新发现的冠状病毒是严重急性呼吸综合征的主要病因

摘要

介绍

严重急性呼吸综合征（SARS）是2002年11月在中华人民共和国广东省首次报告的一种紧急疾病，从那里传播到其他亚洲国家、北美和欧洲。1,2,三,4,5截至2003年7月3日，这一流行病在全球造成8439例报告病例，其中812例死亡。⁶

SARS患者的肺部病变已被诊断为弥漫性肺泡损伤。组织学变化包括肺细胞脱屑，形成透明膜，肺泡腔充满混合有炎性细胞的水肿液，肺细胞和合胞体增大。肺泡壁因轻度单核浸润而增厚，在后期的空气中含有纤维粘液样渗出物。2,4,5,7,8通过透射电子显微镜在肺活检样本的细胞中检测到冠状病毒样颗粒²和支气管肺泡灌洗样本，⁷以及死后肺样本中的肺细胞。⁸迄今为止，SARS相关病变中SARS-相关冠状病毒（SARS-CoV）的免疫组织化学检测尚未成功。⁷

确定SARS的病因对于准确定义病例、准确诊断疾病以及制定适当的预防和治疗措施至关重要。在SARS的调查过程中提出了几种制剂。在中国的初步调查中，肺炎支原体和衣原体提出了sp可能的原因。9,10随后的研究排除了这些病原体和其他已知的病毒和细菌病原体，三,4除了人偏肺病毒。⁵SARS患者中发现一种未知冠状病毒。2,7,11有人认为，这种冠状病毒单独或与人偏肺病毒或其他致病因子联合可能是SARS的主要病因。

我们通过分析世界卫生组织实验室网络的调查结果，调查了新发现的严重急性呼吸系统综合征冠状病毒的因果作用，表明严重急性呼吸系统综合征冠状病毒是唯一在可能患有严重急性呼吸系统综合征的患者中持续出现的病原体。我们还研究了实验感染的食蟹猴是否可以复制SARS的呼吸道损伤（猕猴）复制基于组织病理学，如初步报告中所述，¹²以及通过免疫组织化学和透射电镜对典型肺部病变进行SARS-CoV定位。

方法

猕猴调查

我们从死于SARS的患者5688中获得的SARS-CoV分离物的第四代中制备了用于接种食蟹猴的病毒库，并将其接种到在Iscove's Modified Dulbeco’s Medium（美国马里兰州沃克斯维尔市Bio Whitaker）培养基中培养的Vero 118细胞上。在270 g离心5分钟后，从上清液和颗粒细胞中提取1 mL样品，并将其重新悬浮在5 mL培养基中。该病毒株的滴度为1×10⁶中位组织培养感染剂量₅₀)每毫升。所有细胞培养均在3级生物安全条件下进行。

将四只成年食蟹猴（两只雄性和两只雌性）置于负压手套箱中。他们感染了1×10⁶TCID公司₅₀将SARS-CoV悬浮在5 mL磷酸盐缓冲盐水中。气管内注射4mL，鼻内注射0.5mL，每个结膜上注射0.25mL。我们每天检查猕猴的临床症状。就在感染前以及感染后第2、4和6天，我们用氯胺酮对猕猴进行麻醉，并从腹股沟静脉采集10 mL血液，取鼻、口、咽和直肠拭子，将其置于1 mL病毒运输介质中。¹⁹在麻醉期间，我们还用舌头下的拭子和口腔内的海绵采集了3号和4号猕猴的痰标本。我们通过离心从海绵中提取液体。感染后6天，在氯胺酮麻醉下抽血处死猕猴。

我们按照标准方案对猕猴进行了尸检。为了进行组织学检查，我们收集了以下组织：肾上腺、主动脉、腋窝淋巴结、肱二头肌、脑干、盲肠、小脑、大脑、结肠、十二指肠、眼睛、眼睑、股骨骨髓、心肌（左右）、回肠、腹股沟淋巴结、空肠、肾脏、，肺（用10%中性缓冲福尔马林充气）、肝脏、下颌淋巴结、肠系膜淋巴结、鼻中隔、食道、胰腺、主支气管、卵巢、前列腺、唾液腺、皮肤、脾脏、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、舌、扁桃体、气管、气管支气管淋巴结、膀胱和子宫。用于光学显微镜检查的组织用10%中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，4 um切片用苏木精和伊红染色。根据标准免疫组织化学程序，用单克隆抗体AE1/AE3（Neomarkers，Fremont，CA，USA）对选定的肺切片进行染色，以鉴定上皮细胞，用单抗CD68（Dako，Glostrup，Denmark）鉴定巨噬细胞。

我们开发了一种检测SARS-CoV抗原的免疫组织化学方法。用抗生物素-生物素复合物过氧化物酶法对所有组织样品的重复切片进行染色。将石蜡从切片中去除，然后在37°C下用蛋白酶（美国密苏里州圣路易斯市西格玛）进行再水化和预处理10分钟。用4-氯-1-萘酚（Sigma）显示内源性过氧化物酶。用亲和素-生物素阻断试剂盒阻断内源性生物素（Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA）。用0.05%的磷酸盐缓冲液Tween 20（瑞士布赫市福禄卡）对载玻片进行短暂清洗，并用恢复期SARS患者的生物素化纯化人IgG、阴性对照生物素化的纯化人Ig G或稀释缓冲液（含有1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水）培养载玻片在室温下保持1小时。清洗后，在室温下用亲和素-生物素复合物-辣根过氧化物酶（Dako）培养切片1小时。通过将载玻片在3-氨基-9-乙基咔唑（Sigma）溶液中孵育10分钟来揭示辣根过氧化物酶活性，产生亮红色沉淀。切片用苏木精复染。未感染SARS-CoV的食蟹猴组织切片作为阴性对照。我们将福尔马林固定、石蜡包埋的SARS-CoV感染或未感染的Vero 118细胞分别作为阳性和阴性对照。

对于负对比电子显微镜，组织培养上清液样品在4°C下以17000 g离心，然后将颗粒重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水中，并用磷钨酸染色。短尾猴3的肺样品在10%中性缓冲福尔马林中短暂固定后，在4%甲醛和1%戊二醛中固定，并在1%四氧化锇中固定后，进行透射电镜观察。包埋在环氧树脂中后，制备薄片，用6%饱和醋酸铀酰和柠檬酸铅染色，并用Philips Morgagni 268D电子显微镜检查。

死后采集肺、十二指肠、空肠、肾脏、肝脏和脾脏的样本进行病毒分离和RT-PCR。此外，我们仅收集了以下样本进行RT-PCR：小脑、大脑、回肠、结肠肠内容物、肠系膜淋巴结、鼻中隔、胰腺、皮肤、脾脏、胃、扁桃体、气管、气管支气管淋巴结、膀胱和尿液。从猕猴3和4中，还收集了空肠、回肠和盲肠中的肠道内容物样本进行RT-PCR。在进一步处理之前，用粪便运输和回收缓冲液（德国曼海姆罗氏诊断公司）对肠道内容物进行预处理。组织样品在4 mL运输介质中匀浆¹⁹使用Polytron PT2100卫生纸研磨机（Kinematica，瑞士利托-卢塞恩）。低速离心后，将匀浆在−70°C下冷冻，直到接种对数稀释的Vero 118细胞培养物。感染病毒滴度表示为TCID₅₀/g组织。通过上清液的RT-PCR，确认分离病毒的身份为SARS-CoV。

由于冠状病毒复制周期的性质，我们开发了一种带有SARS-CoV核蛋白基因特异性引物和探针的RT-PCR²⁰这表明，这种检测可能比基于聚合酶基因的RT-PCR更敏感，目前用于诊断。在Magnapure LC自动核酸分离系统（罗氏诊断公司）上进行核酸分离。用Magnapure LC总核酸血清血浆分离试剂盒处理拭子、粪便和血清。使用Magnapure LC站上的Magnapure-LC RNA分离试剂盒I，使用外部裂解方案处理死后组织样本。使用EZ rTtH RNA扩增试剂盒（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）在ABI棱镜7700上检测到SARS-CoV RNA。使用特异于严重急性呼吸系统综合征冠状病毒核蛋白（NP）基因的引物SARSNP fpr1（5′-CAAACATTGGCCG CAAATT-3′）、SARSNP rpr1（5′-CAATGCGACA TTCCAAAGA-3′）和探针SARSNP prb1（5′-CAATTGTGTGCCCAAGTGCCTTGCA-3′）（Eurogentec）进行扩增。扩增参数为50°C下2 min，60°C下30 min，95°C下5 min，95℃下45个周期30 s，62°C下1 min。

我们比较了SARS-CoV的敏感性NP公司用SARS-CoV聚合酶rtPCR进行rtPCR，该rtPCR使用与SARS-CoV聚合酶特异性引物和探针基本相同的方法（SARSTM fpr1 5′-TGTCGCAAGTAGTAAGTGAGATG-3′，SARSTM rpr1 5’-CACCGGATGTTCCACC-3′，SARST M prb1 5′-FAMTCATGTGGCTCA CTATGTTAAACC-TAMRA-3′）。对来自患者5688的SARS-CoV病毒库存和SARS-CoV-感染Vero细胞进行系列稀释，并用NP公司和聚合酶特异性RT-PCR。

使用基本相同的RT-PCR方法，但使用特定引物，监测呼吸道样本（鼻拭子、咽拭子，死后气管和肺样本）中的流感A和B病毒，呼吸道合胞病毒A和B，鼻病毒，冠状病毒（OC43和229E）和人偏肺病毒。

我们用间接免疫荧光法检测猕猴血清中SARS-CoV抗体。使用严重急性呼吸系统综合征冠状病毒感染的Vero 118细胞对显微镜载玻片进行包被，这些细胞已产生细胞病变效应。在37°C下培养血清30分钟后，用磷酸盐缓冲盐水清洗载玻片，并用抗人IgG、IgA和IgM孵育，再与硫氰酸荧光素（Dako）结合。清洗和干燥后，用荧光显微镜（德国奥伯科钦蔡司Axioscope）对载玻片进行检查。

我们在荷兰鹿特丹Erasmus MC医学微生物学和传染病部用常规细菌学方法（用血琼脂、巧克力琼脂和麦康基琼脂）在需氧和厌氧条件下对肺拭子和血液样本进行了细菌病原学检测。检测肺组织匀浆中是否存在肺炎衣原体使用通用引物进行PCR衣原体服务提供商²¹和针对C的特异性引物肺炎。 ²²

资金来源的作用

研究发起人在研究设计、数据收集、数据分析、数据解释或报告撰写过程中没有任何作用。

结果

总的来说，根据who病例定义，75%的疑似SARS患者被诊断为感染了可能的SARS-CoV，而12%被诊断为人类偏肺病毒感染(表2). 被诊断为人类偏肺病毒感染的患者比例较高，这主要归因于队列4，其中36%的患者对此感染呈阳性。如果没有这个队列，人类偏肺病毒诊断的总比例下降到4%。SARS-CoV感染检测阴性的患者的替代诊断为流感（5例），肺炎支原体感染（一种），以及军团菌sp感染（1例）。

感染后第2-3天，三只猕猴（1、2和4）开始昏睡。猕猴1和2在感染后第4天出现暂时性皮疹。猕猴2号从感染后第4天起出现呼吸窘迫，包括呼吸频率增加和呼吸困难。猕猴2-4的两个肺都有多个肺实变灶。巩固的肺组织呈灰红色，坚实，水平，浮力低于正常。这些猕猴的气管支气管淋巴结和脾脏大约是正常大小的两倍。这三只猕猴的其他器官以及1号猕猴的呼吸道和其他器官在显微镜下检查均正常。

猕猴2-4巩固肺组织的主要病变涉及肺泡和细支气管，包括急性或晚期弥漫性肺泡损伤的区域。在这些区域，肺泡和细支气管的腔内充满了丰富的蛋白质水肿液、纤维蛋白、红细胞和细胞碎片、适量的肺泡巨噬细胞，以及较少的中性粒细胞和淋巴细胞(图1). 其中一些巨噬细胞的细胞质中含有红细胞或水肿液池。肺泡壁和细支气管壁的上皮细胞大量脱落。在弥漫性肺泡损伤较严重的区域，肺泡壁中度增厚，并由立方上皮细胞排列（2型肺细胞增生），肺泡腔主要包含肺泡巨噬细胞(图1). 一些细支气管上皮再生，可见一层不规则的鳞状上皮细胞到高立方上皮细胞，细胞核深染。在某些区域，肺泡壁被深嗜酸性透明膜所覆盖(图1). 在细支气管和肺泡中偶有多核巨细胞（合胞体），要么附着在管壁上，要么游离在管腔中(图1). 这些合胞体有多达30个外周核，富含透明嗜酸性细胞质，根据CD68阳性染色和pan-keratin阴性染色，起源于巨噬细胞。肺泡壁上经常发现2型肺细胞增大，细胞核大空泡化，核仁突出，胞浆丰富(图2). 角蛋白的表达证实了这些细胞的上皮起源(图2). 相比之下，肺泡巨噬细胞的细胞核较小，核仁不太突出，并且在肺泡腔中通常较为疏松(图2). CD68染色证实这些细胞为巨噬细胞(图2). 水肿液、单核细胞和中性粒细胞使肺泡和细支气管壁增厚。肺小血管周围有淋巴细胞聚集。支气管壁固有层和粘膜下层中有适量的淋巴细胞和巨噬细胞，支气管上皮中有少量中性粒细胞。

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图1

SARS-CoV感染食蟹猴肺部的组织学病变

A： 弥漫性肺泡损伤的早期变化，特征是肺泡壁破裂，肺泡腔充满血性渗出物，并与中性粒细胞和肺泡巨噬细胞混合。B： 弥漫性肺泡损伤的更高级变化，特征是肺泡壁增厚，内衬2型肺细胞，主要是肺泡腔内的肺泡巨噬细胞。C： 箭头所示为肺泡表面的透明膜。D： 一个特征性变化是在细支气管管腔出现合胞体（箭头）。所有载玻片均进行苏木精和伊红染色。

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图2

SARS-CoV感染食蟹猴肺细胞的免疫组织化学鉴定

A： 箭头显示2型肺泡细胞增大，胞质丰富，胞核大，核仁突出，常沿肺泡壁出现；苏木精和曙红。B： 单克隆抗体AE1/AE3（泛角蛋白标记物）阳性染色证实上皮起源；亲和素-生物素复合免疫过氧化物酶与二氨基联苯胺底物和苏木精复染。C： 箭头显示肺泡腔内常见的肺泡巨噬细胞；苏木精和伊红。D： 巨噬细胞来源通过单克隆抗体CD68（巨噬细胞标记物）阳性染色证实；亲和生物素复合免疫过氧化物酶与二氨基联苯胺底物和苏木精复染。

猕猴2-4的其他组织变化为气管支气管淋巴结的弥漫性淋巴增生和窦性组织细胞增生。猕猴2和3的脾脏也有弥漫性滤泡内透明变性。猕猴1的肺组织中存在最小的多灶炎症损伤，包括肺泡巨噬细胞数量增加（每个肺泡约10个），肺泡和细支气管中偶尔出现合胞体。

使用SARS患者的生物素化IgG组分，在少数到中等数量的肺泡上皮细胞（2型肺细胞；图3)以及罕见的支气管内和肺泡内合胞体(图3)在2-4只猕猴发炎的肺组织中。SARS-CoV免疫组化染色阳性，胞浆呈弥漫性红棕色染色。染色特征与SARS-CoV感染的Vero 118细胞（阳性对照）相似，而未感染的Vero118细胞和未感染猕猴的肺组织（阴性对照）染色为阴性。免疫组化显示，这三只猕猴的其他组织以及猕猴1的肺和其他组织均未表达SARS-CoV。

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图3

实验感染食蟹猴肺SARS-CoV的免疫组织化学检测

A： 两个肺泡上皮细胞表达严重急性呼吸系统综合征冠状病毒抗原，可能是2型肺细胞。SARS患者恢复期血清免疫球蛋白G组分作为特异性抗体；亲和素-生物素复合免疫过氧化物酶与二氨基联苯胺底物和苏木精复染。B： 肺泡管腔内合胞体表达SARS-CoV抗原。沿导管壁的小细胞也染色阳性；含3-氨基-9-乙基咔唑底物和苏木精的亲和素-生物素复合免疫过氧化物酶复染。

超微结构上，在3号猕猴炎症肺组织的扩大肺泡上皮细胞（2型肺泡细胞）中发现直径约70 nm的冠状病毒样颗粒，具有典型的内部核衣壳样结构和棒状表面突起。颗粒位于光滑的囊泡内，通常与高尔基体密切相关(图4). 在感染SARS-CoV的Vero 118细胞中，炎症肺组织中的颗粒在大小和结构上与冠状病毒颗粒相似(图4).

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图4

实验感染食蟹猴的接种物、临床样本和组织样本中SARS-CoV的电镜观察

A： 接种食蟹猴的病毒株的阴性对照电子显微镜显示冠状病毒颗粒典型的棒状表面投影；磷钨酸负染，bar=100nm。B： 从感染猕猴的鼻拭子中分离出形态相同的颗粒；磷钨酸负染，bar=100nm。C： 感染Vero 118细胞的透射电镜显示，病毒核衣壳在细胞质中的光滑小泡中具有可变的电子密度和电子透明核；用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色，bar=500 nm。D： 形态相似的颗粒出现在感染猕猴的肺部病变中，位于肺细胞高尔基体的囊泡内；醋酸铀酰和柠檬酸铅染色；巴=500纳米。

NP公司-特异性RT-PCR对病毒库和感染细胞稀释系列的敏感性约为聚合酶基因RT-PCR的100倍。这个NP公司根据SARS-CoV感染猕猴样本中病毒RNA的检测，RT-PCR也更为敏感（数据未显示）。

从感染后2天起，猕猴从痰液、鼻子和咽部排出严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(表3). SARS-CoV分别于感染后2天从2只猕猴的鼻拭子和咽喉拭子、感染后2、4和6天从4只猕猴咽拭子以及感染后2和6天来自4只猕猴猴的痰标本中分离。未测量这些样品中的病毒滴度。其他几个临床样本仅通过RT-PCR呈阳性(表3). 通过负对比电子显微镜，从鼻拭子获得的细胞培养物中可以看到冠状病毒颗粒(图4)与感染猕猴的病毒库中的病毒非常相似(图4). 直肠拭子中未检测到病毒。从肺部分离出SARS-CoV（1×10⁵TCID公司₅₀/g组织）和肾脏（1×10^三TCID公司₅₀/g组织）猕猴2和来自肺（1×10⁴TCID公司₅₀/g组织）。未从1号或3号猕猴的死后样本中分离出病毒。其他几个组织仅通过RT-PCR呈阳性(表4). 感染后第6天，没有猕猴检测到SARS-CoV抗体。

用RT-PCR对所有四只猕猴的鼻拭子、咽拭子以及气管和肺样本进行甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒A和B、鼻病毒、冠状病毒（OC43和229E）和人偏肺病毒的病毒学检查均为阴性。

肺部和血液样本的细菌学培养未发现相关病原体。肺匀浆检测阴性衣原体sp和肺炎支原体通过PCR。

讨论

根据Rivers针对病毒疾病修改的Koch假设，²³要使某一特定微生物成为疾病的致病因素，需要满足六个标准。本文和早期研究中对SARS患者临床和死后样本的实验室调查2,5,7,11已经达到了前三个标准：从患病宿主中分离病毒，在实验宿主或宿主细胞中培养，以及可过滤性证明（排除较大的病原体）。我们对SARS-CoV感染猕猴的研究结果满足了剩下的假设——在原始宿主或相关物种中产生类似的疾病，以及病毒的再分离。在实验感染后检测到对病毒的特异性免疫反应已经有报道。¹²总之，这些发现证明SARS-CoV是SARS的主要病因。

世卫组织实验室的累积研究表明，SARS-CoV在SARS病因中的主要作用，在这些研究中，大多数SARS患者被诊断为SARS-CoV感染，通常是在没有其他呼吸道病原体的情况下。SARS患者最常见的合并感染是人偏肺病毒。队列4中与人偏肺病毒共同感染的SARS患者大多是来自同一病房的医务工作者，他们共用休息区。SARS爆发期间这种感染在他们中间的传播可能解释了队列4中感染的频率。同样，四名来自加拿大的SARS患者感染了SARS-CoV和人偏肺病毒。⁵人偏肺病毒感染的临床症状从轻度上呼吸道疾病到严重的毛细支气管炎和肺炎不等。²⁴人类偏肺病毒感染在SARS恶化中的可能作用尚待评估。

偶尔在符合SARS病例定义但SARS-CoV感染检测阴性的患者中进行替代诊断，如流感。因此，根据目前的病例定义，严重急性呼吸系统综合征冠状病毒感染引起的疾病与其他原因的呼吸道疾病重叠。在非典不流行的地理区域，最有可能进行其他诊断。

SARS-CoV感染猕猴的肺部病变与SARS患者相似，2,4,5,7,8以及其他呼吸道冠状病毒感染者，如大鼠唾液腺病毒感染，²⁵猪呼吸道冠状病毒感染。²⁶

SARS-CoV感染猕猴的细支气管中普遍存在合胞体，肺泡导管和肺泡中的合胞体较少。SARS患者的肺泡中也有突触。三,7,8根据CD68和泛角蛋白的表达，合胞体在猕猴中起源于组织细胞（本研究），在SARS患者中来源于组织细胞或上皮。⁸这些猕猴的合胞体形成可能是由SARS-CoV感染诱导的，因为一些合胞体经免疫组织化学染色呈SARS-CoV阳性，冠状病毒的棘突蛋白诱导细胞间融合。²⁰SARS-CoV感染的猕猴（本研究）和SARS患者的肺细胞均表现为巨细胞、细胞核增大和核仁突出。2,8增生性2型肺细胞的这种增大和细胞学异型性通常发生在组织弥漫性肺泡损伤中，并且是非特异性的。²⁷

在组织学样本中鉴定SARS-CoV抗原的特异性免疫组织化学试验的发展使我们能够评估猕猴SARS-CoV感染的细胞嗜性。SARS-CoV在肺部的表达仅限于肺炎区域，并局限于2型肺细胞和合胞体的细胞质。透射电镜证实2型肺细胞感染冠状病毒。这些发现与在SARS患者死后肺样本的肺细胞中检测到冠状病毒样颗粒相一致，⁸猪和大鼠的呼吸道冠状病毒对呼吸道上皮有嗜性，偶尔也有肺泡巨噬细胞。25,26

根据组织学变化，猕猴SARS-CoV感染主要影响肺泡和细支气管上皮。在安乐死时，感染后6天，大多数肺部区域显示早期至晚期2型肺细胞增生，表明1型肺细胞丢失后肺泡壁修复。组织学变化的时间顺序与猪实验感染猪呼吸道冠状病毒的时间顺序一致，在感染后第2-6天出现急性变化（上皮细胞丧失、巨噬细胞和气道管腔内纤维蛋白的存在），感染后7～11天出现更为严重的变化（2型肺细胞增生，间质单核细胞浸润）。²⁶由于不同原因引起的弥漫性肺泡损伤遵循一条共同的途径，27,28这些猕猴的慢性变化可能包括肺泡内渗出物的组织，导致肺泡纤维化和闭塞性细支气管炎，正如SARS患者在病程后期死亡所见。三,4,5纤维化的发展取决于肺泡中纤维蛋白的沉积，而不是病毒感染的持续存在。纤维化的发作是慢性弥漫性肺泡损伤的一个关键特征，因为它会导致肺泡功能的丧失，并且是不可逆转的。²⁷

在猪和大鼠的呼吸道冠状病毒感染中，呼吸道上皮的病毒感染在感染后第3-4天达到最大值，而在第6-9天无法测量。25,29首次感染后感染细胞的迅速消失可能解释了为什么SARS-CoV在1型肺细胞中没有发现，而在这些猕猴的2型肺细胞内偶尔发现。这也可能减少通过免疫组织化学方法在SARS患者死后肺组织中检测SARS-CoV的机会。

实验感染猕猴脾脏滤泡的淋巴耗竭与SARS患者的淋巴耗损相一致⁸猪呼吸道冠状病毒感染。²⁹根据这些发现，再加上SARS患者的白细胞减少，2,三,4,5我们推测SARS-CoV感染会抑制免疫力，并可能使受感染的宿主容易发生二次感染，例如麻疹病毒感染。³⁰

对实验感染猕猴的临床和尸检样本进行的病毒学检查表明，呼吸道是最重要的病毒来源，人类可能也是如此。¹³与SARS患者不同，¹³在这些猕猴的尿液或粪便中未检测到SARS-CoV，尽管在之前的实验中粪便检测呈阳性。¹²这一发现可以部分解释为实验的早期截止点（感染后6天），因为SARS患者在康复后期的粪便中检测到SARS-CoV RNA。¹¹在没有病毒复制证据的情况下，通过RT-PCR在感染猕猴的膀胱、胃、十二指肠、大脑和脾脏中零星检测到SARS-CoV（基于病毒培养或免疫组织化学），这表明病毒从其他组织溢出，例如通过血液。从一只猕猴肾脏中分离出SARS-CoV表明病毒在该部位复制，但免疫组织化学无法证实这一理论。

事实证明，基于核蛋白引物的RT-PCR比基于聚合酶引物的现有RT-PCR敏感100倍。据推测，这种差异是由于冠状病毒RNA转录的梯度，即高浓度的核蛋白RNA和低浓度的聚合酶RNA。²⁰

总之，这些对SARS患者和猕猴实验感染的实验室研究结果证明，新发现的SARS-CoV是SARS的主要致病因子，SARS-CoV感染主要影响下呼吸道上皮，可能对呼吸功能造成严重后果。

致谢

利益冲突声明

贡献者

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