Oncol代表。2020年11月；44(5): 2152–2164.
检查点激酶-1抑制和依托泊苷通过破坏同源重组DNA损伤修复对慢性粒细胞白血病细胞系K562表现出强大的协同抗癌作用
,1 ,2 ,1 ,1 ,1 ,三 ,4 ,5 ,6 ,1,三 ,1和三
卓一凡
1同济大学医学院同济医院血液科，中国上海200065
罗华成
2宾夕法尼亚州立大学医学院儿科血液学/肿瘤科，美国宾夕法尼亚州赫尔希17033
周杰（音译）
1同济大学医学院同济医院血液科，中国上海200065
王方策
1同济大学医学院同济医院血液科，中国上海200065
张文军（Wenjun Zhang）
1同济大学医学院同济医院血液科，中国上海200065
王健（Jian Wang）
三同济大学医学院东方医院，中国上海200120
朔丽
4Jake Gittlen癌症研究实验室，宾夕法尼亚州立大学医学院，美国宾夕法尼亚州赫尔希市，邮编：17033
钱来
5厦门大学第一附属医院血液科、厦门大学医学院血液研究所，福建厦门361003
徐月双
6中国江苏南京东南大学医学院病理学系，210009
王光明
1同济大学医学院同济医院血液科，中国上海200065
三同济大学医学院东方医院，中国上海200120
梁爱斌
1同济大学医学院同济医院血液科，中国上海200065
徐军（Jun Xu）
三同济大学医学院东方医院，中国上海200120
1同济大学医学院同济医院血液科，上海200065
2宾夕法尼亚州立大学医学院儿科系儿科血液学/肿瘤学分部，美国宾夕法尼亚州赫尔希市，邮编：17033
三同济大学医学院东方医院，中国上海200120
4Jake Gittlen癌症研究实验室，宾夕法尼亚州立大学医学院，美国宾夕法尼亚州赫尔希市，邮编：17033
5厦门大学第一附属医院血液科和厦门大学医学院血液研究所，厦门，福建361003
6中国江苏南京东南大学医学院病理学系，210009
2019年12月31日收到；2020年8月7日验收。
- 数据可用性声明
本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从相应作者处获得。
摘要
白血病是一种恶性血液病，由于化疗耐药，治疗效果较差。越来越多的证据证实，癌细胞DNA损伤修复能力的提高是获得性化疗耐药的主要机制。因此，联合化疗和DNA损伤修复途径抑制剂可能是治疗白血病的理想策略。检查点激酶1(CHK1号机组)是DNA损伤反应（DDR）的重要组成部分，参与G2/M DNA损伤检查点。在本研究中，我们通过CCK-8和彗星试验的结果证明，shRNA-介导的CHK1沉默抑制了慢性粒细胞白血病（CML）细胞株K562的细胞增殖，并增强了依托泊苷（VP16）的细胞毒作用。结果表明，shRNA诱导的CHK1沉默可以覆盖G2/通过降低乳腺癌易感基因1（BRCA1）的表达，阻止并损害同源重组（HR）修复。细胞没有时间，因此修复损伤的能力有限，因此在CHK1下调后对化疗更敏感。其次，我们测试了VP16联合口服生物利用性CHK1抑制剂CCT245737的治疗效果，并在K562细胞中观察到强烈的协同抗癌作用。此外，我们发现CCT245737可显著预防G2/急性暴露于VP16引起的M骤停。有趣的是，CCT245737同时抑制了HR修复途径中最重要的成分BRCA1和Rad51。总之，这些结果表明CHK1可能是治疗CML的理想靶点，CCT245737应被视为候选药物。
关键词：CHK1、CCT245737、DNA损伤反应、足叶乙甙、慢性粒细胞白血病
介绍
尽管酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）已经彻底改变了慢性粒细胞白血病（CML）的治疗，但一些CML患者仍存在TKI耐药性(1,2)、TKI不耐受(三)或经济困境(4). 因此，仍然需要确定CML治疗的新方法。
尽管治疗策略有了很大改进，但基于DNA损伤的化疗药物目前仍是治疗大多数白血病的首选。DNA损伤可以诱导细胞周期阻滞和激活修复途径，这是对这些首选化疗药物产生耐药性的主要机制。因此，将DNA损伤反应（DDR）途径抑制剂与基于DNA损伤的化疗药物相结合是治疗白血病（包括慢性粒细胞白血病）的一种潜在的新策略。
一般来说，DNA损伤通过激活细胞周期检查点来诱导细胞周期停滞，这给细胞足够的时间来修复损伤。癌细胞主要依赖G2/M检查点修复因失活突变或p53缺失而受损的DNA(5,6). 因此，我们受到启发，以G的重要组成部分为目标2/M检查点用于治疗癌症，尤其是p53突变癌。DDR中涉及两条主要的信号通路：ATM/检查点激酶2（CHK2）和ATR/CHK1(7–9). 研究表明，在恶性细胞中，参与ATR/CHK1通路的成分经常上调，而ATM/CHK2成分经常缺乏(10). 因此，ATR/CHK1信号通路也参与G2/M检查点，是癌症治疗的潜在靶点。
CHK1是1993年在裂变酵母中首次发现的一种Ser/Thr蛋白激酶(11). 在许多不同的癌症中，对化疗和放疗的抵抗与CHK1过度表达有关。CHK1被ATR磷酸化以应对DNA损伤，随后磷酸化其下游底物以诱导细胞周期阻滞(12–14). 随后的研究证实2/M检查点和CHK1在S期和有丝分裂检查点中起关键作用(15,16). CHK1通路可以通过调节相关蛋白的表达、活性或定位直接促进同源重组（HR）(17,18). 因此，CHK1是一种极具吸引力的抗癌治疗候选药物。
迄今为止，已经开发出几种CHK1抑制剂，并在临床前或临床试验中单独或与其他化疗药物联合使用(19–25). 其中CCT245737((R（右）)-5-（（4-（（吗啉-2-基甲基）氨基）-5-（三氟甲基）吡啶-2-基）氨基）吡嗪-2-碳腈）是一种具有口服生物利用度的选择性CHK1抑制剂(26,27). 先前的研究表明，CCT245737可以增强吉西他滨和卡铂在非小细胞肺癌（NSCLC）和B细胞淋巴瘤小鼠模型中的抗癌作用(26). 然而，没有研究测试过该抑制剂提高化疗疗效的潜力，也没有研究阐明该抑制剂增强CML化疗效果的机制。
在本研究中，CHK1在K562细胞中被RNA干扰（RNAi）或CCT245737抑制，以确定其在CML细胞化疗敏感性中的作用。我们证实，CHK1抑制通过消除VP16诱导的G，显著且特异性地增强了K562细胞对依托泊苷（VP16）的化学敏感性2/逮捕和压制人力资源效率。此外，我们还初步研究了CCT245737对伊马替尼处理的K562细胞的治疗作用，表明该方法在未来可能适用于CML的TKI治疗。
材料和方法
细胞系
K562（人CML）和293T/17细胞购自中国科学院细胞库（中国上海）；KCL22（人CML）细胞系取自德国细胞培养物收集中心（德国布伦瑞克）；CAM191（人类正常淋巴细胞）细胞购自中国科学院细胞库（中国昆明）。K562和KCL22细胞在IMDM（Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.）中生长，CAM191细胞在RPMI-1640培养基（Gibco；Thermo-Fisher科学，Inc.）上生长，293T/17细胞在DMEM（Gibco:Thermo Fisher科学公司）中生长。所有培养基均添加100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml链霉素和10%胎牛血清（FBS；Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.）。细胞在37°C的含5%CO的增湿空气中培养2并用于对数生长阶段的实验。
试剂
VP16、伊马替尼和CHK1抑制剂CCT245737从Selleckchem（美国）获得，并溶解在DMSO（Sigma-Aldrich；Merck KGaA）中，用于在体外研究。在shRNA-介导的CHK1敲除研究中，细胞在105/ml，然后用5µM VP16处理4.5小时，以诱导DNA双链断裂（DSB）。孵育后，用PBS洗涤细胞，并在IMDM中维持48小时，以在进一步分析之前修复VP16诱导的DSBs(28,29). 在伊马替尼实验中，K562细胞在105/ml，然后用1µM伊马替尼处理24 h。培养后，用PBS洗涤获得活细胞，再培养24 h，然后收集细胞进行后续实验。在大多数CCT245737诱导的CHK1抑制研究中，为了更有效地诱导细胞持续DNA损伤，检测CCT24573 7对CHK1激活的作用，并在未来更方便地在临床上推广这种药物组合方法，用VP16（5µM）和CCT2457（500 nM）处理细胞单独或以10的密度组合5/与之前的研究一样，ml持续24小时(22). 在进一步分析之前，用PBS对细胞进行清洗。抗pSer296 CHK1（目录号2349）、pSer317 CHK1、pSer345 CHK1和总CHK1的一级抗体（目录号2441）、总H2K1、总H2AX、pSer139 H2AX（目录号9718）、cleaved-PARP（目录号5625）、总H3（目录号4499）、pSer10 H3（分类号53348）、，pSer216 CDC25c（分类号4901）、总CDK1（分类号9116）、pTyr15CDK1，分类号4539）、Rad51（分类号8875）、Rad50（分类号3427）、BRCA1（分类号9010）和GAPDH（分类号2118）购自Cell Signaling Technology，以及针对总CDC25c（产品代码32444）、MRE11（产品代码208020）、Ku70（产品代码92450）的抗体，Ku80（产品代码80592）和Lig4（产品代码193353）购自Abcam。
RNAi介导的基因敲除
shRNA序列GCAACAGTTATTCGGTAAT用于敲除CHK1（shCHK1-KD），而与人类任何序列无关的序列GCGCTTTGTAGGATTCG用作阴性对照（shRNA-NC）。使用含有嘌呤霉素抗性盒或ZsGreen（Clontech Laboratories）的pLVX-shRNA载体系统携带这些序列。除shRNA-NC外，空pLVX-shRNA载体也用作对照（shRNA-vector）。为了产生慢病毒颗粒，通过磷酸钙沉淀法将所有这些质粒（两个包装质粒的比例为4:3:2）共转染到293T/17细胞中。用10µg/ml聚brene进行病毒感染，48-72 h后用荧光显微镜观察细胞中GFP的表达。阳性细胞分选后，进行qPCR和western blotting检测敲除效率。随后的实验中使用了靶基因敲除显著的细胞。
RNA提取和qPCR
总RNA用MiniBEST通用RNA提取试剂盒（Takara）提取，cDNA由PrimeScript RT Master Mix（Takar）生成。使用TB Green Premix Ex Taq™II（Tli RNaseH Plus）试剂盒（Takara）通过LightCycler 96系统（Roche）和40个PCR热循环周期检测相对mRNA表达。引物序列如下：β-actin正向，5′-GGATTCCTATGTGGCGACGA−3′，反向，5′-GCGTACAGAGCAGC-3′；CHK1正向，5′-CACAGATGCTCAGAGATCTCTCCA-3′，反向，5′-TGTTCAACAACGCTCACGATTA-3′。靶基因相对于β-肌动蛋白表达的mRNA表达通过2-ΔΔCq方法(30).
蛋白质提取和蛋白质印迹
收集细胞并在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Inc.）中进行裂解（Epizyme Scientistic，中国）。对裂解液进行离心，以获得蛋白质提取物进行蛋白质印迹。使用BCA方法（贝尤蒂姆生物技术研究所）检测蛋白质浓度。使用SDS-PAGE凝胶（10%凝胶）（Epizyme，中国）进行蛋白质电泳（每个样品20–40µg），并将分离的蛋白质转移到PVDF膜（Millipore）。接下来，在室温下将膜在5%脱脂牛奶中封闭2小时，并用TBS-T清洗3次。然后，在4°C下以1:1000的稀释度将膜与特定的一级抗体孵育过夜。第二天，清洗膜，然后在室温下用HRP结合的抗兔或抗鼠二级抗体以1:1000的稀释度孵育2小时（分类号7074和7076；均来自细胞信号技术）。在黑暗中用ECL溶液（Thermo Fisher Scientific，Inc.）孵育2分钟后检测到蛋白质条带。GAPDH用作负载控制，条带强度的密度测定由Amersham Imager 600（GE Healthcare）检测。
细胞周期分布分析
将细胞清洗两次并收集在100µl预冷PBS中后，用95%乙醇在4°C下固定过夜。第二天，收集细胞并用预冷PBS清洗一次，然后用FxCycle PI/RNase染色液（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）处理。细胞周期分布由流式细胞仪（BD Biosciences）测定，并由ModFit LT 3.2（Verity Software House）分析。
碱性彗星试验
用预冷PBS清洗细胞两次，并稀释至1.5×105/毫升。使用CometAssay HT试剂盒（Trevigen）进行彗星试验。将50µl细胞（共7500个细胞）的等分试样与500µl LM琼脂糖混合，并快速移液到彗星载玻片的整个样品区域，然后将其置于4°C的黑暗中30-45分钟。琼脂糖固化后，将载玻片在4°C的冰冷裂解溶液中黑暗浸泡2小时。裂解后排空多余的缓冲液，将载玻片在室温黑暗中浸泡在新制备的碱性解卷溶液中30分钟。将载玻片放置在电泳载玻片托盘中，覆盖载玻片盘子覆盖层，并在21 V下电泳25分钟。电泳后，将载玻片用去离子水清洗两次，在黑暗中浸泡在70%乙醇中10分钟，然后放置在干燥箱中30分钟，以去除多余的缓冲液。将SYBR Gold移液管移到每个样品上，将载玻片在室温下黑暗中培养30分钟。图像由奥林巴斯显微镜和电荷耦合器件（CCD）相机以最终放大倍数×200采集。使用彗星分析软件项目4（CASP 4；Perspective Instruments，Ltd.）分析尾部力矩，作为DNA损伤的指标。
集落形成分析
K562细胞以200个细胞/孔均匀接种于24孔板中。采用双层软琼脂糖试验，底层为0.6%琼脂糖，顶层为0.3%琼脂酶。接种细胞后，每2天向每个孔中添加100µl培养基。10天后，分析菌落数量和大小，并用显微镜（尼康）和电荷耦合器件（CCD）相机拍摄代表性图像。
CCK-8分析
将细胞接种在96个培养板中，并按照指示进行处理。然后，向每个孔中添加10µl CCK-8试剂（Dojindo），将平板在37°C的黑暗中培养2 h。使用SpectraMax微孔板阅读器（分子器件）检测450 nm处的吸光度。CCT245737和VP16之间的组合指数（CI）由CompuSyn软件（CompuSyn Inc.，USA）通过Chou Talalay方法计算。
统计分析
所有统计分析均使用GraphPad Prism 6.0（GraphPad-Software，Inc.）进行。数据表示为平均值±标准偏差。所有定量实验都是通过至少三个独立实验进行的。酌情采用非配对双尾t检验或单因素方差分析，然后进行土耳其、Dunnett T3或Dunnett博士后检验，以确定统计显著性（*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001）。使用IBM SPSS Statistics 19.0（SPSS Inc.，美国）和GraphPad Prism 7（GraphPad-Software，美国）进行统计分析。
结果
CHK1在K562细胞中高表达
KCL22和K562细胞系是实验中最常见的两种CML细胞系。为了确定这两种细胞系中CHK1 mRNA的水平，我们以CAM-191细胞为对照进行qPCR，因为它们在所测试的三种细胞系（虚线）中CHK1mRNA表达最低。如所示，CHK1 mRNA在K562细胞中的表达显著高于KCL22细胞。一致地，蛋白质印迹分析表明，CHK1蛋白在K562细胞中的表达也显著高于在KCL22细胞中的表达(). 因此，选择K562细胞进行后续实验。
CHK1在K562细胞中表达较高。（A） 用qPCR检测KCL22和K562细胞中CHK1 mRNA水平相对于β-actin（负荷对照）水平，以CAM-191细胞作为对照组，以虚线表示。（B） KCL22和K562细胞中CHK1蛋白水平的Western blot分析。（C） 基于对KCL22和K562细胞之间B（***P<0.001）条带强度的密度分析，CHK1表达的相对定量标准化为GAPDH表达。CHK1，检查点激酶1。
shRNA-介导的CHK1敲除有效抑制细胞增殖
为了确定CHK1在K562细胞增殖中的作用，我们用慢病毒载体转导K562肿瘤细胞，慢病毒载体含有靶向CHK1的shRNA（shCHK1-KD）、阴性对照序列（shRNA-NC）或空pLVX-shRNA载体（shRNA-vector）。shCHK1-KD显著降低CHK1在mRNA和蛋白水平的表达(). 与shRNA-NC和shRNA-Vector相比，shCHK1-KD显著抑制K562细胞增殖(). 因此，CHK1是治疗慢性粒细胞白血病的潜在靶点。
shRNA-介导的CHK1敲除有效抑制细胞增殖。（A） qPCR检测感染三种不同慢病毒（shVector、shNC和shKD）的K562细胞中CHK1 mRNA水平与β-actin（负载控制）水平的关系。（B） Western blotting证实shCHK1（shKD）能有效抑制K562细胞中CHK1蛋白的表达。（C） 在Chk1敲除（shKD）后，通过CCK-8分析检测不同天数的细胞活力。测量OD450 nm值并绘制时间曲线（*P<0.05，**P<0.01）。CHK1，检查点激酶1。shKD、Chk1-敲除细胞。
CHK1敲除增强VP16对K562细胞的杀伤作用
为了研究沉默CHK1是否会增加VP16在K562细胞中的细胞毒性，用shCHK1-KD、shRNA-NC或shRNA-Vector转导K562，然后用5µM VP16处理；然后我们分析了DSB、细胞凋亡和集落形成。首先，我们研究了DSBs的蛋白质标记物磷酸化H2AX（γH2AX）的水平。结果表明，与两个对照组相比，CHK1敲除增加了γH2AX水平，尤其是与VP16联合治疗时(). 随后，我们进行了彗星分析，并使用CASP分析了不同的参数。橄榄尾矩（OTM）用于描述细胞中DNA损伤的程度。与γH2AX积累的变化类似，彗星实验表明，CHK1敲除后，在正常生长和DMSO处理条件下，OTM值略有增加，但并不明显。然而，在VP16治疗后，CHK1敲除组的DNA损伤显著增加(). 这些结果表明，CHK1敲除可增加VP16诱导的K562细胞DNA损伤。接下来，如所示在正常生长或二甲基亚砜处理条件下，CHK1敲除并没有显著增加细胞凋亡标志物裂解聚ADP-核糖聚合酶（c-PARP）的表达。然而，在与VP16孵育后，CHK1敲低的细胞显示出c-PARP水平明显增加，这表明细胞凋亡水平升高。此外，我们进行了集落形成分析，以确定CHK1在细胞增殖中的作用。无论VP16的存在与否，CHK1的沉默都与在所有条件下克隆形成能力的显著降低相关(). 这些结果表明CHK1的下调增强了VP16对K562细胞的细胞毒作用。
CHK1敲除增强VP16在K562细胞中的细胞毒性。（A） DSB标记γH2AX和总H2AX表达的Western blot分析。（B） 使用在正常条件下（CON）或用DMSO或VP16处理后用shVector、shNC或shCHK1（shKD）转导的细胞进行碱性彗星试验，以评估DNA损伤水平。shRNA沉默CHK1可增强VP16对DNA损伤的诱导作用。（C） B中描述的碱性彗星实验中尾部力矩的图示（***P<0.001）。（D） 细胞凋亡标记物裂解PARP（c-PARP）的Western blot分析。shRNA-介导的CHK1抑制显著增加VP16诱导的细胞凋亡。（E） 在正常条件下（CON）和DMSO或VP16处理后，对感染三种不同慢病毒的K562细胞进行集落形成分析。（F） E中描述的菌落数量的图示（**P<0.01，***P<0.001）。NS，不显著；检查点激酶1；DSB，双绞线断裂；VP16，依托泊苷。
shRNA-介导的CHK1击倒降低G2/K562细胞的M阻滞与HR修复
准确及时的DNA损伤修复对于细胞生存化疗引起的DNA损伤至关重要。如我们所示，CHK1敲除使K562细胞对VP16敏感，我们的目的是确定CHK1击倒是否损害K562的DNA损伤修复途径。首先，我们分析了shRNA-NC和shCHK1-KD组中的细胞周期分布，发现CHK1敲除可消除G2/在两种情况下，尤其是在VP16治疗后，M都会被捕(). 与细胞周期分布结果一致，VP16处理增加了G2/M阻遏标记物pS216 CDC25c和pY15 CDK1，以及shRNA-介导的CHK1敲除抑制VP16诱导的pS216 CDM25c和pY15 CDK1(). 此外，CHK1敲除逆转了VP16诱导的有丝分裂标记物pS10 H3水平的下降(). 这些结果表明shRNA-介导的CHK1敲除减轻化疗诱导的G2/M阻滞并迫使细胞进入有丝分裂，并造成未修复的DNA损伤。HR和非同源末端连接（NHEJ）是修复受损DNA的两条主要途径。尽管先前的研究表明，HR修复途径需要CHK1(17)，具体机制尚不清楚。在这里，我们检测了与NHEJ和HR相关的蛋白的表达，以确定CHK1沉默影响哪条通路。CHK1敲除对NHEJ相关蛋白Ku70/80和连接酶4（Lig4）的表达没有影响(). 相反，由于VP16诱导的BRCA1升高受到抑制，HR通路受损，这代表Rad51对DNA损伤位点的定位能力。然而，shRNA-介导的CHK1消融对VP16介导的HR相关蛋白MRE11、Rad50和Rad51的诱导没有直接影响(). 综合来看，结果表明CHK1敲低消除了G2/M拦截并降低HR修复效率；因此，敲除的细胞被迫进入有丝分裂状态，导致DNA损伤无法修复。
shRNA-介导的CHK1击倒降低G2/K562细胞的M阻滞与HR修复。（A） 用二甲基亚砜（对照）或VP16处理后，检测shNC或shCHK1（shKD）转导的K562细胞的细胞周期分布。（B） G的统计分析2/M期百分比（%）如A所示（*P<0.05，**P<0.01）。（C） G蛋白的Western blot分析2/在正常条件下和DMSO或VP16存在下，感染携带shVector、shNC或shCHK1（shKD）慢病毒的K562细胞中的M阻遏标记物pS216CDC25c、pY15CDK1和总CDC25c和CDK1。（D） 在正常条件下和DMSO或VP16存在下，对感染携带shVector、shNC或shCHK1（shKD）慢病毒的K562细胞中有丝分裂标记pS10-H3和总H3进行Western blot分析。（E） 在正常条件下和用DMSO或VP16处理后，对shVector-、shNC-或shCHK1-转导（shKD）K562细胞中NHEJ通路相关蛋白Ku70、Ku80和连接酶4（Lig4）进行Western blot分析。（F） 通过密度分析显示E中Ku70（a）、Ku80（b）和Lig4（c）表达的相对定量；靶带强度归一化为GAPDH的强度。（G） 在正常条件下和用DMSO或VP16处理后，shVector-、shNC-或shCHK1转导的（shKD）K562细胞中HR途径相关蛋白BRCA1、Rad50、MRE11和Rad51的蛋白质印迹分析。（H） 通过密度分析对G中显示的BRCA1（a）、Rad50（b）、MRE11（c）和Rad51（d）表达进行相对定量；带强度归一化为GAPDH（*P<0.05）。NS，不显著。CHK1，检测点激酶1；HR，同源重组；VP16，依托泊苷。
CCT245737有效抑制CHK1磷酸化并促进DNA损伤的积累
CCT245737是一种有效的CHK1抑制剂，具有良好的口服生物利用度。如之前的研究所示(26,27)，CCT245737是一种选择性CHK1抑制剂，具有一半最大抑制浓度（IC50)CHK2和CDK1的值为1.4±0.3 nM，且选择性大于1000倍。
为了证实CCT245737抑制CHK1的能力，我们首先分析了不同浓度CCT24573处理的细胞中CHK1蛋白的总表达。如所示，CCT245737浓度的增加并没有显著降低总CHK1蛋白水平，并且CHK1仅在高浓度的CCT245737（5µM）下受到抑制。然后，我们用VP16处理K562细胞，并单独或联合增加CCT245737浓度，以研究CCT24573是否影响磷酸化CHK1水平。VP16明显诱导了CHK1在Ser296的自磷酸化和在Ser317和Ser345的磷酸化(). 在CCT245737存在下，VP16诱导的Ser296自磷酸化在0.05µM时被显著抑制，在0.5µM下完全消除。相反，CCT245737对其他CHK1磷酸化位点（Ser317和Ser345）和总CHK1水平的影响最小。同时，在Ser296抑制CHK1的自磷酸化与γH2AX的积累相一致。因此，这些结果表明CCT245737可以通过抑制VP16诱导的CHK1在Ser296的自磷酸化，并促进VP16处理的K562细胞DNA损伤的积累，从而有效抑制CHK1的激活。
CCT245737对VP16诱导的K562细胞CHK1和DNA损伤生物标记物水平变化的影响的表征。（A） 在用增加浓度的CCT245737处理24小时后，K562细胞中总CHK1表达的蛋白质印迹分析。（B）通过密度分析对总CHK1表达的相对定量显示在A中；带强度归一化为GAPDH（*P<0.05）。（C） 用VP16（5µM）、CCT245737（5μM）或VP16和增加CCT24573浓度的组合处理K562细胞进行Western blot分析。CHK1在Ser296的自磷酸化和Ser317和Ser345的磷酸化被用作CHK1活性的生物标记，γH2AX被用作DNA损伤的生物标记。NS，不显著。CHK1，检测点激酶1；VP16，依托泊苷。
CCT245737使K562细胞对VP16敏感
为了测定CCT245737的细胞毒性，用增加浓度的CCT24573处理K562细胞24小时，并用CCK-8测定细胞活力。我们的结果表明，CCT245737以剂量依赖的方式显著降低了K562细胞的存活率(). 此外，我们证明CCT245737和VP16对K562和伊马替尼处理的K562细胞（K562-IM）的生存能力具有协同作用，50%有效剂量（ED）的CI分别为0.35和0.1550)根据Chou-Talalay分析计算() (31). 为了阐明这种药物组合对癌细胞具有特异性，我们对正常人淋巴细胞系CAM191进行了相同的实验。与载体和伊马替尼处理的K562细胞相比，CCT245737在CAM191细胞中与VP16的协同作用较弱，ED时的CI为0.9350(). 此外，与中显示的γH2AX累积量一致彗星试验表明，CCT245737明显增加了VP16诱导的DNA损伤水平(). 此外，联合治疗组c-PARP水平升高提示细胞凋亡上调(). 这些数据表明，CCT245737可能与VP16在使用或不使用伊马替尼治疗的K562细胞中具有显著且特异的协同抗癌作用。
CCT245737使K562细胞对VP16敏感。（A） 增加CCT245737浓度治疗24小时后K562细胞存活率%的图形表示（B）使用指定药物治疗24小时之后，对K562电池进行Chou-Talalay分析后，（A）存活率%和（B）Fa-CI的图形表示用指示药物治疗24小时后，Chou-Talalay对伊马替尼处理的K562（K562-IM）细胞进行Fa-CI分析进行碱性彗星试验，以评估用CCT245737（500 nM）和/或VP16（5µM）处理24小时的K562细胞的DNA损伤程度。（G） 用CCT245737（500 nM）和/或VP16（5µM）处理K562细胞24小时后，对凋亡标记物裂解的PARP进行Western blot分析。VP16与CCT24573结合可增加c-PARP水平。NS，不显著；VP16，依托泊苷；c-PARP，裂解聚（ADP-核糖）聚合酶。
CCT245737废除G2/K562细胞中M阻滞并降低HR修复能力
为了阐明CCT245737和VP16在白血病细胞中协同抗癌的机制，我们首先分析了细胞周期分布。CCT245737废除G2/在正常条件下和急性VP16暴露（5µM持续1.5小时）后，K562细胞中的M阻滞(). western blot结果表明，CCT245737能有效降低VP16诱导的G2/M逮捕标记pS216 CDC25c和pY15 CDK1(). 此外，CCT245737挽救了VP16诱导的有丝分裂标记pS10 H3的减少(). 接下来，研究与NHEJ和HR通路相关的关键蛋白的表达，以阐明CCT245737增强化疗敏感性的潜在机制。与shRNA诱导的CHK1沉默的结果一致，CCT245737对NHEJ相关蛋白的表达没有明显影响(). 然而，与shCHK1-KD实验的结果相反，CCT245737显著抑制了VP16对Rad51和BRCA1的诱导(). 这一结果表明CCT245737不仅降低了Rad51的局部可用性，而且直接抑制了DSB后Rad51的表达。根据上述结果，BRCA1和Rad51被选为K562野生型（K562-WT）细胞CHK1相关DNA损伤修复途径中最重要的蛋白质。因此，我们将伊马替尼处理的K562（K562-IM）细胞中Rad51和BRCA1的表达优先于其他检测，以证明CCT245737抑制CHK1也可以通过下调这两个蛋白的表达来抑制K562-IM细胞中的HR效率，并且在K562-IM细胞中也获得了类似的结果。与K562-WT细胞相比，用伊马替尼预处理的K562细胞显示出VP16诱导的Rad51和BRCA1表达增加不显著，可能是因为这种预处理可以诱导这些细胞中的大量Rad51和BR CA1表达。CCT245737也明显抑制伊马替尼处理的K562细胞中Rad51和BRCA1的表达，表明CCT24573也能有效抑制TKI处理的CML细胞的HR效率(). 总之，这些结果表明CCT245737可以消除VP16诱导的G2/M检查点，有效抑制HR修复途径，促进DNA损伤未修复的细胞进入有丝分裂。
CCT245737废除G2/M阻滞并降低K562细胞的HR修复能力。（A） CCT245737（500 nM，24小时）对急性VP16（5µM，1.5小时）处理的K562细胞的细胞周期阻滞的影响。（B） G的统计分析2/A中描述的M相百分比（%）（**P<0.01，***P<0.001）。（C） G蛋白的Western blot分析2/用CCT245737（500 nM）和/或VP16（5µM）处理24小时的K562细胞中的M阻滞标记pS216CDC25c、pY15CDK1和总CDC25c和CDK1CCT245737（500 nM）和/或VP16（5µM）处理K562细胞24小时后NHEJ通路相关蛋白Ku70、Ku80和连接酶4（Lig4）的Western blot分析。（G） CCT245737（500 nM）和/或VP16（5µM）处理24小时后K562细胞HR通路相关蛋白BRCA1、Rad50、MRE11和Rad51的Western blot分析（I）暴露于CCT245737（500 nM）和/或VP16（5µM）24 h后，伊马替尼处理的K562细胞中BRCA1和Rad51蛋白表达的Western blot分析。NS，不显著；HR，同源重组；CHK1，检测点激酶1；VP16，依托泊苷。
讨论
尽管各种化疗药物的发展大大改善了癌症治疗，但仍有一些患者对某些疗法产生了耐药性。由于DNA损伤反应（DDR）在化疗耐药中的关键作用，阻断这一途径已成为解决这一问题的新途径。检查点激酶1（CHK1）是一种众所周知的细胞周期检查点蛋白，与DDR途径有关，尤其是在占癌细胞大部分的p53突变细胞中(6,32). CHK1不仅参与细胞周期调控，还通过直接或间接调控Rad51参与同源重组（HR）途径(). 因此，CHK1可能是治疗化疗耐药癌症的理想候选药物。
CHK1介导的G调节示意图模型2/M细胞周期检查点和HR修复途径。BRCA1，乳腺癌基因易感性1；BARD1、BRCA1-相关环域蛋白1；CDC25c，细胞分裂周期蛋白25同源物C；细胞周期蛋白依赖性激酶1；CHK1，检测点激酶1；Lig4，连接酶4。
CCT245737是一种选择性CHK1抑制剂，其选择性是CHK2和CDK1的1000倍以上，口服生物利用度接近100%(26). 本研究表明，CCT245737通过消除Ser296的自磷酸化来抑制CHK1激活，但对Ser317和Ser345磷酸化或CHK1总水平的影响最小。由于pSer317 CHK1和pSer345 CHK1水平受DNA损伤水平和PP2A磷酸酶活性的影响，我们使用pSer296 CHK1作为CHK1活性的特定生物标志物，这与以前的研究一致(19,33). 因此，CCT245737可以被认为是增强化疗疗效的候选CHK1抑制剂。
在本研究中，我们首先用shRNA下调CML细胞中CHK1的表达，发现CHK1沉默显著增加DNA损伤，促进凋亡，并减少细胞增殖和集落形成。随后，CCT245737被证明在CML细胞中与VP16具有良好的特异性协同作用。为了揭示潜在的机制，我们进行了相关实验来研究CHK1抑制对细胞周期和DNA损伤修复途径的影响。
VP16是一种DNA拓扑异构酶II（TOP2）抑制剂，可以通过破坏DNA连接步骤中的TOP2催化循环来诱导和稳定DNA双链断裂（DSB），通常包含在抗癌治疗方案中(34). 先前的研究表明，VP16介导的DSB可诱导G2/通过激活G逮捕M2/修复DNA损伤的M细胞周期检查点(35). 在我们的研究中，我们发现RNAi介导的CHK1沉默和CCT245737有效地消除了VP16诱导的G2/M细胞周期检查点，通过否决G来消除DNA修复所需的时间2/M被捕。因此，细胞可能进入有丝分裂状态，并累积未修复的损伤。
非同源端接（NHEJ）和HR是修复DSB的两种主要机制(36). NHEJ几乎可以发生在整个细胞周期中，而HR只发生在S/G中2DNA复制后的阶段。在NHEJ修复中，DSB末端被各种核酸内切酶或核酸外切酶切除以生成微同源序列（<4个核苷酸）(37). 然后，Ku70和Ku80异二聚体（Ku70/80）识别并结合DSB以招募核酸酶、连接酶和聚合酶（如DNA连接酶IV）来修复断裂。我们发现shRNA-介导的CHK1敲除和CCT245737均未显著影响Ku70/80或DNA连接酶IV的表达，这表明NHEJ修复途径可能不受CHK1抑制的影响。
与NHEJ相比，HR修复是一种更精确的修复DNA损伤的方法，NHEJ会引发容易出错的修复。一旦出现DSB，Mre11-Nbs1-Rad50（MRN）复合体将DSB末端转化为单链DNA（ssDNA）。随后，HR通路的关键成分Rad51被招募到复制蛋白a（RPA）包衣的单链断裂（SSB）中，并诱导D-loop形成以修复断裂。BRCA1参与各种生物过程，包括mRNA剪接(38)，DNA损伤信号(39)和人力资源维修(40,41). BRCA1可以与BRCA1相关环域蛋白1（BARD1）形成稳定的复合物(42)一项研究表明，它与Rad51共免疫沉淀(43). 最近的一份报告表明，BRCA1-BARD1复合物可以直接与人类Rad51相互作用，增强Rad51对DNA损伤位点的亲和力，并促进D-loop的形成(44). 在我们的研究中，在VP16治疗后，shRNA-介导的Chk1沉默显著抑制BRCA1表达，但不抑制MRE11、Rad50和Rad51表达。因此，shRNA-介导的CHK1下调可能通过减少BRCA1诱导的Rad51定位和D-loop形成而不是直接抑制Rad51表达来抑制HR修复效率。然而，与shRNA-介导的CHK1抑制（仅抑制VP16诱导的BRCA1）相反，CCT245737显著降低了VP16诱导Rad51和BRCA1水平的增加。在伊马替尼处理的K562细胞中也发现了类似的结果。这些结果表明，CCT245737可能通过直接抑制Rad51表达和间接抑制BRCA1介导的Rad51在DNA损伤和D-loop形成时的定位来阻断HR通路。这些结果与最近的一项研究一致，该研究发现，另一种选择性CHK1抑制剂prexasertib通过促进泛素介导的蛋白酶体降解来抑制三阴性乳腺癌细胞中Rad51和BRCA1的表达，但RNAi诱导的CHK1下调仅影响Rad51的聚焦能力(45). 然而，CCT245737抑制CML细胞中Rad51和BRCA1表达的详细机制，以及这些作用是否取决于给药时间，尚待后续实验确定。基于对K562-IM细胞的CCK-8和western blot结果，我们推测伊马替尼（IM）可能会迫使K562细胞进入应激状态，这有助于细胞对其他药物刺激产生更强的抵抗力。因此，我们还将在未来的研究中对K562-WT和K562-IM细胞中CCT245737和VP16在DNA损伤修复方面的药理组合进行更深入的比较。
除了CHK1在细胞周期和DNA损伤修复途径中的关键作用外，最近的一项研究表明，CHK1抑制剂还可以触发CML中Bcr-Abl蛋白的降解(46). 这是靶向CHK1治疗CML的另一个潜在机制。
总之，CHK1是CML治疗发展的一个有希望的靶点。CHK1抑制可以有效地削弱DSB介导的细胞周期阻滞和HR修复途径。因此，CHK1抑制后缺乏修复DNA损伤的时间和能力将导致DNA损伤的更大积累并增加凋亡，导致增殖和集落形成减少。此外，CCT245737可能是一种理想的候选CHK1抑制剂，在野生型和IM处理的K562细胞中与VP16都表现出显著和特异的协同作用。这些结果为CML甚至TKI耐药CML的未来临床方案中推广这一策略提供了令人信服的证据。
基金
本研究得到了中国科学技术部（批准号：2016YFE0107200）、国家重大科技专项“重大新药开发”（2018ZX09201002-005）、国家自然科学基金（31471029、31671055、81461138037）的支持徐军专家工作站（2017IC025）。
数据和材料的可用性
本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从相应作者处获得。
作者的贡献
本文的第一作者ZF设计了研究，收集了样本，进行了实验，分析了数据并撰写了手稿。HL、JZ、FW、WZ、JW、SL、QL、YX、GW、AL和JX参与了样本收集、数据收集和分析。所有作者阅读并批准了手稿，并同意对研究的所有方面负责，以确保适当调查和解决工作任何部分的准确性或完整性。
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