三f、 g），最陡坡度为20–50 min，最大强度为50–70 min（图三f、 g）。相比之下，在AT-1中^S113R型/+MEF、L1CAM显示向细胞表面的转运延迟了40分钟，然后在50–70分钟时几乎恢复到WT水平（图三f、 g）。最重要的是，在整个实验设置中，AT-1 sTg MEF仍远低于WT（图三f、 g）显示L1CAM递送到细胞表面的显著延迟。

上述结果表明，两种AT-1模型都能有效地将新生糖蛋白从内质网运输到高尔基体，但在通过高尔基体时发生了重要的变化。尤其重要的是在AT-1 sTg小鼠中观察到高尔基体到细胞表面转运的延迟。这些数据提出了一个问题，即高尔基体内N-糖基化货物蛋白翻译后处理缺陷是否是导致转换和传递缺陷的原因。

异常的AT-1模型显示高尔基依赖性N-聚糖修饰的缺陷和分泌体质量的改变

初始GlcNAc₂男人₉Glc公司_三当糖蛋白在内质网和高尔基体中移动时，由OST添加到内质网中的寡糖结构发生重大修饰。具体来说，三端葡萄糖被去除，高甘露糖结构被修饰以允许最终修饰，包括在顺式/内侧-高尔基体和唾液酸反式-高尔基和反式-高尔基网络²⁷重要的是，寡糖链定义了糖蛋白的许多功能和活性^28–30因此，低聚糖链的复杂性可以作为高尔基体有效过渡的标志，也可以直接衡量分泌体的质量（补充图。^S2系列).

为了解决分泌组的质量问题，我们开发了一种新的集成工作流程，允许对组织中的N-糖蛋白组进行全局分析。该方法使用顺序亲水相互作用色谱法（HILIC）富集糖肽，并结合电子转移高能碰撞解离（EThcD）³¹HILIC允许在LC-MS/MS分析之前对N-糖肽进行特定和增强的富集，而EThcD通过将聚糖和肽解离产生的片段离子合并到一个光谱中，对完整的N-糖肽实现高度自信的位点特异性表征。

两者都是人类^9–13和鼠标^4,5数据表明，神经系统特别容易受到AT-1活性变化的影响。此外，神经元通过改变蛋白质组的表达对AT-1的过度表达作出反应，并建立更多的树突和突触终末，这些终末严重依赖于分泌途径的参与⁵因此，我们决定研究AT-1 sTg和AT-1大脑中N-糖蛋白组的质量^S113R型/+老鼠。

我们发现雌性的175和255种糖型发生了显著变化（图4a） 和雄性（图4b） AT-1 sTg皮层和126和60个雌性糖形体（图4c） 和男性（图4d） 自动液位计-1^S113R型/+皮质。在雌性和雄性AT-1 sTg小鼠的海马中观察到类似的结果，其中180和112个糖型受到影响，179和214个糖型受影响^S113R型/+小鼠（补充图。^第3章a-d）。

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图4

AT-1 sTg和AT-1^S113R型/+在许多皮层糖型中显示N-糖蛋白质组学变化。(一,b条)火山图显示AT-1 sTg皮层中所有定量糖蛋白(一)女性（n=3）和(b条)男性（n=3），与年龄匹配的WT室友相比。统计上有意义的蛋白质（女性175个，男性255个）用黄色突出显示，所有其他蛋白质用蓝色表示。学生T检验，P<0.05。(c（c）,d日)火山图显示AT-1皮层中所有定量糖蛋白^第113页/+(c（c）)女性（n=3）和(d日)男性（n=3），与年龄匹配的WT室友相比。统计意义重大的蛋白质（女性126个，男性60个）以黄色突出显示，所有其他蛋白质以蓝色表示。学生T检验，P<0.05。(e（电子）–小时)已识别的聚糖分为五种聚糖类型，并按皮层中已识别的糖总量进行划分(e（电子）)AT-1 sTg母头(（f）)AT-1 sTg公头(克)自动液位计-1^S113R型/+女性，以及(小时)自动液位计-1^S113R型/+男性。(我–l）在皮质中发现了每个糖苷的大量聚糖(我)AT-1 sTg母头(j个)AT-1 sTg公头(k个)AT-1型^S113R型/+女性，以及(我)自动液位计-1^S113R型/+男性。(米–第页)皮质中每种蛋白质都有显著的糖苷(米)AT-1 sTg母头(n个)AT-1 sTg公头(o个)自动液位计-1^S113R型/+女性，以及(第页)自动液位计-1^S113R型/+男性。

N-聚糖根据其生物成熟度从最不成熟到最成熟进行分类：高甘露糖、少甘露糖，复合/杂交，岩藻糖和唾液酸（补充图。^S2系列). 有趣的是，我们在大脑皮层和海马中观察到的糖基化特征的大多数变化似乎发生在高尔基界面（图4e–g和补充图。^第3章e-h；另请参见补充图。^S2系列). 岩藻糖转运蛋白（SLC35C1）、岩藻糖基转移酶（FUT8）、唾液酸转运体（SLC35A1）、唾液酰基转移酶（ST3GAL3、ST6GAL1、ST6GAL2）、半乳糖转运蛋白，也不是半乳糖转移酶（B4GALT2、B4GALT4）（补充图。^S4系列).

为了评估糖组的异质性，我们量化了每个糖苷的糖链的显著变化（图4i–l）。AT-1 sTg公头和AT-1^S113R型/+女性表现出最高的异质性，23%和27%（分别）的糖苷在一个糖苷上有一个以上的聚糖结构发生显著变化。自动液位计-1^S113R型/+女性在单个蛋白质上的多糖基改变比例最高（33%的蛋白质显示不止一个糖基受到影响）。然而，受影响的一种蛋白质上的多糖基的异质性在模型和性别之间都是普遍存在的（图4m–p）。这些结果在海马体中相对一致（补充图。^第3章i-p）。总之，这些发现说明了由AT-1活性变化引起的N-聚糖修饰的异质性和复杂性；一个糖苷上的多个聚糖会发生变化，每个蛋白质的糖苷数量也会发生变化。

为了深入了解糖苷特异性变化，我们检查了聚糖类型分布，因为它们与每个蛋白质受影响的位点数量有关。AT-1 sTg雌性皮层显示唾液酸分布均匀，而岩藻糖、高甘露糖和复合/杂交物种在每个蛋白质的多个位点上的表现更高（图5a） ●●●●。这些发现可能突出了由高尔基体内糖蛋白的缺陷转化所引起的个体糖基化事件的特异性变化。比较AT-1 sTg和AT-1的雌性皮层^S113R型/+小鼠，同样，大多数岩藻糖和复合物/杂种出现在每个蛋白质的多个位点上；然而，唾液酸和高甘露糖在每个蛋白质的一个位点和多个位点之间分布均匀（图5c） ●●●●。AT-1 sTg雄性皮层显示，大多数岩藻糖和复合/杂交聚糖位于每个蛋白质的多个糖苷上，而高甘露糖和唾液酸在许多位点上分布均匀（图5b） ●●●●。AT-1中的极少数聚糖类型^S113R型/+男性大脑皮层显示出除高甘露糖外的所有聚糖类型的均匀分布，高甘露醇仅存在于每个蛋白质的一个位点上（图5d） ●●●●。在不同模型的海马体中观察到总体上类似的结果，但只有微小的差异（补充图。^第5章).

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图5

AT-1 sTg和AT-1^S113R型/+显示高度异质的皮层分泌体。(一–d日)绘制为皮质糖蛋白的重要聚糖类型网络(一)AT-1 sTg母头(b条)AT-1 sTg公头(c（c）)自动液位计-1^S113R型/+女性，以及(d日)自动液位计-1^第113页/+男性。圆圈代表聚糖类型，每个节点代表一个特定的聚糖树。聚糖与其蛋白质相交，由糖蛋白上识别的糖苷数量组织。(e（电子）–小时)根据皮层GO细胞成分术语定义的亚细胞定位的糖基化分布(e（电子）)AT-1 sTg母头(（f）)AT-1 sTg公头(克)自动液位计-1^S113R型/+女性，以及(小时)自动液位计-1^S113R型/+男性。

为了了解在整个分泌体内观察到的变化的生物学相关性，所有糖类都根据其GO细胞隔室术语归类为亚细胞位置。在AT-1模型和性别中，表现出最大变化的亚细胞位置包括囊泡、细胞外间隙、神经和质膜（图5e–h）。海马体也观察到类似的结果（补充图^第5章e、 f、g、h）。尽管存在一些内在差异，但在遗传模型、大脑区域和性别之间观察到的大多数显著变化都是由岩藻糖、唾液酸和高甘露糖引起的（图5e–h和补充图^第5章e、 f、g、h）。此外，在这些分析中，我们发现大量聚集在质膜和细胞表面亚群中的蛋白质中存在高甘露糖结构。因此，高尔基依赖性糖基化事件似乎受到更大的影响，而在我们的遗传模型中，依赖于高尔基对质膜成功转运的细胞隔室/途径似乎受到更显著的影响。

迄今为止所讨论的适应性表明，AT-1 sTg和AT-1中类似的通路和亚细胞位置受到影响^S113R型/+为了确定所有组之间是否存在一致性，我们根据重叠的糖类的亚细胞位置检查了它们，考虑到与WT相比糖蛋白的表达是增加还是减少。有趣的是，AT-1 sTg和AT-1之间的差异最大（相反）的变化^S113R型/+包括囊泡、细胞外、神经和质膜隔室，如前所述，这取决于高尔基体对质膜的成功转运（图6a） ●●●●。相反，溶酶体和高尔基亚群的变化最为集中（图6a） ●●●●。这些差异和相似性在性别和大脑区域中保持不变，从而突出了特定的生物反应。

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图6

AT-1 sTg和AT-1^S113R型/+在亚细胞位置上显示发散性和会聚性N-糖组学变化。(一)比较AT-1 sTg和AT-1中发现的重要糖类之间的距离^S113R型/+按性别和大脑区域划分。根据它们的亚细胞位置计算距离，深色表示相似性较高。(b条,c（c）)重要糖蛋白(b条)和糖苷(c（c）)重叠在模型层面上进行了检查（at-1 sTg v.at-1^S113R型/+)大脑区域（皮层vs.海马体）和性别（女性vs.男性）。上部条形图表示交叉点的大小，左侧条形图表示重要糖蛋白的总数(b条)或糖苷(c（c）)在每个数据集中。

对糖蛋白和糖苷进行分析时，我们观察到糖蛋白中28%（女性）和17%（男性）的收敛性变化，以及AT-1 sTg和AT-1皮层中14%（雌性）和10%（男性）糖苷的收敛性改变^S113R型/+鼠标（图6b、 c）。海马体中也观察到类似的趋势，糖蛋白改变时有35%（女性）和20%（男性）重叠，但受影响的糖蛋白只有4%（女性）与12%（男性）的重叠（图6b、 c）。当我们比较大脑皮层和海马之间的重叠时，AT-1 sTg小鼠的糖蛋白重叠率为32%（雌性）和19%（雄性），糖苷重叠率为15%（雌性）与11%（雄性6b、 c）。类似地，AT-1^第113页/+小鼠的糖蛋白重叠率为24%（雌性）和19%（雄性），糖苷重叠率为13%（雌性）与11%（男性）。

小鼠胚胎成纤维细胞分离

先前描述了小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的分离⁴简言之，胚胎是在胚胎期12.5至13.5天从怀孕的雌性体内采集的。胚胎（没有头部或内脏器官）在无菌EDTA（0.25%；Mediatech）中切碎，然后在37°C CO中孵化₂培养箱30–45分钟。使用完整的MEF培养基（DMEM-高糖，10%FBS，青霉素/链霉素/谷氨酰胺混合物，真菌酮）来淬灭胰蛋白酶；通过轻轻移液进一步破坏组织。以1000 rpm旋转细胞5分钟，然后丢弃上清液。细胞再次在MEF培养基中清洗，然后进行电镀。用胰蛋白酶-EDTA以1:4的稀释度传代融合细胞。

乙酰化化学计量学

乙酰化化学计量学的量化遵循前面描述的方法，并进行了以下修改^14,38,39在尿素缓冲液（8 M尿素（去离子）、100 mM碳酸氢铵（pH=8.0）、5 mM DTT）中变性线粒体和细胞溶质亚细胞组分的肝蛋白样品（200μg），并在60°C下培养20分钟⁴⁰半胱氨酸用50 mM碘乙酰胺烷基化，然后培养20分钟。两轮约20µmol重同位素D₆-醋酸酐（剑桥同位素实验室）对样品进行化学乙酰化，然后使用100 mM碳酸氢铵（pH=8.0）将样品稀释至2 M尿素，然后在37°C下用1:100胰蛋白酶消化4小时。在用1:100 gluC进行第二次消化之前，将样品稀释至1 M尿素。使用岛津LC-20AT HPLC系统和Phenomenex Gemini NX-C18色谱柱（5µm，110Å，150×2.0 mm）将化学乙酰化肽分为6个组分。数据相关采集（DIA）分析由Thermo Q-Exactive Orbitrap与Dionex Ultimate 3000 RSLC纳米UPLC耦合进行，UPLC采用Waters-Atlantic反相色谱柱（100μm×150 mm）。生成了一个包含所有轻和重乙酰赖氨酸特征对的光谱库，以使用公开可用的MaxQuant（v1.6.1）软件包对DIA光谱进行解卷积和分析。用C处理光谱库样品¹²-醋酸酐（Sigma），但在其他方面与实验样品相同，并使用数据相关采集（DDA）质谱分析进行分析。线粒体和细胞溶质组分的DDA序列形成了一个组合文库。重乙酰片段离子对是在硅中产生的，使得光谱库将包含轻（内源性）乙酰化峰和重（化学）乙酰化峰。Spectronaut（v10）使用生成的光谱库处理实验样品。亚细胞组分实验样本使用内部R脚本单独处理，可以通过GitHub链接访问该脚本：[http://doi.org/10.5281/zenodo.3238525]; 利用内源性（轻）碎片离子峰面积与总（内源性和化学）碎片离子峰值面积的比值计算化学计量学。将所有组分合并进行下游分析。如果出现以下情况，则将蛋白质过滤为显著变化P（P） < 与WT相比，0.05。原始数据、处理数据、光谱库和详细说明Spectronaut分析设置的分析日志已通过数据集标识符为PXD014013的MassIVE合作伙伴存储库存放到ProteomeXchange Consortium[http://proteomecentral.proteomexchange.org/cgi/GetDataset？ID=PXD014013].

定量蛋白质组学

前面描述了蛋白质组的量化¹⁴简单地说，将细胞液、线粒体和细胞核的肝脏样品均质化，然后溶解（8 M尿素、50 mM Tris、pH=8、5 mM CaCl₂，20 mM NaCl，1片不含EDTA的罗氏蛋白酶抑制剂片和1片罗氏PhosSTOP磷酸酶抑制剂片），带探针声波仪。将粗裂解物离心（14000×克; 5分钟），并通过Pierce BCA蛋白质测定法（Pierce，Rockford，IL）测量上清液蛋白质浓度。在5 mM二硫苏糖醇（DTT）中减少400μg蛋白裂解物，然后在15 mM碘乙酰胺（IAA）中进行烷基化，通过添加DTT至5 mM进行淬火，并用Tris缓冲液（pH=8）稀释至0.9 M尿素。蛋白质用胰蛋白酶消化（普罗米加，麦迪逊，威斯康星州），并通过添加三氟乙酸（TFA）至最终浓度0.3%进行猝灭，然后用C18 SepPak滤筒进行脱盐（沃特斯，米尔福德，马萨诸塞州）。在标记之前，将肽真空干燥并在0.5 M TEAB中重新配制。样品被分配到两批4-丛二甲基亮氨酸（DiLeu）标签中，每批标签均为生物副本。将4 mg每个DiLeu标记悬浮在无水DMF、4-（4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基）-4-甲基-吗啉四氟硼酸盐（DMTMM）和N-甲基吗啉（NMM）中，以0.6×摩尔比，然后旋转并离心。将上清液与每种条件下的400μg胰蛋白酶肽混合。肽以10:1的标记物与肽质量比进行标记，然后通过加入5%NH进行涡旋和猝灭₂OH至最终浓度0.25%。采用强阳离子交换液相色谱法（SCX-LC）和PolySULFOETHYL a色谱柱（200 mm×2.1 mm，5μm，300μm，PolyLC，Columbia，MD）纯化4-多元混合物。收集并清洗标记的肽，并使用Kinetex C18色谱柱（5μm，100？，Phenomenex，Torrance，CA）和pH=10.在0.1%甲酸（FA）中重组肽，并使用Orbitrap Fusion Lumos Tribrid质谱仪（加利福尼亚州圣何塞市赛默飞世尔科学公司）与Dionex Ultimate 3000 UPLC系统（加利福尼亚州圣何塞市赛默飞世儿科学公司）接口进行反相LC-MS/MS分析。将肽加载到一个微柱上，该微柱由桥接乙烯杂化C18颗粒（1.7μm，130º，Waters）定制填充。用90 min梯度分离标记肽。肽前体的调查扫描米/z执行350至1500次，AGC目标为2×10⁵最大注入时间为100 ms。选择前20个强前体离子进行HCD裂解。原始文件使用Proteome Discoverer 2.1引擎（Thermo Fisher Scientific，加州圣何塞）和Byonic搜索引擎（Protein Metrics Inc，加州圣卡洛斯）进行处理。使用Uniprot搜索光谱小家鼠数据库。肽N末端和赖氨酸残基（+145.12801 Da）上的二亮氨酸标记和半胱氨酸残基（+57.02146 Da）的氨基甲酰化被认为是固定修饰。将鉴定结果过滤至1%肽和蛋白质FDR。蛋白质组发现仪用于定量；只考虑了包含所有报告离子通道的PSM。将蛋白质组的报告离子比值导出到Microsoft Excel中，并将所有组分组合用于下游分析（有关处理，请参阅统计部分）。使用Fisher方法测定重要蛋白质(P（P） < 0.05). 质谱蛋白质组学数据已通过数据集标识符为PXD013736的PRIDE合作伙伴存储库存入ProteomeXchange Consortium[http://proteomecentral.proteomexchange.org/cgi/GetDataset？ID=PXD013736].

二亮氨酸标记和糖组学

12-丛二亮氨酸⁴¹按照之前的报告进行标记¹⁴简单地说，AT-1 sTg、AT-1脑区解剖样本^S113R型/+和WT小鼠模型均化，然后用探针声波仪在8M尿素缓冲液中进行裂解。含有蛋白质的裂解液在室温下用5 mM二硫苏糖醇（DTT）还原1 h，然后在15 mM碘乙酰胺（IAA）中在黑暗中烷基化30 min。通过将DTT添加到5 mM来猝灭烷基化。将烷基化蛋白稀释，然后用胰蛋白酶（Promega，Madison，WI）在37°C下以1:50酶蛋白比消化18小时。用C18 SepPak滤筒（Waters，Milford，MA）对色氨酸肽进行脱盐，在真空下干燥，并在标记前在0.5 M TEAB中重新配制。

将DiLeu标记悬浮在无水DMF中，并与4-（4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基）-4-甲基-吗啉四氟硼酸盐（DMTMM）和N-甲基吗啉（NMM）以0.6倍于标记的摩尔比率结合。将混合物在室温下涡旋1小时。离心后，立即将上清液与一种条件下的胰蛋白酶肽混合（10:1标记为肽w/w），并在室温下旋转2小时。反应被NH猝灭₂哦。每批标记肽分别组合成12复合体混合物。

糖肽富集

按照之前报告的程序，使用内部包装的SAX-HILIC SPE尖端富集DiLeu标记的糖肽，并进行少量修改^42,43将.3 mg棉絮插入200µL TopTip中。SAX LP块体材料以10 mg/200µL浆料的形式分散在1%TFA中，并在剧烈涡流下活化15分钟。活化后，将60µL浆料添加到纺纱带中。以1200 rpm离心2 min，去除溶剂，然后将SAX材料填充在尖端顶部。然后用300μL 1%TFA和300μL负载缓冲液（80%ACN，1%TFA）对固定相进行调节，每个重复3次。将2 mg DiLeu标记肽校准至200µg。将每等分试样溶解在300µL加载缓冲液中，并通过1200 rpm离心2 min将其加载到尖端上；收集并再次加载流经的液体，以确保完全保留。然后用300µL负载缓冲液清洗尖端共6次，然后在四个单独的PE管中收集300µL70%ACN（含0.2%FA）、53%ACN（含有0.2%FAs）、30%ACN（带有0.2%FAS）和5%ACN（带0.2%FA斯）的四个洗脱部分。在MS分析之前，将十份等分样品中的相应部分合并并在真空下干燥。

完整糖肽的LC-MS/MS分析

在0.1%FA中重组每个组分中的浓缩糖肽，并使用Orbitrap Fusion Lumos质谱仪（加利福尼亚州圣何塞市赛默飞世尔科学公司）与Dionex Ultimate 3000 UPLC系统（加利福尼亚州圣何塞市赛默飞世儿科学公司）接口进行反相LC-MS/MS分析。肽在15 cm长、75μm i.d.定制包装的BEH C18（1.7μm，130μm，Waters）毛细管柱上分离，80 min梯度为0至30%ACN（0.1%FA）。质谱仪以前20位数据相关采集模式运行，HCD产品相关-EThcD片段⁴⁴.肽前体的调查扫描米/z400至2000次，分辨率为120 K，AGC目标为4×10⁵最大注入时间为150ms。串联MS采集的分辨率为60 K，AGC目标为5×10⁴动态排除12 s的10 ppm质量公差。选择了前20个强前体离子，并以33%的归一化碰撞能量进行HCD碎裂。如果HCD调查扫描检测到完整糖肽的特征氧原子离子（HexNAc 204.087 m/z、HexNAcHex 366.140 m/z、HexNAc片段138.055 m/z和168.065 m/z），则触发EThcD杂交片段。当前驱体电荷状态为z=2、3–5或6–7时，ETD反应时间设置为30、20或10 ms。HCD补充活化能为33%。HCD调查扫描和EThcD扫描的最大离子注入时间分别为125和250 ms。

糖蛋白组数据处理

原始文件通过嵌入Proteome Discoverer 2.1（Thermo Fisher Scientific，San Jose，CA）中的Byonic搜索引擎（Protein Metrics Inc，加州圣卡洛斯）进行处理。针对SwissProt搜索光谱小家鼠蛋白质组数据库（2016年8月13日；24903条）。胰蛋白酶消化缺失卵裂设置为<3。母体质量误差公差为10ppm，片段质量公差为0.01Da。固定修饰被指定为C残基上的氨基甲酰化（+57.02146 Da）和肽N末端和K上的12重二亮氨酸（+145.12801 Da）。动态修饰包括M（+15.99492 Da，rare1）的氧化、N或Q的脱酰胺（+0.984016 Da，reare1）和N糖基化（common1）。聚糖修饰被指定为拜恩嵌入式哺乳动物N-聚糖数据库（309个条目）。将鉴定物过滤至1%蛋白质FDR。使用Perseus软件进行糖蛋白的基因本体注释和糖肽定量结果的Student t检验⁴⁵Riley等人报告了分析大规模特定位点糖组学数据的有用工具⁴⁶。结果由内部编写的R脚本进一步处理。根据聚糖组成，糖肽被专门分为五类聚糖：（1）唾液酸（含NeuAc/NeuGc），（2）岩藻糖（含岩藻糖），（3）复合物/杂交物（>2 NeuAc），（4）高甘露糖（2 NeuAc和>5 Hex），以及（5）少甘露糖。N-糖蛋白组学数据已通过数据集标识符为PXD019770的PRIDE合作伙伴存储库存入蛋白质组Xchange联盟[http://proteomecentral.proteomexchange.org/cgi/GetDataset？ID=PXD019770].

定量采集后数据集分析

蛋白质组和乙酰蛋白质组如前所述进行分析¹⁴。使用通路分析期间出现的KEGG通路确定聚类分析^47,48对于分泌途径相关簇，在AT-1模型和蛋白质组或乙酰化学计量学中的以下KEGG途径中发现的所有蛋白质都包括在内：ER中的蛋白质加工、核糖体、蛋白酶体、剪接体和RNA转运。这些蛋白质是STRING分析的输入。没有相互作用的蛋白质被隐藏，所需的最低相互作用分数设置为高置信度（0.7）。活动交互源包括除文本挖掘之外的所有源。

为了确定糖组数据的亚细胞定位，根据Uniprot GO Cellular Component注释对蛋白质进行分类。如前所述，蛋白质被包括在以下类别中¹⁴：“质膜”；“其他膜”（包括GO术语，“膜”一词不包括质膜）；“神经”（包括包含“轴突”、“神经”或“髓磷脂”的GO术语）；“ER”（包括任何包含“内质”的术语）；“高尔基体”（包括包含“高尔基”但不包含“内质”的术语）；“细胞表面”（包括任何包含“表面”的GO术语）；“突触”、“细胞外”、“囊泡”、“溶酶体”和“分泌”（包括各自名称的术语）；和“未列出”（包括任何不包含其他11个亚细胞群的GO术语）。使用igraph和ggnetwork文库在R 3.6.0中创建了显著改变的糖肽的蛋白聚糖网络（p<0.05）。糖肽的亚细胞位置根据GO细胞成分术语按照与（Riley）中相同的规则进行分组⁴⁶计算了不同定量实验中重要糖肽亚细胞群之间的成对欧氏距离。每个GO组被视为一个1707维载体，每个糖肽作为一个方向。维度向量是由样本中显著改变的糖肽联合集构建的。对于相应的上调或下调糖肽，维度的大小为+1或-1。使用R Studio中的UpSetR包创建了详细描述数据集之间显著改变的糖蛋白和糖苷重叠的翻转图。KEGG途径富集和可视化针对肌肉Mus Musculus用clusterProfiler文库进行基因分析，Benjamini–Hochberg将FDR调整为0.05⁴⁶.

免疫细胞化学

用携带ER3-mCherry融合蛋白、KDEL和ER信号肽（Michael Davidson的礼物；Addgene plasmid#55041）的质粒转染培养的原代MEF细胞，或用CellLight Golgi-GFP BacMam 2.0转染({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“C10592”，“term_id”：“1535663”，“term_text”：“C10592”}}10592元，ThermoFisher Scientific）过夜。然后将盖玻片用多聚甲醛固定10分钟（4%，15710，Electron Microscopy Sciences），并用0.1%Triton TM-X100（Roche Applied Science）透化5分钟，然后在封闭缓冲液（10%BSA，PBS中的5%山羊血清）中孵育1小时。所有抗体在抗体稀释缓冲液中稀释（1%BSA，5%山羊血清，PBS），并用ERGIC-53（E1031，Sigma-Aldrich，1:80）、Sec13（A303-980A，Bethyl Laboratories或H00006396-B02P，Novus Biologicals，1:50）、Sec16（A300-648A，Bethel Laboratories.1:50）和Sec31A（sc-136233，SantaCruz Biotechnology，1:50，第24C节（A304-760A，Bethyl Laboratories，1:50）、第23节（ab99552，Abcam，1:50。将细胞在PBS中清洗三次，并与二级抗体AlexaFluor488（A-11034，1:1000）和AlexaFluxor647（A-21463或A-21447，1:100）孵育一小时。细胞在PBS中清洗三次；使用带有DAPI（17985-50，电子显微镜科学）的荧光凝胶II安装盖玻片。使用结构照明显微镜（Nikon SIM）获取图像，并使用Imaris成像软件（Bitplane，Oxford Instruments）的Surfaces和Spots模块进行分析。使用SIM和共聚焦显微镜（Nikon A1）获取CI-M6PR和CD-M6PR染色的细胞图像，并使用Imaris成像软件中的表面模块进行分析。染色过氧化物酶体、CellLight过氧化物酶-GFP、BacMam 2.0({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“C10604”，“term_id”：“1535675”，“term_text”：“C10604”}}C10604元，ThermoFisher），并使用LysoTracker Green DND-26（L7526，ThermoSfisher）对溶酶体进行染色。使用A1R-HD共焦显微镜（尼康），使用20×和60×水物镜获取图像。

电子显微镜

MEF生长在盖玻片上，并在室温（RT）下固定在2.5%戊二醛、2.0%多聚甲醛的0.1 M磷酸钠缓冲液（PB）中1 h。然后将样品在PB中漂洗5×5 min，并在室温（RT）下将其在1%四氧化锇和1%亚铁氰化钾的0.1 M PB中固定1 h，然后像之前一样在PB内漂洗。在室温下对分级乙醇系列进行脱水（35、50、70、80、90%，每步5分钟，95%，7分钟，100%，3×7分钟），然后在干燥丙酮2×室温下培养7分钟。将完全脱水的样品渗透到浓度增加的Durcupan ACM（Sigma-Aldrich）和丙酮混合物中，顺序如下：在25%PolyBed 812中培养20分钟，75%丙酮，在50%PolyBed812中培育20分钟，50%丙酮，在75%PolyBed-812中孵育1小时，25%丙酮，最后在100%PolyBed 812中在60°C下培养45分钟。嵌入和聚合在新鲜Durcupan ACM中进行24小时，温度为60°C。用氢氟酸去除盖玻片，并在徕卡EM UC6超微切片机上以100 nm的波长对样品进行切片。切片收集在300目薄铜网格上（EMS Hatfield，PA），并用乙酸铀酰和柠檬酸铅进行后染色。在Philips CM120透射电子显微镜上以80 kV的电压观察切片样品，并用AMT BioSprint12数码相机（高级显微镜技术，马萨诸塞州沃本）记录。

活细胞成像

对于所有活细胞成像实验，使用内质网诱导释放系统，使转染的MEF将荧光标记蛋白表达到内质网中捕获蛋白的聚集域。转染后48小时的培养期后，用增溶剂处理细胞以诱导内质网释放。所使用的增溶剂取决于结构特性，并在后续章节中详细介绍。为了观察ER的早期蛋白质运输事件，用4×F转染MEFs_M（M）-mCh-NL1质粒（马修·肯尼迪赠送）。成像前，用最终浓度为1μM的DDS（635054，Takara）处理细胞，诱导其从内质网释放。在DDS诱导溶解后的10分钟内，每隔3秒收集一次图像，持续3分钟，使用60倍水物镜的A1R-HD共焦显微镜（Nikon）。使用带有Spots模块的Imaris成像软件跟踪囊泡运动。跟踪每个货物的最大速度，并记录每个单元的最大速度平均值。如果3分钟内运输的货物超过2微米，则该货物被归类为“已放行”。每个单元中释放的货物数量占总货物的数量用于计算释放百分比。为了可视化从内质网到高尔基体的贩运，用DsRedExpress2-FKBP（LV）-GalNAcT2-msGFP2质粒转染MEF。由于该聚集域与用于测量ER芽变的聚集域略有不同，因此添加了不同的增溶剂SLF（10007974，Cayman Chemical Co.），最终浓度为100μM。在添加增溶剂后，使用ImageXpress Micro 4（分子器件）每2分钟使用40×空气物镜采集一次图像，共30分钟。使用Imaris成像软件测量绿色和红色通道的共定位。通过测量DsRed与GFP通道重叠时的强度总和来量化高尔基体中的累积。为了克服细胞间强度的可变性，每个细胞在30分钟内被归一化为其最大强度。为了可视化细胞表面的转运，MEF被转染含有4×F的质粒_M（M）-卤代-L1CAM。将DDS添加到1μM的细胞中。在成像前10分钟，向细胞中添加最终浓度为100 nM的非透明晕染剂。然后在成像前用DMEM清洗细胞三次。将DDS添加到1μM的细胞中。使用TI2旋转圆盘共焦显微镜（Nikon），在增溶剂添加后20至70分钟内，每10分钟使用一个60×油物镜拍摄一次全细胞z-stack图像。使用FIJI从最大强度投影测量荧光强度。

实时PCR

使用Roche 480光循环仪和Sybr Green实时PCR Master Mix（04707416001，Roche）进行实时PCR（qPCR）。表达水平根据GAPDH水平进行标准化，并表示为对照的百分比。每个基因的PCR引物总结在补充表中^S2系列（生物罗德实验室；Prime PCR检测）。循环参数如下：95℃，10s；60°C，20秒；和72°C，30 s，共45个循环。补充表中列出了底漆^S2系列.

这项工作得到了NIH的支持（NS094154、AG053937和AG057408至L.P.；DK071801、AG052324和GM108538至L.L.；GM065386至J.M.D；GM104010至B.S.G.；GM134865至A.A.）；退伍军人事务部（I01 BX004202 to L.P.）；以及NICHD-U54 HD090256向Waisman中心提供的核心拨款。I.A.D.由T32 AG000213支持；J.C.C.得到T32 GM007183的支持。Orbitrap仪器是在国家卫生研究院共享仪器拨款（NIH-NCRR S10RR029531 to L.L.）和威斯康星大学研究生教育副校长办公室的支持下购买的。SIM成像在威斯康星大学麦迪逊分校（威斯康星州麦迪逊）生物化学光学中心进行。L.L.获得了威斯康星校友研究基金会和威斯康星大学麦迪逊药学院提供的资金，并获得了维拉斯杰出成就教授和查尔斯·墨尔本-约翰逊杰出主席教授职位。