生物分子。2020年7月；10(7): 1030.
氨苄西林/舒巴坦钠治疗对雄性高饮酒大鼠NMDA受体NR2B亚单位的调节及减轻神经炎和酒精摄入
，1,2 ，2 ，2 ，三，*和2,*
理查德·贝尔
三美国印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院精神病学系和精神病理学研究所，邮编：46202
三美国印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院精神病学系和精神病理学研究所，邮编：46202
收到日期：2020年6月6日；2020年7月9日验收。
摘要
接触乙醇通常表现为神经炎症。β-内酰胺类抗生素通过上调中脑皮质边缘区（包括伏隔核（Acb））的星形胶质细胞谷氨酸转运体，特别是谷氨酸转运体-1（GLT-1）的表达，减轻酒精摄入。然而，β-内酰胺类抗生素对长期接触乙醇的动物神经炎症的影响尚未得到充分研究。在本研究中，我们评估了氨苄西林/舒巴坦（AMP/SUL，100和200 mg/kg，i.p.）对高酒精饮用（HAD1）大鼠乙醇消耗的影响。此外，我们研究了AMP/SUL对GLT-1和N个-甲基-d日-Acb核心（AcbCo）和Acb外壳（AcbSh）中的天冬氨酸（NMDA）受体亚型（NR2A和NR2B）。我们发现，两种剂量的AMP/SUL均能减少乙醇消耗，并恢复乙醇分别降低AcbSh和AcbCo中GLT-1和NR2B的表达。此外，AMP/SUL（200 mg/kg，i.p.）减少了乙醇，增加了AcbSh中高迁移率组蛋白盒1（HMGB1）和晚期糖基化终产物受体（RAGE）的表达。此外，两种剂量的AMP/SUL都减弱了乙醇升高的AcbSh中肿瘤坏死因子α（TNF-α）。我们的研究结果表明，AMP/SUL可减弱乙醇饮用，并调节NMDA受体NR2B亚基和HMGB1相关途径。
关键词：乙醇、AMP/SUL、GLT-1、NMDA、神经炎症
1.简介
世界卫生组织（WHO）报告称，近年来酒精饮料的消费量显著增加，并经常导致负面健康后果[1]. 我们以前的研究表明，长期饮酒会降低星形胶质细胞谷氨酸转运体的表达，并增加伏隔核（Acb）中细胞外谷氨酸的浓度[2，三，4]. 研究发现，细胞外谷氨酸浓度的升高会增加小鼠的乙醇消耗[5]. 值得注意的是，乙酰胆碱酯酶（Acb）是一个调节乙醇消耗和复发行为的中枢脑区[6，7]. Acb由两个分区组成；Acb核心（AcbCo）和Acb外壳（AcbSh），以及慢性乙醇摄入和戒断可能对这些亚区谷氨酸能受体的表达造成不同的影响[8]. 研究表明，线索和情境诱导的乙醇寻求行为复发分别受到AcbCo和AcbSh的严格调控[9].
我们和其他人的研究发现，Acb中细胞外谷氨酸浓度的增加主要由谷氨酸转运体-1（GLT-1）表达减少介导[三，4，10]. 值得注意的是，β-内酰胺类抗生素（如头孢曲松和氨苄西林，AMP）增加了Acb中GLT-1的表达，并减弱了乙醇驱动行为[11，12，13，14]. 此外，β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸降低了乙醇和可可碱的寻找行为，并增加了GLT-1在Acb中的表达[15，16]. 突触谷氨酸浓度的增加与某些谷氨酸受体表达的改变有关[17]以及神经炎症[18].
离子型谷氨酸受体的作用，包括N个-甲基-d日-天冬氨酸受体（NMDAR）在寻找乙醇和饮酒行为中已被广泛研究[19，20，21]. 用NMDAR拮抗剂美金刚胺治疗可减少动物的乙醇自给[22]. 此外，NMDAR拮抗剂MRZ 2/579治疗可减轻大鼠的乙醇戒断症状[21]. 研究表明，急性乙醇摄入会抑制NMDAR的功能[23]而慢性乙醇摄入与NMDAR活性增加相关[24，25，26]. 此外，乙醇暴露诱导NMDAR亚单位表达的变化，这取决于大脑区域、动物年龄和乙醇暴露范式[27，28]. NMDAR有几种亚型，它们都在大脑中高度表达[29]. 在这些亚单位中，与其他NMDA受体亚单位相比，NR2A和NR2B对乙醇的抑制作用表现出更高的敏感性[30]. 此外，研究表明NMDA受体的刺激与神经炎症有关[31]. 此外，NMDA暴露增加了高迁移率族框1（HMGB1）的释放和表达，NR2B抑制剂减弱了这些影响[32]. 此外，美金刚（NMDAR拮抗剂）治疗可减轻秋水仙碱诱导的神经炎症[33].
代谢型谷氨酸受体（mGluRs），尤其是mGluR 5，在减少乙醇寻求行为中的作用已有充分的文献记载，这些受体在治疗酒精使用障碍方面具有靶向性（在[34，35]). 阻断mGluR5可减少乙醇的自我给药和复发性乙醇寻求行为[36]. 用mGluR5拮抗剂治疗后，皮质纹状体突触的长期抑制减弱，表明纹状体的突触可塑性受到了影响[37]. 乙醇暴露改变了中层皮质激素系统中mGluR5的可用性[38，39]. mGluR5的刺激与抗炎作用有关，部分是通过减少小胶质细胞的激活[40].
HMGB1可以作为炎症介质，已知可以刺激某些受体，包括晚期糖基化终产物受体（RAGE）[41]. 该受体反过来激活核因子κB（NF-κB）和其他细胞内级联[41]导致神经炎症标记物/介质的表达增加，如肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素1-β（IL-1β）[42]. 通过调节信号通路暴露于乙醇诱导的神经炎症[43，44，45]例如，通过提高大脑中神经炎症介质（例如TNF-α）的表达[46]. 乙醇处理后海马-内嗅皮质细胞HMGB1基因和蛋白表达增加，这与TNF-α和IL-1β基因表达增加有关[47]. 在临床研究中，在酗酒的女性饮酒者中观察到HMGB1水平升高[48]. 此外，死后人类酒精性海马体HMGB1表达增加[49]. HMGB1与乙醇提取诱导的神经毒性的发展有关，已知该过程涉及谷氨酸过度刺激[50]. 值得注意的是，在没有乙醇的情况下，HMGB1的释放也是谷氨酸毒性所必需的[32].
总的来说，这些研究表明NMDAR和HMGB1通路对酒精饮用和戒断行为的发展以及相关的神经炎症至关重要。因此，我们在本研究中假设，长期饮酒可能会导致AcbCo和AcbSh中NMDAR亚单位、mGluR5和炎症介质的改变，以及氨苄西林/舒巴坦（AMP/SUL）治疗，一种既有β-内酰胺抗生素又有β-内酰胺酶抑制剂药理作用的化合物，将调整这些变化。值得注意的是，AMP和SUL都可以跨越血脑屏障，对脑膜炎的病因细菌感染有治疗作用[51]. 值得注意的是，AMP/SUL治疗已被证明可以减弱可卡因寻求行为的恢复，部分是通过上调AcbCo和AcbSh中的星形胶质细胞谷氨酸转运体[52]. 为了评估这一假设，我们首先研究了AMP/SUL治疗对高酒精摄入（HAD1）大鼠慢性乙醇消耗的影响。然后，我们测量了AcbCo和AcbSh中GLT-1、NR2A和NR2B亚单位、mGluR5、HMGB1、RAGE和TNF-α的蛋白表达。我们的结果表明，慢性乙醇摄入会导致AcbSh的炎症反应，AMP/SUL治疗会减弱这些影响。我们之前已经发现，在预处理和后处理测试中，单独暴露于AMP/SUL（200 mg/kg，i.p.）并不会诱导或减少嗜酒（p）大鼠的条件位置偏好[52，53]. 然而，AMP确实上调了培养的皮层神经元中的GLT-1[54]. 因此，在我们的研究中，我们假设AMP/SUL逆转了乙醇对GLT-1表达的下调作用。因此，AMP/SUL可能会减弱由此产生的有害影响，包括神经炎症。
2.材料和方法
2.1. 动物和饮酒协议
雄性HAD1大鼠，作为酒精使用障碍的动物模型[55，56，57，58]，用于本研究。大鼠被安置在经国际实验动物护理评估与认证协会完全认证的动物饲养场中，并在12小时/12小时逆黑暗/光周期（10:00小时开始黑暗）中保持约50%的湿度和约23°C。所有程序均由印第安纳大学医学院动物护理和使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院动物护理指令（例如，《实验动物护理与使用指南》）。动物被关在悬挂的不锈钢丝网笼子里，带有树脂玻璃®搁板位于笼的底部，这样它们就不会连续接触钢丝网地板。在整个过程中，老鼠可以随意获取食物。大鼠在55天大时开始实验性饮水程序。大鼠通过两个实验程序连续饮用了9周的三瓶选择饮料。我们测量了过去三周的平均乙醇摄入量，这被视为基线。我们使用我们制定的标准来选择对乙醇产生依赖性的大鼠。在15%和30%的浓度下，大鼠在五周内对乙醇产生依赖性v（v）/v（v）无酒精选择饮用时间表。大鼠必须每天饮用至少4克/千克或更高的水才能留在研究中。第一个步骤是将各组大鼠置于一个水瓶和两瓶乙醇（15%和30%，v（v）/v（v）（同时可用），为期9周，代表乙醇对照组、AMP/SUL（100 mg/kg，i.p.）组和AMP/SUL.（200 mg/kg，ip.）组，而第二个实验程序是将大鼠组暴露在三瓶水中9周，即代表水对照组（乙醇-na-ive）。每隔一天或每隔三天，对每瓶的位置进行半随机分组。在大鼠饮用8周后，立即在饮用第9周期间测试两种剂量的AMP/SUL（100或200 mg/kg，i.p.）。有两个对照组，分别接受等体积剂量的生理盐水/载体。每天混合AMP/SUL的新溶液。黑暗周期前30分钟腹腔注射AMP/SUL。这些注射在连续五天进行，即在饮用乙醇或水的第9周。在天黑前一小时，从周一到周五测量动物的体重，以及食物漏斗和瓶子的重量。食物漏斗和液体瓶在天黑时（上午10:00）被加满并放在各自的笼子里。最后一次注射AMP/SUL后24小时，用二氧化碳迅速将大鼠安乐死，然后斩首，将大脑收获并置于干冰上的异戊烷中，并储存在−80°C下，用于随后的蛋白质水平分析。AMP/SUL剂量的选择基于先前的研究，研究表明头孢曲松（一种β-内酰胺类抗生素）可以减少乙醇摄入，并在100 mg/kg或200 mg/kg时持续影响中层皮质边缘奖赏回路中的蛋白质水平[13，14]. 在以前的研究中，AMP（100 mg/kg，i.p.）和AMP/SUL（100 mg/kg/kg或200 mg/kg，i.p.）也观察到类似的结果[11，59].
2.2。脑解剖
使用维持在−20°C的低温恒温器，使用微穿孔程序分离Acb亚区（AcbCo和AcbSh），以保持样品冷冻。Paxinos和Watson地图集[60]用于评估分离这些大脑区域的位置和厚度。
2.3. Western Blot分析
如先前研究所述，进行免疫印迹分析以研究AcbCo和AcbSh中GLT-1、NR2A、NR2B、HMGB1、RAGE、TNF-α和β-微管蛋白表达的变化[52，61]. 在AcbCo和AcbSh样品的均质过程中使用了含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液。然后使用清洁剂兼容蛋白质分析（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）量化每个组织样品中的蛋白质量。将每个样品中等量的蛋白质与莱姆利染料混合，并将混合物装载到聚丙烯酰胺凝胶（8-10%）上。然后将蛋白质从凝胶转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。随后，在室温下用含吐温-20（TBST）的Tris缓冲盐水中的3-5%无脂牛奶封闭PVDF膜1小时。将适当的一级抗体与膜在4°C下孵育（过夜）：豚鼠抗GLT-1（1:5000，Abcam，Cambridge，UK）、兔抗NR2A抗体（1:500；EMD Millipore，Burlington，MA，USA）、兔抗NR2B抗体（1:5000；EMD Millipore）、兔抗体HMGB1（1:1000；Abcam）、兔对抗RAGE（1:1000，Abcam）、，和兔抗肿瘤坏死因子-α（1:500；Abcam）。小鼠抗β-微管蛋白（1:1000；BioLegend，San Diego，CA，USA）用作对照负载蛋白。第二天，用TBST清洗膜五次，然后在室温下用3%无脂牛奶封闭30分钟。然后将膜与二级抗体（1:3000）孵育90分钟。随后，用TBST清洗膜五次。化学发光试剂（Super Signal West Pico，Pierce Inc.，Appleton，WI，USA）与干燥的膜孵育以进行蛋白质检测。在GeneSys成像系统上开发了膜，并开发了数字化的印迹图像。使用ImageJ软件（v1.53a）定量和分析GLT-1、NR2A、NR2B、HMGB1、RAGE、TNF-α和β-微管蛋白印迹的表达。水对照组数据表示为100%（相对于水对照组），以评估我们先前研究中描述的AcbCo和AcbSh中相关蛋白表达的任何变化[62，63，64，65，66，67]. 因此，在相同的凝胶中，每个组的蛋白质表达均归一化为水对照组的平均值。
2.4. 统计分析
2.4.1. 饮料解决方案数据
所有统计分析均使用Graphpad Prism软件（v5.04）进行，α设置为第页< 0.05. 在AMP/SUL治疗的5天内，对24小时乙醇摄入量、24小时水摄入量和24小时食物摄入量以及每日体重进行了双向（或混合模型）方差分析。重要的相互作用和/或主要影响被分解为简单的主要影响，如果后者是重要的，则先验Dunnett的t吨-对每一剂量与乙醇-盐对照组进行了试验多重比较。
2.4.2. Western Blot数据
所有统计分析均使用Graphpad Prism软件进行。使用Newman-Keuls的单向方差分析作为事后多重比较测试，以Western blot数据与负载蛋白β-微管蛋白的百分比（相对于水对照值）比率进行分析。报告的数据用于第页<0.05显著性水平。
3.结果
3.1. AMP/SUL（0、100或200 mg/kg）对液体和食物摄入量以及体重的影响
3.1.1. AMP/SUL（0或100或200 mg/kg）对24小时乙醇摄入量的影响（g/kg/天）
对乙醇饮用数据的统计分析显示，每日剂量之间存在显著的相互作用(第页< 0.001). 从第1天到第5天，每天的简单主要影响显著，Dunnett的t检验表明第一天乙醇摄入量显著减少(第页<0.001）和第2-5天(第页<0.0001），如所示A类(n个=9/组）。
氨苄青霉素/舒巴坦（AMP/SUL）治疗（100 mg/kg和200 mg/kg，腹腔注射）连续五天对(A类)乙醇消耗量（g/kg/天平均体重）(B类)进水量（mL/天）(C类)体重，以及(D类)食物摄入。统计分析表明，AMP/SUL持续降低乙醇摄入量，同时增加水摄入量。然而，与基线相比，第5天的摄水量有所增加(第页乙醇对照组<0.01）。虽然在治疗的第1天食物摄入量暂时减少，但AMP/SUL没有其他显著影响。此外，AMP/SUL不影响体重。数值表示为平均值±SEM(n个=9/组）(*第页<0.05和**第页< 0.01, $第页<0.001和#第页< 0.0001).
3.1.2. AMP/SUL（0或100或200 mg/kg）对24小时摄水量（ml/天）的影响
对水摄入量的统计分析表明，每日剂量交互作用显著(第页< 0.01). Dunnett的t检验表明，相对于乙醇-病毒组（第1天，第页< 0.01; 第2天到第4天，第页<0.001，含100 mg/kg AMP/SUL和第页<0.0001，含200 mg/kg AMP/SUL；第5天，第页<0.001），如所示B类(n个=9/组）。
3.1.3. AMP/SUL（0或100或200 mg/kg）对平均体重的影响（mL/天）
使用双向（混合）方差分析，还分析了平均体重。逐日剂量交互作用和剂量或天数的主要影响不显著(第页>0.05），如所示C类(n个=9/组）。
3.1.4的规定。AMP/SUL（0或100或200 mg/kg）对食物摄入量的影响（g/天）
对测试前4天的食物摄入数据进行了分析（测试第5天的数据被破坏）。食物摄入量的统计分析显示，每日剂量交互作用不显著(第页> 0.05). 剂量的主要影响(第页<0.001）和天(第页<0.0001）显著。邓内特家族t吨-测试显示，只有在服用100 mg/kg AMP/SUL的第1天，这两种剂量才显著减少了食物摄入量(第页<0.0001）和200 mg/kg AMP/SUL(第页<0.001），如所示D类(n个=9/组）。
3.2. AMP/SUL（0或100或200 mg/kg）对慢性饮酒HAD1大鼠AcbCo和AcbSh中GLT-1表达的影响
单因素方差分析显示，水对照组、乙醇对照组和乙醇处理100或200 mg/kg（i.p.）AMP-SUL组AcbCo中GLT-1的表达水平没有显著差异(第页> 0.05, (B） ，n个=5/组）。然而，在AcbSh的四个组中GLT-1的表达存在显著差异(F类(3, 16) = 22.53,第页< 0.0001, (D） ，n个=5/组）。Newman-Keuls多重比较事后分析显示，乙醇处理组与水对照组相比，AcbSh中GLT-1的表达降低。统计分析还表明，与乙醇对照组相比，AMP-SUL（100或200 mg/kg，i.p.）增加了AcbSh中GLT-1的表达。
AMP/SUL治疗（100 mg/kg和200 mg/kg，i.p.）5天对AcbCo和AcbSh中GLT-1表达的影响(A类)AcbCo中GLT-1和β-微管蛋白的免疫印迹。(B类)采用单因素方差分析和Newman-Keuls检验进行定量分析表明，在AcbCo中，水对照、乙醇对照、乙醇-AMP/SUL（100 mg/kg）和乙醇-AMP/SUL（200 mg/kg）的GLT-1表达没有显著差异。(C类)AcbSh中GLT-1和β-微管蛋白的免疫印迹(D类)采用单因素方差分析和Newman-Keuls检验进行定量分析表明，乙醇对照组与水对照组相比，GLT-1表达显著降低，而AMP/SUL（100和200 mg/kg）治疗后与乙醇对照组相比上调了AcbSh中GLT-1的表达。与水对照组相比，乙醇-AMP/SUL（100和200 mg/kg）组的GLT-1表达较低。任何组与水对照组之间的统计显著性符号显示在组的横条上。水对照组数据表示为100%（相对于水对照组）。数值表示为平均值±SEM(n个=5/组）(*第页< 0.05, **第页<0.01和$第页< 0.001).
3.3. AMP/SUL（0、100或200mg/kg）对慢性乙醇饮用HAD1大鼠AcbCo和AcbSh中NR2B和NR2A表达的影响
我们研究了慢性乙醇消耗和AMP-SUL处理对AcbCo和AcbSh中NR2B表达的影响。在AcbCo的所有四组中都有显著变化(F类(3, 16) = 6.781,第页= 0.0037 (B） ，n个=5/组）。Newman-Keuls多重比较事后分析显示，与水对照组相比，乙醇对照组中NR2B的表达降低，并且乙醇-AMP-SUL组（100和200 mg/kg，i.p.）与乙醇对照组相比显示出更高的NR2B表达。然而，在AcbSh的所有组中，NR2B的表达没有显著差异(第页>0.05(B） ，n个=5/组）。我们进一步测定了AMP/SUL处理对AcbCo和AcbSh中NR2A和NR2B亚基表达的影响。水对照组、乙醇对照组和乙醇-AMP-SUL（100和200 mg/kg，i.p(第页> 0.05 (D） ，n个=5/组）。同样，所有组的AcbSh中NR2A表达也没有显著变化(第页> 0.05 (D） ，n个=5/组）。
AMP/SUL处理（100 mg/kg和200 mg/kg，i.p.）5天对AcbCo和AcbSh中NR2B和NR2A表达的影响(A类)AcbCo和AcbSh中NR2B和β-微管蛋白的免疫印迹(B类)采用单因素方差分析和Newman-Keuls检验进行定量分析表明，与水对照组相比，乙醇对照组的NR2B表达显著降低，而AMP/SUL（100和200 mg/kg）治疗五天后，AcbCo中NR2B的表达正常化。采用单因素方差分析和Newman-Keuls检验进行定量分析表明，AcbSh中的水分对照组、乙醇对照组、酒精-AMP/SUL（100 mg/kg）和酒精-AMP/SUL（200 mg/kg）的NR2B表达没有显著差异(C类)AcbCo和AcbSh中NR2A和β-微管蛋白的免疫印迹(D类)采用单因素方差分析和Newman-Keuls检验进行定量分析表明，AcbCo中水分对照组、乙醇对照组、酒精-AMP/SUL（100 mg/kg）和酒精-AMP/SUL（200 mg/kg）的NR2A表达无显著差异。采用单因素方差分析和Newman-Keuls检验进行定量分析表明，AcbSh中的水对照、乙醇对照、乙醇-AMP/SUL（100 mg/kg）和乙醇-AMP/SUL（200 mg/kg）大鼠的NR2A表达也没有显著差异。任何组与水对照组之间的统计显著性符号显示在组的横条上。水对照组数据表示为100%（相对于水对照组）。数值表示为平均值±SEM(n个=5/组）(**第页< 0.01).
3.4. AMP/SUL（0或100或200 mg/kg）对慢性饮酒HAD1大鼠AcbCo和AcbSh中HMGB1和RAGE表达的影响
各组AcbCo中HMGB1的表达无明显变化(第页> 0.05 (B） ，n个=5/组）。单因素方差分析和Newman-Keuls多重比较事后分析表明，与水对照组相比，乙醇对照组AcbSh中HMGB1的表达增加，AMP/SUL剂量为200 mg/kg时，这种影响减弱，但不是100 mg/kg时(F类(3, 16) = 19.73,第页< 0.0001 (B） ，n个=5/组）。我们测定了水对照组、乙醇对照组和乙醇-AMP-SUL组AcbCo和AcbSh中RAGE的表达。单因素方差分析未显示这些组之间AcbCo中RAGE表达的任何差异(F类(3, 16) = 0.3135,第页= 0.8154 (D） ，n个=5/组）。然而，在这些组中，AcbSh中RAGE的表达发生了显著变化(F类(3, 16) = 23.92,第页< 0.0001 (D） ，n个=5/组）。与水对照组相比，慢性乙醇摄入后AcbSh中的RAGE表达增加，AMP/SUL剂量的增加减少了200 mg/kg，而不是100 mg/kg。
AMP/SUL处理（100 mg/kg和200 mg/kg，i.p.）5天对AcbCo和AcbSh中HMGB1表达的影响(A类)AcbCo和AcbSh中HMGB1和β-微管蛋白的免疫印迹(B类)采用单因素方差分析和Newman-Keuls检验进行定量分析表明，AcbCo中水分对照组、乙醇对照组、酒精-AMP/SUL（100 mg/kg）和乙醇-AMP/SLU（200 mg/kg）组HMGB1的表达无显著差异。采用单因素方差分析和Newman-Keuls检验进行定量分析表明，与水对照组相比，乙醇对照组HMGB1的表达显著增加，而AMP/SUL（200 mg/kg，但不是100 mg/kg）治疗五天后，AcbSh中HMGB1表达正常化。乙醇-AMP/SUL（100和200 mg/kg）组HMGB1的表达高于水对照组。(C类)AcbCo和AcbSh中RAGE和β-微管蛋白的免疫印迹(D类)采用单因素方差分析和Newman-Keuls检验进行定量分析表明，AcbCo中水分对照组、乙醇对照组、酒精-AMP/SUL（100 mg/kg）和酒精-AMP/SUL（200 mg/kg）组的RAGE表达无显著差异。采用单因素方差分析和Newman-Keuls检验进行定量分析表明，与水对照组相比，乙醇对照组的RAGE表达显著增加，而AMP/SUL（200 mg/kg，但不是100 mg/kg）治疗五天后，AcbSh中RAGE表达降低。乙醇-AMP/SUL（100和200 mg/kg）组的RAGE表达高于水对照组。任何组与水对照组之间的统计显著性符号显示在组的横条上。水对照组数据表示为100%（相对于水对照组）。数值表示为平均值±SEM(n个=5/组）(*第页< 0.05, **第页<0.01和$第页< 0.001).
3.5. AMP/SUL（0、100或200 mg/kg）对慢性饮酒HAD1大鼠AcbCo和AcbSh中TNF-α表达的影响
我们研究了长期饮酒和AMP-SUL治疗对AcbCo和AcbSh中TNF-α表达的影响(F类(3, 16) = 2.9625,第页= 0.0636 (B） ，n个=5/组）。然而，与水对照组相比，乙醇对照组的AcbSh中TNF-α表达显著升高。重要的是，事后分析显示AMP/SUL（100或200 mg/kg，i.p.）减弱了慢性乙醇摄入对AcbSh中TNF-α表达的影响(F类（3，16）=23.70，第页< 0.0001 (D） ，n个=5/组）。
AMP/SUL治疗（100 mg/kg和200 mg/kg，i.p.）5天对AcbCo和AcbSh中TNF-α表达的影响(A类)AcbCo中TNF-α和β-微管蛋白的免疫印迹。(B类)采用单因素方差分析和Newman-Keuls检验进行定量分析表明，AcbCo中的水对照、乙醇对照、乙醇-AMP/SUL（100 mg/kg）和乙醇-AMP/SUL（200 mg/kg）大鼠的TNF-α表达没有显著差异。(C类)AcbSh中TNF-α和β-微管蛋白的免疫印迹(D类)使用单因素方差分析和Newman-Keuls检验进行的定量分析表明，与水对照组相比，乙醇对照组的TNF-α表达显著增加，而AMP/SUL（100和200mg/kg）治疗5天后，AcbSh中的TNF-α表达降低。乙醇-AMP/SUL（100和200 mg/kg）组的TNF-α表达高于水对照组。任何组与水对照组之间的统计显著性符号显示在组的横条上。水对照组数据表示为100%（相对于水对照组）。数值表示为平均值±SEM(n个=5/组）(**第页<0.01和$第页< 0.001).
3.6. AMP/SUL（0或200mg/kg）对慢性饮酒HAD1大鼠AcbCo和AcbSh中mGluR5表达的影响
我们进一步测定了mGluR5在AcbCo和AcbSh中的表达。统计分析未显示AcbCo.中的水对照组、乙醇对照组和乙醇处理组（200 mg/kg AMP/SUL，i.p.）之间的任何显著变化(F类(2, 12) = 3.220,第页= 0.6863 (B） ，n个=5/组）。然而，Newman-Keuls事后分析后的单因素方差分析显示，与水对照组相比，乙醇对照组的mGluR5表达降低，AMP/SUL（200 mg/kg，i.p.）减弱了这种影响(F类(2, 12) = 8.625,第页= 0.0048 (D） ，n个=5/组）。
AMP/SUL治疗（200 mg/kg，i.p.）五天对AcbCo和AcbSh中mGluR5表达的影响(A类)AcbCo中mGluR5和β-微管蛋白的免疫印迹。(B类)采用单因素方差分析和Newman-Keuls检验进行定量分析表明，AcbCo中水分对照组、乙醇对照组和乙醇-AMP/SUL（200 mg/kg）组的mGluR5表达没有显著差异。(C类)AcbSh中mGluR5和β-微管蛋白的免疫印迹(D类)采用单因素方差分析和Newman-Keuls检验进行定量分析表明，与水对照组相比，乙醇对照组的mGluR5表达显著降低，而AMP/SUL（200 mg/kg）治疗五天后，AcbSh的mGlu R5表达增加。任何组与水对照组之间的统计显著性符号显示在组的横条上。水对照组数据表示为100%（相对于水对照组）。数值表示为平均值±SEM(n个=5/组）(**第页< 0.01).
4.讨论
这项研究证实，AMP/SUL治疗可以减弱P大鼠的酒精饮用行为，将之前关于AMP的研究结果扩展到HAD1大鼠作为另一种酒精中毒动物模型[11]. 此外，AMP/SUL治疗减弱了长期饮酒对AcbSh中GLT-1、HMGB1、RAGE和TNF-α表达的影响。与乙醇对照组相比，AMP/SUL还减弱了乙醇诱导的AcbCo中NR2B表达的降低。目前的数据表明，AMP/SUL至少部分通过调节谷氨酸能活性来减轻乙醇饮用行为和神经炎症。
目前的研究结果表明，AMP/SUL（100 mg/kg或200 mg/kg，腹腔注射）可减少乙醇饮用，并使AcbSh中GLT-1的表达正常化。我们实验室的其他研究发现，头孢曲松减少乙醇饮用，同时上调p大鼠Acb中GLT-1的表达[12，13]. 此外，我们的实验室报告称，五天的AMP治疗可以减弱P大鼠的乙醇饮用行为，这种作用与上调Acb中GLT-1的表达有关[11]. 此外，β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸和SUL显示出上调大鼠GLT-1表达的能力[15，16，68]. 在本研究中，我们发现九周的乙醇摄入降低了AcbSh中GLT-1的表达，但AcbCo中没有，AMP和SUL的联合作用减弱了这种作用。这与我们实验室先前的研究一致，该研究表明，连续五周饮用乙醇会导致Acb中GLT-1表达下调[三，69]. 我们以前曾报道过，长期饮用乙醇约7–8周后，P大鼠AcbSh中GLT-1表达降低，但AcbCo中没有降低[70]. 目前的研究和我们实验室以前的研究表明，在使用β-内酰胺类抗生素治疗期间，水摄入量的增加可能是对乙醇摄入量减少的一种补偿反应[13，14]. 在治疗的第1天，与乙醇对照组相比，AMP/SUL治疗组的食物摄入量显著减少。我们认为，这是由于AMP/SUL静脉注射的常见副作用导致的食物摄入量减少。综上所述，这些研究表明，长期饮酒会下调AcbSh中GLT-1的表达，这可能导致中层皮质边缘奖赏回路这一区域的谷氨酸细胞外浓度增加[三].
在本研究中，九周的酒精饮用降低了AcbCo中NR2B的表达，但AcbSh中没有。重要的是，以前的报告显示，长期酒精暴露调节了额叶皮层和海马中NR2B的表达[28]. 例如，慢性酒精摄入增加了成年Wistar大鼠海马NR2B的表达，而额叶皮层NR2B表达下调[28]. 此外，成年和青春期大鼠在慢性乙醇暴露后，无论是检查24小时还是2周的乙醇戒断，NR2B的表达模式都不同[27，28]. 此外，慢性应激也降低了Acb中NR2B的细胞膜表达[71]. 此外，慢性应激降低了雄性Sprague-Dawley大鼠前额叶皮层NR2B的表达[72]. 似乎多种因素，如大脑区域、乙醇和/或应激暴露范式，以及所使用的大鼠系都可以影响中层皮质边缘系统中NR2B表达的改变。我们在这项研究中的结果表明，在AcbCo中观察到乙醇诱导的NR2B减少，AMP/SUL治疗减弱了这一效果，尽管另一项研究表明，6个月暴露于15%和30%的自由选择乙醇诱导P大鼠AcbCo和杏仁核中央核（CeA）中NR2B表达增加[8]. NR2B表达的改变可能是慢性乙醇暴露对谷氨酸稳态影响的一种神经适应机制。由于NR2B在AcbSh中的表达不受影响，但在AcbCo中表达减少，因此我们在本研究中假设，AcbSh中细胞外高浓度的谷氨酸可能会激活NMDA受体的NR2B亚单位。这种效应可能导致神经炎症因子的上调作用。
据报道，饮用乙醇对P大鼠AcbCo、AcbSh和CeA中NR2A表达的不同影响取决于乙醇摄入类型（间歇与连续）和乙醇戒断时间（24小时与4周）[8]. 其他研究也报告称，乙醇暴露会影响Wistar大鼠海马和额叶皮质中NR2A的表达[27，28]. 然而，本研究并未证明HAD1大鼠AcbCo或AcbSh中NR2A的表达有任何显著变化。值得注意的是，P大鼠来源于Wistar大鼠的封闭群体[55，56，57]. 这一点很重要，因为HAD1大鼠来源于八个近交系大鼠杂交品系，其中包括非Wistar近交系的大鼠[55，56，57]. 因此，遗传学可能在发现的多样性中发挥作用。然而，对于HAD1大鼠，NR2A亚单位似乎不受酒精摄入的影响，至少在本研究的条件下是如此。
除了NMDAR和GLT-1的改变外，我们还发现HAD1大鼠AcbSh中的神经炎症信号通路，包括HMGB1、RAGE和TNF-α，也发生了改变。我们的结果表明，长期饮酒可增加HMGB1、RAGE和TNF-α的表达，同时降低AcbSh中GLT-1的表达，与脑内TNF-α上调相关，但与血清中TNF-[73]. 我们在这里表明，长期饮酒会增加AcbSh中TNF-α和HMGB1的表达，但不会增加AcbCo中的表达。乙醇间歇治疗两周后，在青春期雌性小鼠的前额叶皮层中也发现乙醇对TNF-α水平的上调作用[74]. 研究表明，在最后一次乙醇治疗后，血液中的TNF-α水平升高了3小时，而大脑中的TNF-α水平在较长时间内保持上调[73]. 此外，本研究表明，乙醇对照组ACbSh中HMGB1受体RAGE的表达增加。值得注意的是，酒精暴露5周后，C57BL/6J雌性小鼠小脑中RAGE和HMGB1的mRNA表达以及乙酰化和磷酸化HMGB1（但不是总HMGB1）蛋白水平升高[75]. 然而，AMP/SUL治疗（200 mg/kg）使TNF-α、RAGE和HMGB1的水平正常化，表明神经炎症的激活和Acb中谷氨酸系统的失调与慢性乙醇饮用有关。有趣的是，之前的一项研究发现谷氨酸/NMDA注射诱导的兴奋毒性，谷氨酸/NMMA注射能够增加海马内嗅皮质细胞浴中的介质乙酰基-HMGB1，这与HMGB1分泌的神经元相一致[76]. 后一项研究还报道，在用NR2B抑制剂伊芬地尔治疗后，这种作用消失了。另一项研究报告称，NR2B拮抗剂（Ro25-6981），而不是NR2A拮抗剂（NVP-AAM077），能够减弱NMDA处理的皮层神经元中HMGB1的表达[77]. 因此，谷氨酸可能通过刺激突触后谷氨酸受体，特别是包括NR2B亚单位的受体，诱导神经炎症。此外，AMP/SUL处理（200 mg/kg）上调GLT-1与AcbSh中HMGB1、RAGE和TNF-α的降低相关，这表明恢复细胞外谷氨酸浓度可以减轻酒精摄入和神经炎症。然而，AMP/SUL（100 mg/kg，i.p.）仅减弱TNF-α表达，但HMGB1和RAGE均无显著降低。重要的是，与AMP/SUL（100 mg/kg，i.p.）组相比，AMP/SUL（200 mg/kg，ip.）组在AcbSh中的GLT-1表达更高。这些发现与之前的一项研究一致，该研究表明头孢曲松治疗通过调节帕金森病动物模型中的谷氨酸能通路减轻了神经炎症[18]. 另外，研究表明，乙醇有能力将肠道微生物成分转移到循环系统中，这可能通过肠-脑相互作用导致神经炎症[76，78]. 口服含有100 mg/kg AMP的混合抗生素可减轻C57BL/6J雌性小鼠肠道中的细菌负荷和相关的神经炎症，从而靶向该途径[76]. 这增加了AMP/SUL治疗可能通过肠-脑途径减轻神经炎症的可能性。综上所述，β-内酰胺类抗生素可能通过HMGB1炎症途径的正常化、保护肠道微生物群和调节谷氨酸途径来减弱RAGE和TNF-α的表达。
我们进一步测定了九周的乙醇饮用和AMP/SUL（200 mg/kg，i.p.）治疗对AcbCo和AcbSh中mGluR5蛋白表达的影响。我们发现，与乙醇初始组相比，乙醇对照组的AcbSh中mGluR5表达降低。AMP/SUL处理减弱了这种效应。有趣的是，mGluR5的激活通过减少体外一氧化氮、TNF-α和活性氧生成发挥抗炎作用[40]. 此外，mGluR5激动剂（VU0360172或CHBG）治疗后，炎症细胞因子、IL-1b、IL6和TNF-α的蛋白和mRNA表达降低[79]. 我们的数据表明，mGluR5和神经炎症蛋白之间存在相互作用，AMP/SUL在长期暴露于乙醇的大鼠中调节这些途径。
5.结论
总的来说，本研究报告称，慢性乙醇摄入降低了HAD1大鼠AcbSh（而非AcbCo）中GLT-1的表达。这反过来又会增加AcbSh中的细胞外谷氨酸浓度。由于AcbCo中NR2B表达减少，但AcbSh中未发生变化，AcbSh中的高谷氨酸浓度可能会进一步刺激含有NMDA受体的NR2B亚单位。AcbSh中NR2B的过度刺激也可能与AcbSh中激活的神经炎症参数（HMGB1、RAGE和TNF-α）有关。因此，AMP/SUL治疗可对抗慢性乙醇诱导的GLT-1下调以及AcbCo中NR2 B的表达。同时，AMP/SUL治疗逆转了乙醇诱导的HAD1大鼠AcbSh神经炎症标记物的上调。此外，我们的数据显示，乙醇对mGluR5的下调作用与AcbSh中HMGB1、RAGE和TNF-α水平的上调有关，AMP/SUL调节了这些通路，这进一步表明了mGluR的抗炎特性。然而，兴奋性毒性与神经炎症或乙醇摄入与神经炎症之间的因果关系和相互影响需要进一步验证。此外，未来的研究需要使用免疫细胞化学和体视学系统研究涉及这些兴奋性和神经炎症靶蛋白的神经元或细胞类型。由于我们的研究是使用雄性大鼠模型进行的，未来的研究需要在雌性动物模型中验证这些发现。目前的研究结果表明，长期接触乙醇可调节谷氨酸能和神经炎活性，β-内酰胺类抗生素（即AMP）和β-内酰酶抑制剂（即SUL）有可能恢复这些系统中的体内平衡。
作者贡献
F.A.和H.A.参与了研究设计和概念化，起草和修订了手稿，进行了脑解剖、蛋白质分析和Western blot分析，并收集了数据。W.W.进行了western blot分析，收集数据并帮助编辑手稿。R.L.B.构思并设计了这项研究，批判性地修改了手稿中的智力内容，进行了饮酒测量，并批准了手稿的最终版本。Y.S.构思并设计了研究，批判性地修改了手稿的知识内容，并批准了手稿最终版本。所有作者都已阅读并同意手稿的出版版本。
基金
本研究得到了美国国立酒精滥用和酒精中毒研究所（National Institutes on Alcohol Abuse and Alcoholism）AA019458（Y.S.）和AA13522（R.L.B.）的资助。作者还感谢沙特国王大学国际科学伙伴计划ISPP通过ISPP-146资助这项研究工作。
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