由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引起的2019年冠状病毒病（COVID-19）疫情不断扩大，对现代人类文明产生了前所未有的影响，导致全球110多万人死亡。病毒在幼稚人群中的大流行传播可能会选择改变发病机制、毒力和/或传播性的突变。尽管在病毒复制中存在CoV校对功能(1,2)，最近的报告发现了一种紧急的阿斯伯格综合症614→SARS-CoV-2毒株的棘突糖蛋白中的Gly（D614G）替代是目前全球最普遍的形式。感染D614G变异体的患者的上呼吸道病毒载量高于祖先菌株，但与疾病严重程度无关(三,4). 据报道，编码D614G替代物的SARS-CoV-2 S假型病毒在连续细胞系中表现出更强的传染性，并且对中和的敏感性增加(4,5). 结构分析还表明，G614型S蛋白中的受体结合域（RBD）在开放构象中所占的百分比高于D614型，这意味着与受体血管紧张素转换酶2（ACE2）的结合能力有所提高(6,7). 然而，D614G替代物尚未在真实的SARS-CoV-2感染模型中进行评估，其在病毒复制、发病机制和传播性方面的功能尚不清楚。
为了解决这些问题，我们生成了一个仅包含S糖蛋白中D614G替换的等基因SARS-CoV-2变异体，以及一个包含纳米荧光素酶（nLuc）基因代替辅助基因7a的第二变异体()，使用D614型严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型毒株WA1作为骨干(8). 为了检测D614G替代是否增强了真实的SARS-CoV-2进入，我们用原始野生型（WT）-nLuc和D614G-nLuc病毒感染了四个易感细胞系，并将其保存在含有中和抗体（Abs）的介质中以限制病毒传播。在感染后8小时测量代表初始进入事件的荧光素酶信号(). 符合伪病毒研究(4,9)与WT-nLuc病毒相比，D614G-nLuc感染在不同细胞系中的转基因表达量增加了3.7-8.2倍。在这些细胞系中进行了WT和D614G病毒的生长曲线比较(). 尽管D614G变异体在早期时间点（8小时）表现出类似或略高的滴度，但其峰值滴度比Vero-E6和A549-ACE2细胞系中的原始WT病毒低约0.5 log单位，但Vero-81和Huh7中没有。
与原始WT病毒相比，SARS-CoV-2 D614G变异体在永生化细胞系中显示出更强的传染性，并在人类上呼吸道上皮细胞中表现出更强的复制适应性。(A类)基于D614型菌株WA1主干的重组SARS-CoV-2 D614G变异体的基因组。E、 包络线；M、 膜；N、 核衣壳；nLuc，纳米荧光素酶；S、 尖峰。(B类)MOI为0.5时，WT-nLuc和D614G-nLuc在多个易感细胞系中的进入效率。感染1小时后，用中和抗体处理细胞，以减少第二轮感染。在感染后8小时测量代表nLuc表达水平的相对光单位（RLU）。RLU值与两种病毒接种物中的背景（Bkgd）残余荧光素酶信号进行了标准化。(C类)两种病毒在Vero-E6（i）、Vero-81（ii）、A549-ACE2（iii）和Huh7（iv）细胞系中的生长曲线，MOI=0.5。(D类到F类)MOI为0.1时，受感染原发性鼻腔（D）、大气道（E）和小气道（F）细胞中两种变体的24、48和72小时滴度比较。通过配对分析来自同一供体的培养物中两种病毒的三倍滴度t吨测试。(G公司)LAE细胞竞争分析示意图。以1:1或10:1比例的WT和D614G混合物感染培养物，MOI为0.5，上清液在原始培养物中连续传代三次。PBS，磷酸盐缓冲盐水。(H（H）和我)在LAE竞争分析中，从病毒样品中扩增的S基因片段的BtsCI消化（H）和Sanger测序色谱（I）。含有614残基的1.5-kb片段是从每个片段中收集的单个样本的总RNA中扩增出来的。P、 通道。（B）和（C）中的数据表示为平均值±SD，并通过非配对分析t吨两种病毒之间的测试；（D）至（F）中的数据通过配对分析t吨测试。N.S.，无显著差异*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001; ****P（P）< 0.0001.
为了评估SARS-CoV-2 D614G变异体在人类呼吸道中的复制，我们比较了五名捐赠者体外原代人鼻上皮（HNE）细胞、四名捐赠人的大（近端）气道上皮（LAE）细胞、，以及来自三名捐赠者的远端肺小气道上皮（SAE）细胞。来自同一供体的培养物被WT或D614G病毒感染三次(以及图S1、A和B）。这两种病毒主要感染原代肺培养物中的纤毛细胞（图S1C）。配对t吨-测试分析表明，D614G感染的HNE细胞在24、48和72小时以及LAE培养物在48小时的滴度在统计学上高于WT病毒感染者。在来自三个供体的远端肺SAE培养物中，在任何时间点都没有观察到这种增强的复制。为了进一步比较这两种变体之间的复制适合性，通过同时感染这两种病毒在LAE培养物中进行竞争分析(). 在以72小时间隔连续传代三次后，D614G变体在培养物中占主导地位，无论野生型病毒与同基因D614G突变体的比例是1:1还是10:1(). 综上所述，这些数据表明，D614G替代物增强了SARS-CoV-2在原代上皮细胞中的复制适应性，在鼻上皮和大（近端）气道上皮的上呼吸道上皮细胞中具有优势，这些上皮细胞表达了更多的人类ACE2（hACE2）受体(8).
接下来，进行扫描和透射电子显微镜（SEM和TEM）观察原始人类气道细胞培养物表面的病毒粒子。未检测到病毒粒子形态的显著差异(). 在EM图像中，两种病毒在单个病毒粒子投影上的棘突蛋白数量没有显著差异(). Western blot分析还显示，从多个HNE培养物中采集的样本中，两种病毒的尖峰与核衣壳比率相似(). 在两种病毒之间也没有观察到穗分裂的差异(). 此外，我们评估了恢复期人类血清样本的中和特性(n个=25）使用编码WT或D614G尖峰的nLuc-expressing重组SARS-CoV-2(). 样品显示类似的半最大抑制稀释（ID50)针对这两种病毒的价值观。同样，6种RBD结合的SARS-CoV-2中和单克隆抗体（mAbs）在半最大抑制浓度（IC）下无显著差异50)针对这两种病毒的值(). 总之，这些数据表明，D614G替换不会显著改变SARS-CoV-2的形态、尖峰裂解模式和活病毒的体外中和特性。
D614G取代不会改变SARS-CoV-2病毒形态、S蛋白裂解模式和对中和抗体的敏感性。(A类)气道上皮细胞表面WT和D614G病毒的TEM图像。比例尺，200 nm。(B类)呼吸道上皮细胞表面WT和D614G病毒的SEM图像。比例尺，100 nm。(C类)单个SARS-CoV-2病毒粒子投影上S蛋白的定量。手动定量不同SEM图像中单个病毒粒子投影上的S蛋白数量，n个= 20. (D类)感染后72小时从WT或D614G感染的HNE培养物中洗涤的SARS-CoV-2病毒的Western blot分析。每个通道包含来自同一捐赠者的三倍培养物的混合样本。对全长（FL）、S1/S2裂解穗蛋白（S）和核衣壳蛋白（N）进行了检测。每对样品在等量N蛋白的基础上装载。MW，分子量。(E类和F类)通过测量Western blot图像中条带的相对强度来确定S-N比率（E）和FL-切割S比率（F）。(G公司)ID摘要5025份恢复期人血清抗WT-和D614G-nLuc病毒的值。(H（H）)三种代表性人类血清的中和曲线。病毒序列显示，血清#1是从感染D614G SARS-CoV-2变异体的新型冠状病毒肺炎患者中采集的。(我和J型)汇总IC50六株人源中和单克隆抗体对两种病毒的中和值（I）和个体中和曲线（J）。（C）、（E）和（F）中的数据表示为平均值±标准差，并通过未配对进行分析t吨测试；（G）和（I）中的数据通过配对进行分析t吨测试。N.S.，无显著差异。
为了评估D614G替代物在病毒发病机制中的作用，我们感染了人2型血管紧张素转换酶具有WT或D614G病毒等斑形成单位（PFU）的转基因小鼠和叙利亚仓鼠。SARS-CoV-2感染人2型血管紧张素转换酶小鼠表现出轻度疾病表型，其特征是肺和脑组织中的病毒滴度高，但体重减轻程度最低，鼻腔滴度检测不到(10). 两组人2型血管紧张素转换酶感染WT或D614G病毒的小鼠在感染后第2天和第5天的鼻甲中显示出检测不到的病毒滴度，肺部病毒滴度相似。两组中的一只小鼠（共5只）在大脑中显示出可检测到的病毒滴度(). 组织病理学分析显示，在感染后第2天采集的小鼠肺组织中，损伤和SARS-CoV-2感染细胞的数量相似(). 在仓鼠研究中，在感染后第3天和第6天收集的肺和鼻甲组织显示出相似的病毒滴度(). 然而，与感染WT病毒的仓鼠相比，感染D614G的仓鼠体重减轻了一些(). 免疫组织化学（IHC）显示，在第3、6和9天从两组收集的仓鼠肺组织中，病毒抗原染色的数量相似(和Fi）。组织病理学检查显示，在第3天，两只仓鼠的肺泡壁和空气中都出现了类似的严重肺损伤，炎症细胞浸润，肺水肿和肺泡出血，第6天扩展到更大的区域，到第9天时出现部分消退(). 肺部病变的大小（图4Fii）和组织学严重程度（图4Fiii）没有显著差异。为了评估D614G变异复制适合度在体内的作用，我们在四个独立的仓鼠品系中进行了竞争试验。每只仓鼠都感染了1000个含有两种病毒1:1比例的混合物的PFU（图S2B）。在幼稚动物中以3天的间隔连续传代三次后，我们观察到，在所有组的第一次传代后，D614G变异体在动物的肺组织中占主导地位（图S2、C和D），这与人类LAE竞争分析中发现的D614G病毒适应度增强的表型一致。这些研究表明，D614G替代物有助于仓鼠SARS-CoV-2发病机制的边际增强，但在人2型血管紧张素转换酶小鼠，并在仓鼠模型中提高竞争性体能。
D614G替代不会改变hACE2小鼠SARS-CoV-2的发病机制。(A类)在第2天和第5天测定WT和D614G感染小鼠的肺、脑和鼻甲滴度。每只小鼠感染105病毒的PFU(n个=每组5人）；斑块分析检测限（1.7 log10PFU/ml）用虚线表示。数据由非配对分析t吨测试。(B类)从感染后第2天采集的感染hACE2小鼠的肺组织中收集的严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型N蛋白的代表性苏木精和伊红（H&E）染色和IHC染色。比例尺，100μm。
D614G替代增强了SARS-CoV-2在仓鼠中的传播。(A类和B类)第3天和第6天从SARS-CoV-2感染仓鼠的肺部（A）和鼻甲（B）中收集的病毒滴度。每只仓鼠感染10只三病毒的PFU，n个=每个时间点每种病毒8个；斑块分析检测限（1 log10PFU/g）用虚线表示。(C类)模拟、WT和D614G感染仓鼠的体重(n个=每组4人）。体重研究中的仓鼠未接受鼻洗取样*对< 0.05 (D类)在第3天从WT和D614G感染仓鼠收集的代表性肺组织中对SARS-CoV-2核衣壳蛋白进行IHC染色。比例尺，100μm。(E类)对感染WT或D614G的仓鼠在第3天、第6天和第9天采集的代表性肺组织进行H&E染色。比例尺，1 mm(F类)（i） 使用以下评分系统量化仓鼠肺组织中的IHC阳性细胞：0，无阳性细胞；1, <10%; 2、10%至50%；肺各叶阳性细胞>50%。（ii）根据每只动物肺叶各部分受影响面积的平均百分比确定肺部病变的大小。（iii）感染仓鼠的病理严重程度评分，基于使用以下评分系统从每只动物收集的五个肺叶的每个部分的炎症面积百分比：0，无病理变化；1、受影响面积（≤10%）；2、受影响面积（<50%和>10%）；3、受影响面积（≥50%）。当观察到肺水肿和/或肺泡出血时，再加一分。(G公司)WT和D614G组感染和暴露仓鼠对鼻腔冲洗液中的病毒滴度；斑块分析检测限（1 log10PFU/ml）用虚线表示。通过Fisher精确测试分析了两个暴露组在第2天的阳性仓鼠数量（WT与D614G=0 of 8 vs 5 of 8），P（P）= 0.0256. N.S.，无显著差异。
为了评估D614G替代对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型呼吸道传播性的影响，我们为每种病毒设置了八对仓鼠，与之前的研究类似(11,12). 每对包括一只幼稚仓鼠，与感染后1天的受感染动物笼相邻（图S2、E和F）。监测所有动物鼻腔冲洗液样本中的病毒滴度。WT和D614G病毒都能有效地传播给幼年仓鼠，这一点可以从第4天在所有暴露动物中检测到的阳性鼻腔冲洗液样本中得到证明(). 感染组在所有三个时间点以及暴露组在第4天和第6天的病毒滴度在两种病毒之间相似。然而，暴露于D614G感染组的八只仓鼠中有五只在第2天出现感染和可检测到的病毒脱落，而暴露于WT感染组的仓鼠没有感染和病毒脱落(P（P）=0.0256，Fisher精确检验），支持D614G变体在仓鼠之间的传播速度明显快于野生型病毒的假设。
新出现的病毒，如冠状病毒、甲型病毒和丝状病毒，在流行病或大流行环境中适应新的人类宿主时，经历了一系列的进化(13–15). 在冠状病毒中，棘突糖蛋白的突变与发病机制、受体使用和中和作用的改变有关(16–19)这可能对目前急需的疫苗和治疗性抗体的开发构成挑战。SARS-CoV-2毒株棘突基因中出现的D614G突变引起了人们对遗传性、抗原性和/或发病机制潜在增强的担忧。使用真实的SARS-CoV-2等基因变体，我们显示了D614G替代物在增强永生化细胞系中病毒感染性、原代人气道上皮细胞和仓鼠的生长和适应度方面的作用，但它在仓鼠和hACE2小鼠模型中略微改变了病毒发病机制。我们证明，D614G变异体通过气溶胶和液滴在仓鼠之间传播速度显著加快。
最近的研究表明，D614G改变了峰-三聚体氢键相互作用，使RBD重新定向为“向上”构象，并增加ACE2受体结合和感染性(7,20). 与以前的伪型病毒研究一致(4,9,21,22)，我们的数据表明，D614G重组病毒比野生型病毒更有效地进入永生化细胞系。然而，在连续复制动力学中，我们没有观察到病毒滴度的增强，这表明不同细胞系之间可变的ACE2和蛋白酶浓度以及病毒粒子的热稳定性也可能影响D614G的体外复制。我们体外模型的有效复制和适合性表明，SARS-CoV-2 D614G等基因病毒在鼻和上呼吸道上皮细胞中显示出显著优势。这些数据支持鼻上皮和D614G替代物在增强人类感染性和传播中的作用(三).
感染D614G病毒的患者与疾病严重程度的增加并无必然联系(三,4). 在这项研究中，我们评估了两种基因中D614G变异体的发病机制人2型血管紧张素转换酶小鼠和仓鼠模型。在所有时间点的肺部和鼻甲中测量了等效病毒滴度，并且在组织病理学样品中观察到类似的病变严重程度，这表明D614G替代物并没有显著增强两种动物模型中SARS-CoV-2的发病机制，尽管在未来的研究中，这种表型需要在动物的两性中得到证实。然而，仓鼠体重减轻的增加和体内复制适应性的改善表明，D614G变异体可能会略微增加疾病结局。尽管由于棘突中存在其他突变而变得复杂，但在未来的研究中，在年轻、成年或老年小鼠的致死SARS-CoV-2感染模型中，这些差异可能会更加明显(23). 在仓鼠传播研究中，D614G等基因在感染早期向邻近动物传播的速度显著加快，表明这种替代保持了体内的有效传播。由于SARS-CoV-2优先在鼻和嗅上皮中复制，这取决于不同物种ACE2和TMPRSS2细胞类型表达模式的差异(8,24,25)，这些数据与鼻上皮和大气道上皮中复制增加的模型相一致，这导致与原始病毒相比，病毒生长增强，传播效率更高。这种表型的潜在原因可能是D614G变异体对动物的最小感染剂量较低，和/或在大小液滴中病毒粒子稳定性的细微变化，这需要在未来进行进一步的机理研究。
使用假型病毒，D614G替代物被建议增加蛋白水解裂解和S糖蛋白并入病毒，减少S1损失，并促进体外感染性增强(4,9,21). 在SARS-CoV-2结构蛋白完全补充的背景下，我们的研究表明，在蛋白水解过程或S并入编码D614G突变的等基因病毒中没有明显差异，这可能反映了真假型病毒之间S三聚体并入和呈现的差异；后者缺乏病毒蛋白的完整成分。D614G变异体对疫苗效力的影响一直备受关注。与以往研究一致(5,22)，我们显示这两种荧光素酶报告病毒对25份恢复期人类血清和6份RBD结合单克隆抗体的总敏感性相当，表明D614G替换不会显著改变SARS-CoV-2的中和特性。一些血清和单克隆抗体，如血清#1和REGN10987，对这两种病毒的中和效力略有不同，表明抗体结合特性存在细微差异。作为限制，大多数血清捐献者的病毒基因型仍然未知。这些数据还表明，目前针对WT尖峰的疫苗方法应该对D614G菌株有效。传播增加与毒力之间的关系仍然复杂，可能受到年龄、性别和其他共病的影响，目前尚不清楚D614G在人类中的最低感染剂量是否会更低(26). 监测和确定新的SARS-CoV-2变种的出现，增加传播和发病率和/或改变抗原性，特别是当人类群体免疫水平和积极干预改变作用于基因组的选择力时，这一点很重要。
