冠状病毒可能导致严重急性呼吸综合征

总结

2003年4月8日在线发布http://image.thelancet.com/extras/03art3477web.pdf

介绍

据报道，自2002年11月以来，在中华人民共和国广东省爆发的非典型肺炎疫情已影响792人，造成31人死亡。¹在邻近的香港，香港医院管理局下属的公立医院网络加强了对严重非典型肺炎的监测。截至2003年2月底，香港发现了一批肺炎患者，以及受影响的密切接触者和医护人员。该病对急性社区获得性典型或非典型肺炎的经验性抗菌治疗无效。导致肺炎的已知细菌和病毒学病原体尚未确定。因此，这种新的疾病被称为严重急性呼吸综合征（SARS）。随后，SARS在全球范围内蔓延，涉及北美、欧洲和其他亚洲国家的患者。¹我们调查了香港的患者，试图找出病因。

方法

在这项研究中，我们纳入了2003年2月26日至3月26日期间在香港三家急性地区医院入院的50名符合世卫组织对SARS定义的患者。²简言之，病例定义为38℃或以上的发热、咳嗽或气短、胸片上新的肺部浸润、SARS患者的接触史或典型和非典型肺炎（β内酰胺类和大环内酯类、氟喹诺酮类或四环素类）的经验性抗菌药物覆盖率无反应。

我们收集了所有患者的鼻咽抽吸物和血清样本。一些患者有成对的急性和恢复期血清和粪便。对一名患者的肺活检组织样本进行病毒培养、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）以及常规组织病理学检查和电子显微镜检查。我们将鼻咽抽吸物、粪便和血清作为对照，用于对身份被掩盖患者的其他疾病进行微生物调查。

主治医师和临床微生物学家对SARS患者的病历进行了回顾性审查。进行常规血液学、生物化学和微生物检查，包括血液和痰的细菌培养、血清学和病毒学鼻咽抽吸物。通过快速免疫荧光抗原检测甲型和乙型流感、副流感1型、2型和3型、呼吸道合胞病毒和腺病毒来评估鼻咽抽吸物，^三并在Mardin Darby犬肾脏、LLC-Mk2、RDE、Hep-2和MRC-5细胞上培养常规呼吸道病原体。⁴随后，将恒河猴胎肾（FRhK-4）和A-549细胞添加到所用细胞系中。甲型流感RT-PCR⁵直接对临床样本进行人偏肺病毒检测。用于人偏肺病毒的简并引物为：第一轮5′-AARGTSAATGCATCAGC-3′和5′-CAKATTYTG CTTATGCTTC-3′；嵌套引物：5′-ACCCTGT TACAATACCACC-3′和5′-GACTTGAGTCCAA GCTCCA-3′（序列使用国际纯化学联合会的单字母代码）。巢式PCR产物的大小为201 bp。我们使用支原体ELISA筛选细胞培养物（美国印第安纳波利斯罗氏诊断公司）。

结果

50名SARS患者均为华裔。他们代表了五个不同的流行病学相关集群和符合病例定义的散发病例。他们在症状出现后平均5天（SD 2.3）入院。中位年龄为42岁（23–74岁），男女比例为1比1.3。在这些患者中，14名（28%）是医务工作者，5名（10%）曾去过SARS大爆发的医院，13名（26%）是家庭接触者，12名（24%）与SARS患者有社会接触；四名（8%）最近去过中国大陆。

大多数患者的主诉是发烧或气短。一半以上的患者出现咳嗽和肌痛(表1). 少数患者出现上呼吸道症状，如鼻漏（n=12,24%）和咽喉痛（n=10,20%）。还报告了水样腹泻（n=5.10%）和厌食症（n=5.20%）。在最初的检查中，只有19（38%）名患者出现了耳鸣和吸气减少等听诊结果。31名（62%）患者报告有干咳。所有患者在入院时都有合并的放射学证据，包括36个区域中的一个，13个区域中两个，以及一个区域中三个。

尽管高烧，49（98%）名患者没有白细胞增多的证据。在外周血测试中，淋巴细胞减少占68%，白细胞减少占26%，血小板减少占40%，贫血占18%(表2). 丙氨酸转氨酶（45–350 U/L）和肌酐激酶（141–1379 U/L）分别升高34%和26%。

通过培养、抗原检测和PCR对已知病毒和细菌进行常规微生物调查，大多数情况下呈阴性。血培养阳性大肠杆菌一名74岁的男子被送入重症监护室。这一发现归因于医院获得性尿路感染。肺炎克雷伯菌和流感嗜血杆菌从另外两名患者入院时的痰标本中分离出来。

9例患者每24小时口服左氧氟沙星500毫克，另40例患者每12小时静脉或口服克拉霉素500毫克。四名患者每天两次口服奥司他韦75mg。在一名患者中，静脉注射头孢曲松每24小时2克，口服阿奇霉素每24小时500毫克，口服金刚烷胺100毫克，每日两次，用于典型肺炎和非典型肺炎的经验性覆盖。

在撰写本文时，19名患者已发展为严重疾病，伴有氧饱和度降低，需要重症监护和平均6.4天的通气支持。症状出现和恶化之间的平均时间为8.3天。49名患者在症状出现后平均6·7天内静脉注射利巴韦林8 mg/kg每8小时，持续7–10天，并给予类固醇（静脉注射氢化可的松100 mg/6小时，或氢化可替松200 mg/8小时，或甲基强的松龙1–3 mg/kg每24小时，持续2至3个剂量，并在2–3周内逐渐减少）。在重症监护室插管和通气前给予利巴韦林和类固醇的6名患者中，有2名患者在退烧、呼吸支持下降和随后的放射治疗方面表现出一致的反应，而其他4名患者的退烧波动和呼吸支持的静态需求。

与需要重症监护和呼吸机支持的严重复杂疾病相关的危险因素是年龄大、严重淋巴细胞减少、丙氨酸氨基转移酶受损、利巴韦林和类固醇启动延迟(表3). 所有复杂病例在进入重症监护室后均接受利巴韦林和类固醇治疗，而所有非复杂病例在普通病房开始接受利巴韦林和类固醇治疗。不出所料，31例无并发症的患者恢复或好转，而8例有并发症的患者病情恶化，在撰写本文时有1例死亡。在撰写本文时，对所有50名患者进行了平均12天的监测（SD 6.1）。

从两名患者中分离出两株病毒分离物，鉴定为冠状病毒。一份来自53岁的香港华人男性居民的开放式肺活检样本，另一份来自42岁、既往健康状况良好的女性的鼻咽抽吸物。该男子与一名来自中国大陆广州的中国游客有10小时的社会接触史，该游客后来死于SARS。接触后2天，该患者出现发烧、不适、肌痛和头痛。右下区出现皱襞，胸部X线片上有相应的alevolar阴影。血液学检查显示淋巴细胞减少0·7×10⁹/白细胞总数和血小板计数正常。丙氨酸转氨酶（41 U/L）和肌酐磷酸激酶（405 U/L。尽管口服阿奇霉素、金刚烷胺和静脉注射头孢曲松联合用药，但双侧肺浸润增加，氧饱和度逐渐降低。因此，入院9天后进行了开放性肺活检。组织病理学检查显示轻度间质炎症，散在肺泡肺细胞呈巨细胞、颗粒状双亲细胞质，细胞核增大，核仁突出。没有细胞显示疱疹病毒或腺病毒感染的典型包涵体。手术后，他需要通风和重症监护。静脉注射利巴韦林和氢化可的松。他在入院20天后去世。在他的鼻咽分泌物、肺活检样本和尸检肺样本中检测到冠状病毒核糖核酸。他对自己的冠状病毒分离物的抗体滴度显著上升（从1/200到1/1600）。

分离出冠状病毒的女性患者健康状况良好。她最近去广州旅行了两天。她在返回香港5天后出现发烧和腹泻。体检显示右下区有蠕动，胸片上有相应的肺泡阴影。调查显示白细胞减少（2·7×10⁹/五十） ，淋巴细胞减少（0.6×10⁹/五十） 和血小板减少症（104×10⁹/五十） ●●●●。尽管阿莫西林-克拉维酸盐、克拉霉素和奥司他韦在经验性抗菌药物覆盖范围内，但入院5天后病情恶化，需要5天的机械通气和重症监护。她在未经利巴韦林或类固醇治疗的情况下逐渐好转。她的鼻咽抽吸物在RT-PCR上呈冠状病毒阳性，她将滴度从低于1/50的滴度血清转化为1/1600的冠状病毒分离物。

分别从这两名患者的肺活检和鼻咽抽吸物中分离出胎儿恒河猴肾细胞上的病毒。最初观察到的细胞病变效应是接种后2-4天出现圆形的不可折射细胞。细胞病变效应在最初的培养管中没有进展，但在随后的传代中出现，并在24小时内出现。这两个病毒分离物与用于鉴定病毒分离物的常规试剂组没有反应，包括对甲型、乙型流感、1型、2型和3型副流感、腺病毒、，和呼吸道合胞病毒（DAKO，Glostrup，丹麦）。在甲型流感和人偏肺病毒的RT-PCR检测中，或支原体的PCR检测中，它们也没有反应。该病毒对乙醚敏感，表明它是一种包膜病毒。负染（3%磷钨酸钾，pH7.0）超速离心细胞培养提取物的电子显微镜显示存在直径约80–90 nm（范围70–130 nm）的多形包膜病毒颗粒，其表面形态与冠状病毒相容(图1). 感染细胞的薄片电子显微镜显示，病毒颗粒直径为55–90纳米，位于细胞质中光滑的囊泡内(图2，B). 细胞表面也可见病毒颗粒。总体结果与细胞中的冠状病毒感染相一致。

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图1

细胞培养人肺炎相关冠状病毒超速离心沉积的电镜观察

用3%磷钨酸钾（pH 7·0）负染。

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图2

SARS患者肺活检样本的薄层电子显微照片（A）和人类肺炎相关冠状病毒感染细胞的薄层电子显微照片（B）

53岁男性肺活检样本的薄层电子显微照片显示，脱落细胞的细胞质中含有60–90 nm的病毒颗粒。这些病毒颗粒的大小和形态与从两名患者的细胞培养病毒分离物中观察到的病毒颗粒相似(图2，A).

对随机引物RT-PCR分析中产生的RT-PCR产物进行分析，并对病毒感染样品中发现的独特条带进行克隆和测序。在检测的30个克隆中，有一个克隆含有646 bp的未知来源。对该DNA片段的序列分析表明，该序列与冠状病毒科病毒具有弱同源性。然而，从该未知序列中推导出的氨基酸序列（215个氨基酸）与牛冠状病毒和鼠肝炎病毒的RNA聚合酶具有最高同源性（57%），证实该病毒属于冠状病毒科。蛋白质序列的系统发育分析表明，该病毒虽然与第二类冠状病毒关系最密切，但却是一种独特的病毒(图3).

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图3

冠状病毒（SARS）部分蛋白序列（215个氨基酸）的系统发育分析

GenBank登录号AY268070年树木采用相邻接合法建造。水平线距离表示两个序列比较结果不同的站点数量。从500次复制中扣除的引导值。

基于该分离物的646 bp序列，设计了检测新病毒的特异性引物，用于RT-PCR检测临床样本中的人肺炎相关冠状病毒基因组。在50名SARS患者的44份鼻咽标本中，有22份有人肺炎相关冠状病毒RNA的证据。在检测的18份粪便样品中，有10份检测到病毒RNA。通过对选择的阳性RT-PCR扩增产物进行测序，证实了RT-PCR反应的特异性。来自非相关疾病患者的40份鼻咽部和粪便样本在RT-PCR上均无反应。

在最近50份SARS患者的血清样本中，有35份有冠状病毒抗体的证据。在32名有配对急性和恢复期血清的患者中，所有患者都有血清转化或对病毒的抗体滴度增加了四倍以上。此外，还对来自本研究组以外集群的其他5对SARS患者的血清进行了测试，以提供更广泛的社区SARS患者样本，并对所有患者进行了血清转化。来自呼吸系统或其他疾病患者的80份血清和200名献血者的血清均未检测到抗体。

如果一份血清样本中人肺炎相关冠状病毒血清阳性或鼻咽抽吸物或粪便中病毒RNA检测被视为冠状病毒感染的证据，则50名患者中有45名患者有感染的证据。在五名没有冠状病毒感染病毒学证据的患者中，只有一名患者在临床疾病发病14天后检测了血清样本。

讨论

SARS的爆发在很多方面都是不寻常的，尤其是在卫生工作者和家庭接触者中出现了成群肺炎患者。在这一系列患者中，对非典型肺炎常规病原体的调查结果为阴性。然而，从两名SARS患者的肺活检和鼻咽抽吸物中分离出一种属于冠状病毒科的病毒，其他SARS患者对这种病毒有血清学反应。

冠状病毒科包括冠状病毒属和圆环病毒属。它们是被包裹的RNA病毒，在人类和动物中引起疾病。以前已知的229E型和OC43型人类冠状病毒是普通感冒的主要病因。⁶它们偶尔会导致老年人、新生儿或免疫缺陷患者肺炎。7,8据报道，冠状病毒是新兵肺炎的一个重要原因，在一些研究中占30%。⁹人类冠状病毒可以感染神经元，在多发性硬化患者的大脑中检测到病毒RNA。¹⁰另一方面，几种动物冠状病毒（如猪传染性胃肠炎病毒、鼠肝炎病毒和禽传染性支气管炎病毒）在各自宿主中引起呼吸道、胃肠道、神经或肝脏疾病。¹¹

从系统发育角度来看，人肺炎相关冠状病毒与任何已知的人或动物冠状病毒或圆环病毒没有密切关系。我们对聚合酶基因的646 bp片段进行了分析，结果表明该病毒与小鼠肝炎病毒和牛冠状病毒一起属于冠状病毒的第2抗原组。然而，冠状病毒科的病毒可以在病毒家族中进行异源重组，需要对基因组的其他部分进行遗传分析，才能更确切地确定这种新病毒的性质。⁶综合生物学、遗传学和临床数据表明，这种新病毒不是已知的两种人类冠状病毒之一。针对先前识别的人类229E和OC43样冠状病毒的抗体在人类中广泛存在。¹²我们的患者缺乏对新型肺炎相关冠状病毒的血清学反应性，这意味着该病毒与229E或OC43病毒之间几乎没有抗原交叉反应。

大多数临床确诊为SARS的患者都有该病毒感染的血清学或RT-PCR证据。相比之下，在健康对照组中既没有检测到抗体也没有检测到病毒RNA。获得急性和恢复期血清的所有32名患者对人肺炎相关冠状病毒的抗体滴度都有所上升，这进一步证明了最近感染这种病毒是SARS演变的必要因素。此外，来自香港其他医院患者的所有五对急性和恢复期血清检测也显示出病毒血清转化。五名SARS患者没有冠状病毒感染的血清学或病毒学证据。他们需要对以后恢复期的血清进行检测，以确定是否随后发生血清转化。然而，鉴于临床病例定义从来都不完美，人类肺炎相关冠状病毒与SARS临床定义的一致性似乎很显著。

通过RT-PCR或抗体滴度升高，在我们的任何患者中均未检测到人偏肺病毒感染的证据，也未持续检测到其他病原体。因此，这种冠状病毒很可能是SARS的病因或疾病进展的必要先决条件。其他微生物或非微生物辅因子是否在疾病进展中发挥作用还有待研究。

我们描述了SARS的临床表现和并发症。不到25%的冠状病毒肺炎患者有上呼吸道症状。正如在非典型肺炎中所预期的那样，呼吸系统症状和阳性听诊结果与胸部放射学检查结果相比都异常轻微。10%的患者出现胃肠道症状。这些症状是相关的，因为在一些患者的粪便中可以检测到病毒RNA，冠状病毒与动物和人类的腹泻有关。¹³肝功能改变、白细胞减少、严重淋巴细胞减少、血小板减少以及随后演变为成人呼吸窘迫综合征的高发病率表明，这种人类肺炎相关冠状病毒引起了严重的全身炎症损伤。因此，类固醇治疗的免疫调节可能对利巴韦林的经验性抗病毒治疗起着重要的补充作用。与禽流感H5N1亚型相关的严重人类疾病也被认为具有免疫病理成分，H5N1是另一种从动物传给人类的病毒。¹⁴与H5N1疾病一样，严重SARS患者是成年人，患有淋巴细胞减少症，并且有呼吸道以外的多种器官功能障碍。¹⁵从出现症状到呼吸衰竭，存在大约8天的机会窗口。严重复杂病例与潜在疾病和延迟使用利巴韦林和类固醇治疗密切相关。根据我们对第一例患者的临床经验，我们在随后的病例中很早就开始了这种联合治疗，这些病例在入院时通常并不复杂。在撰写本文时，使用这种治疗方案的总死亡率仅为2%。19例复杂病例中有8例仍无明显反应。考虑到不同剂量和开始治疗的时间，不可能对这种联合方案的治疗反应进行详细分析。在确定原因之前，根据经验选择利巴韦林。一旦更好地了解了人类肺炎相关冠状病毒对抗病毒药物的体外敏感性，就可能需要对其进行审查。

另一个与严重疾病相关的因素是通过家庭接触获得疾病。以这种方式感染的人可能比通过社会接触接触的人有更高的病毒暴露剂量或持续时间以及潜在疾病的存在。

我们的临床描述主要与入院的较严重病例有关。我们目前没有关于社区或门诊患者中新出现冠状病毒感染的全部临床谱的数据。我们描述的诊断测试的可用性将有助于解决这些问题。此外，它还可以解决恢复期病毒脱落时间（和传染性）、其他体液和排泄物中存在病毒以及潜伏期病毒脱落的问题。

目前的流行病学数据似乎表明，该病毒是通过飞沫或直接和间接接触传播的，尽管不能排除空气传播。呼吸道感染病毒的发现支持这一论点。初步证据还表明，病毒可能会在粪便中传播。然而，病毒RNA的检测并不能证明该病毒是活的或可传播的。如果在粪便中可以检测到活病毒，这可能是一种额外的传播途径。几种动物冠状病毒通过粪口途径传播。¹¹SARS患者的样本与实验室收到的其他患者的样本不易区分。因此，这些样品的初始处理是在2级生物危害控制下进行的。然而，病毒培养是在生物安全三级控制中进行的。迄今为止，这些遏制措施已被证明是成功的，因为没有任何实验室感染的记录。

我们提供了证据表明冠状病毒家族中的一种病毒是SARS的致病因子。然而，其他病毒仍有可能作为机会性二级侵略者来增加疾病的进展，这一假设需要进一步研究。

致谢

贡献者

利益冲突声明

脚注

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