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神经元。作者手稿；PMC 2021年3月4日提供。
以最终编辑形式发布为：
神经元。2020年3月4日；105（5）：813–821.e6。
在线发布2019年12月30日。 数字对象标识：2016年10月10日/j.neuron.2019.12.003
预防性维修识别码：PMC7060123型
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院1547925
PMID：31899071

亨廷顿舞蹈症的发病机制被改变体内Alfy/Wdfy3和选择性宏自噬

利奥拉·M·福克斯,1,2 Kiryung Kim（基隆·金）,2 克里斯托弗·约翰逊,2 陈沙伟,5 凯瑟琳·克罗斯,三 马修斯·维克多,5 伊芙琳·伊恩杰斯,2 琼·博斯科,2 丽莎·兰道夫,1 约阿尼斯·德拉加西斯,6 乔安娜·M·德拉吉奇,2 安德鲁·尤奥,5和山本爱1,2,4,7,*
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总结

尽管是一种由已知基因编码突变引起的常染色体显性遗传病HTT公司具有类似三核苷酸重复突变的亨廷顿病（HD）患者的发病年龄可能会有几十年的变化。一个可能的促成因素是患者的遗传异质性，这可能会改变他们对疾病的易感性。我们报告称，尽管自噬适配器蛋白Alfy/Wdfy3杂合性缺失对对照小鼠没有影响，但它显著加快了HD发病年龄和进展。成人大脑中的Alfy是自噬依赖性清除蛋白质沉淀物所必需的，而在小鼠和患者成纤维细胞衍生的神经元中，Alfy的耗竭加速了这种病理特征的异常积累，这种病理特征在成人发病的神经退行性疾病中具有共性。这些发现表明，选择性破坏清除聚集蛋白的能力是致病的驱动因素，而选择性清除聚集蛋白可能会增强抗病性。

eTOC Blurb公司

Fox等人在亨廷顿病（HD）小鼠模型和HD患者源性神经元中证明，清除聚集蛋白需要自噬衔接蛋白Alfy/WDFY3，而Alfy的缺失会加速HD的发病。

介绍

蛋白质积累是成人发病的神经退行性疾病的一个致病特征，但蛋白质积累在多大程度上导致了神经退化尚不清楚。在HD中，特征性的细胞内蛋白沉积是可遗传突变的副产品，该突变导致了基因外显子1内多态性CAG重复区的扩增HTT公司基因(HDCRG，1993年). 这种突变以长度依赖的方式导致亨廷顿蛋白（Htt）中的聚谷氨酰胺（polyQ）域扩大，从而导致这种原本可溶的蛋白质聚集。尽管这些沉积物的确切相关性尚不清楚，但突变长度和聚集性之间的相关性与突变长度和发病年龄早期之间的相关性相呼应(MacDonald和Gusella，1996年;佩鲁茨和温德尔，2001年). 此外，鉴于HD小鼠基因抑制的聚集清除与治疗逆转密切相关(Kordasiewicz等人，2012年;Stanek等人，2014年;Yamamoto等人，2000年)进一步探讨这两个观察结果之间的关系将阐明蛋白质积累是否影响发病机制。

基于细胞的系统已经证明，聚集的蛋白质通过大分子自噬被消除(岩手等人，2005a;岩手等人，2005年b;Ravikumar等人，2002年;山本等人，2006年)，并且它们被衔接蛋白识别促进了它们的选择性降解(克林斯基，2007年). 在细胞系中，我们之前已经将大的PI3P结合蛋白自噬连接的FYVE蛋白（Alfy/Wdfy3）描述为通过选择性大自噬降解预先形成的、不溶于洗涤剂的聚集蛋白所需的适配器(Eenjes等人，2016年;Filimonenko等人，2010年). 与Alfy作为选择性接合器的作用一致，Alfy在细胞或哺乳动物大脑中不需要进行饥饿介导的或基础的大自噬(Dragich等人，2016年;Filimonenko等人，2010年). 除了突变的Htt外，Alfy还参与了其他与疾病相关的α-突触核蛋白蛋白聚集体以及中体环等蛋白复合物的周转(Clausen等人，2010年;Hocking等人，2010年;Isakson等人，2013年;Kadir等人，2016年;Park等人，2014年). 然而，选择性巨自噬是否消除成人大脑中的聚集物尚不清楚。

考虑到遗传修饰物对HD发病和进展的影响（亨廷顿病遗传修饰物，2015；Gusella和MacDonald，2009年;Wexler等人，2004年)我们假设，通过改变参与选择性大自噬的基因的剂量，可以揭示蛋白质内含物的病理相关性。因此，我们结合小鼠遗传学、生物化学和细胞生物学来确定聚集是否改变疾病发病机制。在确定成人大脑中需要Alfy介导的选择性自噬来清除积聚的蛋白质后，我们证明，全球消耗Alfy水平对正常成年小鼠没有明显影响，但显著加速了HD小鼠模型中的聚集和症状发生。使用一种新的、由患者衍生的中度HD棘神经元模型，Alfy缺失也足以显著增加内源性突变Htt的聚集，这表明患者中Alfy水平的异质性可能同样影响HD的发病机制。综上所述，我们的研究结果表明，调节蛋白病可以直接影响疾病。

结果

成人大脑中的总清除率需要Alfy

为了确定Alfy在成人大脑聚集清除中的重要性，我们建立了一个遗传模型，在该模型中，Alfy的时间调控缺失会与HD片段模型的条件表达一起发生。为此，我们杂交了一种小鼠模型，该模型允许三苯氧胺（tam）诱导的C介导的Alfy表达消除（Alfy iKO）(图1A–G公司,第1部分–D类)其中新创建的模型表达高清带有103种谷氨酰胺的基因（由CAGCAA交替重复序列编码，外显子1Htt103Q）以四调节方式（HD103Q）(图1H–K（K）,第1版E–我). 我们对7个月大（m/o）小鼠的Alfy诱导缺失的联合分析表明，在Cre诱导7天后，Alfy的丢失达到最大，平均80%(图1F). 与细胞系类似(Filimonenko等人，2010年)在基础条件下，Alfy的丢失对自噬体的生物发生没有明显影响；Alfy KO后12个月，从Alfy iKO大脑中分离出自噬体，AV组分中存在类似水平的p62和线粒体蛋白Tom20。

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成人大脑中聚集的mHtt需要Alfy清除

（A）创建Alfy iKO小鼠的示意图。两轮繁殖产生了iKO小鼠，这些小鼠是条件Alfy等位基因（Alfy飞行/飞行)肌动蛋白杂合CreERTM公司。实验组是通过使用这些iKO小鼠创建的，并交叉回Alfy液氧磷/液氧磷老鼠。然后用veh或+tam治疗后代。另请参见图S1.

（B）车辆PCR基因分型与.+tam Alfy iKO小鼠。在7 m/o剂量下处理的11 m/o iKO小鼠的皮层（ctx）、小脑（cb）和纹状体（str）基因组DNA。通过PCR产物大小的变化检测到外显子5的C介导切除（477对410 bp）。n=3只小鼠/治疗组。

（C） 现场在6 m/o Alfy iKO小鼠中最后注射后1周，使用与Alfy第5外显子互补的探针进行杂交。n=3只小鼠/治疗组。

（D-F）11 m/o Alfy iKO小鼠的洗涤剂可溶性脑裂解物的Western blot分析（D）不同的大脑区域或（E）小鼠全脑裂解物，定量（F）n=3只小鼠/治疗组。

（G）自吞噬体富集的组织分馏显示，在Alfy诱导缺失后的1年内，基础大自噬没有显著变化。显示大脑和肝脏的分馏。针对Alfy、p62、Tom20和LC3检测代表核后上清液（PNS）、细胞液（cytosol）和自噬空泡（AV）的组分。请注意，尽管阿尔菲（Alfy）去世，但p62缺乏积累。n=6-7只小鼠/基因型。

（H）创造HDAlfy小鼠的遗传杂交和治疗方案的简略示意图。Alfy iKO和HD103Q小鼠相互杂交，引入六种必要的基因修饰，以创造繁殖者，最终形成HDAlfy小鼠。用+tam治疗HDAlfy小鼠，以修改Alfy水平和dox，以调节外显子1Htt103Q转基因的表达。另请参见图S1.

（一）HDAlfy小鼠的治疗方案。7m/o小鼠注射tam，然后用dox或对照溶液治疗4个月，即最后一次注射后1周。在指定的时间点收集小鼠进行分析。

（J、K）骨料清理需要Alfy。（J）治疗前和治疗后4个月HDAlfy纹状体EM48染色。将Dox治疗小鼠与缺乏Alfy（+tam+Dox）的HD基因抑制小鼠进行比较。（K）使用或不使用Alfy在dox后2和4个月对EM48阳性Htt矿床进行体视学评估。数据显示为7m/o HDAlfy小鼠（未经治疗）的百分比。方差分析显示Alfy（F(1,20)=7.032，p=0.0153），Alfy和dox治疗时间（F(1,2)=4.001，p=0.0346）（n=4-5只小鼠/基因型/年龄）。尽管在2个月和4个月的dox治疗后，总负荷显著降低（2个月：F(1,6)=8.632，p=0.0260；4个月：F(1,8)=6.347，p=0.0358），删除Alfy阻碍了这一许可。

为了确定Alfy iKO对成人大脑mHtt沉积物选择性清除的影响，在有或无Alfy的情况下监测HDAlfy小鼠的总清除率(图1I). 集合负荷的立体定量显示，尽管在消除外显子1Htt103Q表达后，在Alfy+小鼠中观察到mHtt沉积的时间依赖性降低(图1J,​，K），K（K）)，即使在外显子1Htt103Q抑制4个月后，在缺乏Alfy的小鼠中，这种下降也显著受阻(图1J,​，K）。K（K）). 综上所述，这些数据表明，尽管Alfy的存在对发生大自噬并不必要，但神经元需要有效消除成年大脑中聚集的蛋白质。

Alfy杂合缺失加速HD小鼠模型的聚集和行为功能障碍

HD小鼠模型的大基因设计导致突变体Htt在侧纹状体中的表达模式意外受限，从而导致旋转体等运动任务没有进行性下降(图S1H)正如之前预测的那样(Gu等人，2005年). 因此，为了确定聚集是否影响HD小鼠模型的发病年龄，我们交叉了BACHD小鼠模型(格雷等人，2008年)它表达了人类的全长HTT公司编码Alfy基因的小鼠杂合97个重复的基因组序列Wdfy3公司（AlfyHet），创建BACHDAlfy小鼠(图2A). 阿尔菲水平降低50%(图2B)与BACHD小鼠相比，其足以显著加速皮层和纹状体中S830或EM48阳性突变Htt（mHtt）内含物的出现(图2C–电子). 抗-EM48染色显示早在9 m/o BACHDAfy皮层和纹状体中就出现了细胞质和核周点状物以及弥漫性细胞质染色，而12 m/o BACHAD中只出现了稀疏的EM48阳性点状物和少量细胞质积聚(图2C和​和D）。D类). 与这些年龄段的BACHD小鼠相比，S830免疫反应显示的BACHDAlfy大脑中聚集负荷的体视学定量同样更高(图2E). 此外，裂解物对毒性mHtt表位3B5H10的生物化学分级和免疫印迹(Miller等人，2011年)和1C2(Trottier等人，1995年)发现Alfy消耗减缓了洗涤剂不溶性mHtt的消除，但对洗涤剂可溶性mHtt水平没有影响(图S2A和B类)，与Alfy作为聚集蛋白的衔接蛋白的作用一致。总的来说，耗尽BACHD中的Alfy会加速不溶于洗涤剂的聚集mHtt的积累，进一步支持成人大脑中选择性自噬的聚集清除需要Alfy。

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Alfy杂合缺失加速HD小鼠模型中聚集物的积累

（A）创建BACHDAlfy小鼠和实验同窝小鼠，野生型（WT），AlfyHet和BACHD。

（B） BACHD的代表性免疫印迹（B）和BACHDAlfy（BA）小鼠探测Htt（3B5H10）和Alfy。阿尔菲水平由右侧vinculin（vinc）校正。

（C-F）耗尽Alfy会加速BACHD小鼠mHtt的积累。（C、D）针对12 m/o中EM48表位的免疫组织化学（C）皮质和（D）纹状体。黑色箭头表示细胞质和核周点状结构；白色箭头表示弥漫的细胞质或神经炎染色。比例尺=10 m。（E、F）皮层和纹状体中S830-阳性mHtt点状突起。（E）12米/盎司小鼠皮层中的S830-阳性结构。纹状体也有类似的结构（未显示）。（F）总负荷的体视量化。方差分析显示，与BACHD相比，BACHDAlfy大脑中的聚集物显著增加（皮层：F(1,11)=15.920，p=0.0021；纹状体：F(1,11)=9.058，p=0.0119），年龄无显著影响（皮层：F(1,11)=0.242，p=0.6324；纹状体：F(1,11)=0.520，p=0.4857）。数据显示为平均值±标准偏差。与聚集蛋白质不同，洗涤剂可溶性蛋白质不受影响（参见图S2).

为了确定总周转是否影响表型发作，我们进行了两种行为范式(图3). 重复加速旋转木马范式表明，尽管AlfyHet小鼠与WT同窝小鼠无法区分，但BACHDAlfy的发病速度更快，表现也明显不如BACHD小鼠(图3A). 这些数据表明，将Alfy水平降低50%会增加小鼠在疾病情况下的脆弱性，但不会影响正常功能。旷野迷宫中的习惯性运动活动显示出类似的结果(图3B)：如前所述，BACHD雄性小鼠在12 m/o时出现运动减退(Wang等人，2014年)，而BACHDAlfy小鼠在9m/o时发病。与旋转棒行为不同，低运动反应没有逐渐下降，这可能是由于习惯动物的地板效应。这在女性BACHD和BACHDAlfy队列中尤其明显，显示出运动减弱，但随着时间的推移没有变化。鉴于突变型Htt的下丘脑蓄积先前被暗示会影响BACHD小鼠的体重(Hult等人，2011年)，我们还监测了阿尔菲消耗后的体重和食物消耗量，以确定运动差异是否与体重无关(图S3A和B类)：虽然BACHD比对照组小鼠重，但阿尔菲的消耗对体重没有明显影响。此外，所有受试基因型在一个24小时内摄入的食物量相似。因此，加速聚集的Alfy水平降低显著加速BACHD小鼠运动功能障碍的发生。

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加速聚集与HD症状加速发作相关

（A）从加速转盘上掉落的延迟。数据显示为平均值±标准差。在男性和女性中，RM-ANOVA显示了基因型的显著总体影响（男性：F(3,188)=88.171，p<0.0001；雌性：F(3,171)=80.182，p<0.0001）和年龄（男性：F(3,188)=6.768，p=0.0002；雌性：F(3,171)=4.283，p=0.0061）。只有女性的基因型与年龄之间存在交互作用（F(3,171)=3.017，p=0.0023）。Fisher PLSD显示，与BACHD相比，BACHDAlfy在所有年龄段的男性（3 m/o，p=0.0446；4 m/o，p=0.0097；5 m/o，p=0.0033；8 m/o，p=0.0119）和女性（4 m/o、p=0.0538；4 m/o，p=0.0006；5 m/o，p=0.0008；8 m/o，p=0.2809）表现明显较差。WT和AlfyHet小鼠之间没有发现显著差异（雄性：3 m/o，p=0.8627；4 m/o，p=0.8629；5 m/o，p=0.9630；8 m/o，p=0.7559；雌性：3 m/o，p=0.9556；4 m/o，p=0.7554；5 m/o，p=0.4554；8 m/o，p=0.6852）。

（B）在露天竞技场上行驶的距离。数据显示为平均值±SD。方差分析显示，9 m/o时，男性和女性的基因型总体影响显著（男性：F(3,37)=3.660，p=0.0209；女性：F(3,43)=3.953，p=0.0141）和12 m/o（雄性：F(3,39)=9.025，p=0.0001；女性：F(3,34)=6.724，p=0.0011）。Fisher’s PLSD证实，BACHD小鼠在12 m/o时出现运动障碍（9 m/o，p=0.1930；12 m/o p=0.0141），而BACHDAlfy在9 m/o时则出现运动障碍。相反，BACHD（9 m/o，p=0.0064；12 m/o p=0.0025）和BACHDAlfy雌性（9 m/o，p=0.0088；12 m/o p=0.0034）在这些年龄段都是低运动能力，彼此之间没有差异（9 m/o，p=0.7780；12 m/o p=0.9202）。WT和AlfyHet也无法区分（雄性：9 m/o，p=0.7136；12 m/o，p=0.5596；雌性：9 m/o，p=0.3830；12 m/o，p=0.8289）。

（C）GFAP染色显示BACHDAlfy与BACHD相比具有广泛的反应性。比例尺=10μm，插入=25μm。图像代表n=3-4只小鼠/基因型。另请参见图S3.

背纹状体等区域的反应性星形细胞增多是HD患者大脑中观察到的一种神经病理表型，表明存在神经元应激(Vonsatel和DiFiglia，1998年). 9和16 m/o小鼠纹状体的GFAP染色(图3C和S3C系列)发现GFAP+反应性星形胶质细胞广泛染色，延伸至BACHDAlfy小鼠的纹状体。这与AlfyHet和BACHD小鼠相反，我们偶尔观察到GFAP反应性的孤立实例，但没有观察到与星形细胞增生相关的典型形态。尽管星形细胞增多，但根据体视学评估，Alfy的丢失并没有加速细胞丢失或组织体积(图S3D). 鉴于需要Alfy缺失来驱动BACHD小鼠纹状体中这些结构的出现，这表明无法有效清除聚集物允许内含物驱动影响体内平衡的二次事件。综上所述，这些数据表明Alfy可以通过影响蛋白质聚集来改变HD发病机制，蛋白质聚集会影响神经元应激和功能，但不会明显影响神经元死亡。

阿尔菲耗竭加速HD患者源性神经元模型中的聚集

接下来，我们试图确定改变Alfy水平是否会影响细胞事件，而细胞事件与成人HD可能发生的情况更为相似。最近，一个HD患者成纤维细胞模型通过直接神经元转换生成中棘神经元（MSN）(Huh等人，2016年;Mertens等人，2015年)在缺乏患者群体中罕见的极端polyQ扩增的情况下，显示了内源性mHtt的聚集表型(Victor等人，2018年). 重要的是，很像病人的大脑(Gutekunst等人，1999年;Vonsatel，2008年)，不到20%的神经元主要表现为Htt携带CAG长度的神经膜聚集，这是成人发病的典型特征。利用这个模型系统，我们接下来确定阿尔菲损耗是否增加了聚集。按照先前制定的方案，将polyQ长度为40、46或47个重复的患者成纤维细胞转化为MSN(图4A,​，BB类)(Victor等人，2018年)然后用Alfy shRNA序列处理，使Alfy水平降低到约60%(图S4A). 与对照MSN相反(图S4B)，shALFY导致患者衍生MSN的聚集显著增加(图4C–F类)表明Alfy也可以在不影响自噬整体的情况下修改该模型中的聚集(图S4C,D类). 值得注意的是，尽管聚集性增加，Alfy耗竭不足以增加细胞死亡，尽管在所选时间点在HD细胞系中整体上观察到很少的细胞死亡(图S4E). 这些数据表明，聚集增加会引起电路功能障碍，但mHtt的细胞自主毒性与聚集无关。

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ALFY缺失增加直接从HD患者成纤维细胞重新编程的人类神经元内源性mHtt聚集

（A）使用富含脑的microRNAs miR-9/9*−124，结合富含纹状体的因子，描绘了分离出的人类成纤维细胞转化为类似中等棘神经元（MSN）的细胞的示意图。重放后给予抗Alfy的shRNA（shALFY）或对照序列（shCTRL）。

（B）诱导后第19天（PID）转化成纤维细胞的代表性图像，TUBB3免疫染色（绿色）和DAPI核染色（蓝色）。

（C-F）mHtt内含物阳性MSN的百分比。用（C）shCTRL或（D）shALFY处理的HD-MSN在PID 19处用MW8抗体进行免疫染色。（E）与未受影响的患者成纤维细胞相比，mHtt包涵体阳性MSN的量化。数据显示为平均值±sem，带有单个数据点。方差分析显示shALFY（F(5,12)=19.88，P<0.0001）。后hocTukey的测试比较结果表明。N=400个细胞/基因型/shRNA的平均值。（F）不同患者成纤维细胞系中mHtt包涵体阳性MSN百分比的量化。在每个成纤维细胞系中进行配对t检验。n=219-450个细胞/细胞系/shRNA.***，p<0.001；**，p<0.01；*，p<0.05；n.s.=不重要。另请参见图S4.

讨论

从患者源性神经元到小鼠，我们证明，Alfy是选择性自噬的接合器，是清除成人大脑中聚集蛋白所必需的，降低其水平可以加速疾病发病。值得注意的是，使用HD103Q和BACHD模型，它们在表达策略、聚集特征和行为表型上存在差异，我们表明需要Alfy体内并证明了对Alfy介导的聚集清除的特殊需要，以抵抗神经退行性和行为症状。

越来越清楚的是，蛋白质聚集和周转的研究是一项复杂的研究，从酵母到哺乳动物细胞，所有聚集物都被认为是不平等的。例如，在基于HeLa细胞的模型中，我们发现尽管Alfy促进了预成型夹杂物的周转，但仍有一组夹杂物比其他夹杂物更容易降解(Eenjes等人，2016年). 这些发现与Frydman及其同事提出的模型相呼应，其中错误折叠蛋白质有两个不同的隔间，一个是可溶池（JUNQ），另一个是不溶池（IPOD），后者以自噬降解为目标(Kaganovich等人，2008年). 我们的生化研究表明，与我们最初基于细胞的研究结果一致(Eenjes等人，2016年;Filimonenko等人，2010年)，Alfy在成人大脑中介导的周转优先影响洗涤剂不溶池(图S2). 尽管在有丝分裂后和高度分隔的成年神经元中是否存在类似的蛋白质隔离仍不清楚，但这些数据表明可能确实存在类似IPOD的池。

我们的结果强烈表明，影响蛋白质聚集的基因修饰可以改变HD的发病年龄，加速运动功能障碍的出现。加速聚集对两种BACHD小鼠的细胞毒性没有直接影响(图S3)和高清MSN模型(图4)相反，它通过影响神经回路从而加速行为功能障碍而产生有害影响(图3). 这表明疾病毒性受两个因素的影响，非聚集mHtt驱动疾病特异性发病机制，聚集mHtt-改变这种毒性(图S4E). 鉴于在体外有证据表明，聚集和积累的速率与polyQ长度直接相关，我们的工作表明，正是聚集的速率导致了发病年龄的提前，通常与较长的polyQ长度有关。因此，如果可以减缓积累，我们的数据表明发病年龄可能会显著推迟，生活质量也会得到保持。重要的是，Alfy对mHtt的自噬消除没有特异性，但通常对聚集状态或大型蛋白质复合体的蛋白质，包括其他与疾病相关的沉积，如α-同核蛋白。未来的研究将确定这些观察结果在许多蛋白病中的广泛应用，这将使我们能够更好地了解蛋白聚集如何导致疾病，以及蛋白病的出现是否确实是发病机制的统一特征。

STAR方法文本

铅接触和材料可用性

有关资源和试剂的更多信息和请求，请直接联系首席联系人山本爱（Ai Yamamoto），并由其完成(ude.aibmuloc@otamamay.ia). 本研究中产生的所有独特试剂可从铅接触公司获得，并附有完整的材料转移协议。

实验模型和受试者详细信息

体内动物研究

所有实验均由哥伦比亚大学医学中心动物护理和使用委员会（IACUC）审查和批准。实验小鼠被培育并安置在威廉·布莱克医学研究大楼的设施中。每个笼子最多有五只小鼠在温度可控的环境中保持性别隔离，光/暗周期为12小时，可获得食物和水随意在繁殖和饲养前实验中，将小鼠保持在一个循环中，在早上6点到下午6点之间打开灯。将小鼠随机分配到实验组，并通过使用AVID芯片或耳塞进行基因型盲法实验。进行实验的各个年龄如下所示。

小鼠菌株

BACHD来自加州大学洛杉矶分校的William Yang(格雷等人，2008年). 它们通过与野生型FVB/J菌株杂交来维持。Alfy基因陷阱小鼠的建立和条件Wdfy3公司等位基因如前所述(Dragich等人，2016年)和保持在CBAXC57Bl6 F1背景上。Actin-CreER™小鼠(Hayashi和McMahon，2002年)从杰克逊实验室（缅因州巴尔港）获得。通过每隔3-4个月与野生型C57BL/6小鼠杂交，将Actin-CreER™小鼠保持为C57BL/6背景的杂合子。CamKIIa-tTA+/-小鼠来自Jackson实验室，最初描述为Mayford等人（1996年）它们保持为C57BL/6背景下的杂合子。

阿尔菲·伊科（Alfy flox/flox:：Actin-CreER™）创建如下：小鼠纯合子重量3等位基因（阿尔菲飞行/飞行)露出Actin-CreER™。产生的Cre+阿尔菲飞行/+F1后代重新交配给原阿尔菲飞行/飞行以保持张力。

HD103Q小鼠（CamKIIa-tTA:：tetO exon1Htt103Q）的创建如下：NheI/EcoRV包含聚谷氨酰胺扩增（103Q）外显子I片段的插入物HTT公司使用交替的CAGCAA序列(Kazantsev等人，1999年)被亚克隆到双向子序列运算符序列(Baron等人，1995年)（Herman Bujard博士的pBi5）。采用定点突变法在基因外显子I的下游引入一个终止密码子HTT公司（快速突变，Promega）。Sanger DNA测序证实插入物成功突变。哥伦比亚大学医学中心转基因小鼠共享资源中心使用50μg pBi2-HTT103Q进行了前核注射，使用AseI公司; 转基因小鼠是在CBAXC57Bl6 F1背景下产生的。为了维持菌落，将tetO-exon1Htt103Q培育成纯合性，没有观察到毒性。HD103Q型通过异交tetO-exon1Htt103Q创建小鼠+/+带CamKIIa-tTA+/−。将产生的F1后代用于后续实验。

HDAlfy小鼠的创建如下：为了创建具有Alfy iKO潜力的可调节HD小鼠，需要几代回交才能将Alfy飞行/飞行和tetO-exon1Htt103Q+/+CamKIIa-tTA和Actin-CreER™同时杂合表达的纯合性。每个后续杂交产生的后代被用于最终将5个不同的转基因整合到同一小鼠系上。在实验小鼠中图1和S1（第一阶段）Alfy基因敲除和外显子1Htt103Q的表达分别由他莫昔芬和dox控制。

BACHDAlfy小鼠的产生如下：将BACHD小鼠与Alfy杂交燃气轮机/+老鼠。所有4个F1后代均按正文所述使用。

细胞系

患者成纤维细胞取自Coriell。如前所述，对其CAG长度进行了验证和维护(Victor等人，2018). 主图中提供了每个患者行的描述。

方法详细信息

基因分型

在Eppendorf AG 22331 Hamburg Mastercycle中使用5 PRIME Hot Mastermix（5-PRIME）从耳塞活检中提取50–200 ng DNA苯酚：氯仿，进行PCR检测感兴趣的基因。BACHD公司(格雷等人，2008年)和Alfy GT小鼠(Dragich等人，2016年)如前所述进行基因分型。使用第一个loxP位点（P1）的正向引物和第二个loxP位点（P2）的反向引物进行Alfy切除PCR。引物如下：Alfy lox P1正向GAA ACG AAG CTC GTT TAC GG，反向TGC AGT GAC ATT TCC TCT GG; Alfy lox P2前进ACT TGG GAA GAG GGA AGC TC公司，反向AGG TTA CCA GCC ACA ACC AG公司; 肌动蛋白CreERTM公司向前地GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC公司，反向GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT; Actin Cre的内部控制ERTM公司向前地CTA GGC CAC AGA ATT GAA AGA TCT公司，反向GTA GGT GGA AAT TCT AGC ATC C; tetO-exon1Htt103Q转发TCC TCT GAC ACA TAA TTC GCC合同通用条款，反向GTT GTT CCA TTC CAT CAC GG; CamKIIa tTA前进GTG ATT AAC AGC GCA TTA GAG C公司，反向GAA GGC TGG CTC TGC ACC TTG GTG; 和转基因（Terd）前向DNA装载控制CAA ATG TTG CTT GTC TGG TG，反向GTC AGT CGA GTG CAC AGT TT公司.

药物的制备和给药：

在玉米油中含有5%乙醇的溶液中，通过37°C加热4 h并频繁旋转，以10 mg/mL的速度制备三苯氧胺（Sigma）。通过从溶液中省略三苯氧胺来制备溶媒对照品。Tam或溶媒对照组连续五天每天腹腔注射2 mg/26 g BW（或200μL溶液/26 g BW）。在5%蔗糖溶液中以2 mg/mL的速度在红色水瓶中制备多西环素（Sigma），以防感光。非脱氧环素处理的对照小鼠接受含5%蔗糖的对照水。在添加强力霉素之前，对蔗糖水进行高压灭菌和冷却，每周更换1-2次。小鼠从7个月大开始接受dox治疗，持续时间从2周到4个月不等，如文中所示。

行为测试

所有动物在治疗前都是药物幼稚的。小鼠被饲养在群体住房中，因此通过笼子进行实验。在断奶时，将一小部分性别相同的婴儿随机分配给实验组。在行为测试开始前两周，实验队列被转移到一个反循环核心设施，上午10点到晚上10点关灯，以便在黑暗（活动）时间进行纵向实验。为了对加速旋转棒进行测试，小鼠首先在初始暴露日用带把手的旋转棒装置（意大利瓦雷斯乌戈巴西莱）进行训练，其中一个试验以5 rpm的恒定速度进行5 min，第二个试验以超过5 min的速度从5 rpm加速到15 rpm，第三个试验以从5 rpm到25 rpm的速度加速。训练天数取决于菌株，该菌株是通过在该训练方案的多天内只运行对照动物来确定的，以便2个月大的小鼠能够成功完成任务。3（BACHD）或4（HD103Q）天的测试，每天进行3次测试，每次5分钟，速度从5加速到40 rpm，每次测试持续300秒。试验之间的休息时间通常为35-60分钟。允许小鼠从旋转木马上跌落1次，在第二次跌落时，以秒为单位记录潜伏期。对于露天场地，BACHD和室友对照组每隔两个月在露天场地（43.2 cm×43.2 cm x 30.5 cm）暴露一小时。使用Med Associates的设备和软件记录旅行距离。

洗涤剂可溶和不可溶部分的组织制备

为了制备组织裂解物，用一氧化碳对小鼠实施安乐死2并斩首。取下大脑，放入冰镇的0.1 M Sorensen磷酸盐缓冲液中，pH 7.4（1X PB）。样品在干冰粉上进行闪速冷冻，并在−80°C下储存，直至处理。值得注意的是，大脑在冷冻前被解剖。将冰冻组织（50–500 mg）置于玻璃浆液均质器中，其中含有等量的1X磷酸盐缓冲液（PBS），其中含有2X Halt蛋白酶抑制剂混合物（ThermoFisher），并用40泵杵进行分解。将悬浮液转移到试管中，添加等量的洗涤剂（PBS中的2%TritonX-100[Tx-100]），使最终洗涤剂浓度达到PBS（PBS-Tx）中的1%Tx-100，并在冰上培养30分钟，然后在Eppendorf 5417R离心机中以1000 rpm旋转5分钟。为了分离Tx-100可溶部分和不可溶部分，上清液（S1）以14000 rpm离心5分钟。由此产生的上清液（S2）代表洗涤剂可溶部分，而颗粒（P2）则代表洗涤剂不可溶部分。P2悬浮在8 M尿素中的1 PBS-Tx中，并在冰上培养15分钟。然后以14000 rpm的转速离心5分钟，如果检测到小的粘性颗粒（核酸），则小心地将颗粒去除，留下溶解的上清液（S3）。根据制造商的说明，使用BioRad DC蛋白质试剂盒对相关悬浮液的蛋白质浓度进行量化。检测洗涤剂可溶和不可溶部分的1C2、3B5H10、亨廷顿蛋白（C项）γ-微管蛋白和长春花蛋白。还探测了S1中的Nbr1、Optineurin、Atg5、vinculin和Alfy

自噬液泡的分离

如前所述，用10 g脑组织进行细胞分离(Filimonenko等人，2010年;Stromhaug和Seglen，1993年). 简单地说，用0.5 mM GPN孵育脑匀浆（以打破溶酶体），然后在4°C下以2000 x g的速度旋转2分钟，使细胞核形成颗粒。使用Nycodenz（Sigma）的阶梯梯度对核后上清液进行分级，然后使用Nycotenz和Percoll（Sigma-）进行分级，并在4°C下分别以141000和72000 x g的速度旋转。用30%Optiprep（Sigma），71000 x g，4°C，30 min，从富含AV的组分中除去Percoll。在每个步骤中收集组分，由Bradford（Biorad）定量，并在Western blots上运行。在Blots中检测LC3B、p62、Alfy和Tom20。

蛋白质印迹（SDS-PAGE）

将5–20μg蛋白质加载到NuPAGE 4–12%双三凝胶（ThermoFisher）或3–12%三醋酸盐凝胶（ThermalFisher，用于Alfy和mHtt）上，并转移到PVDF或PVDF体外膜（ThermoSfisher）上。在室温下将膜在3%BSA中封闭1小时，并在一级抗体中培养过夜。一级抗体稀释液中含有0.01%吐温（PBS）和3%牛血清白蛋白（BSA）。用辣根过氧化物酶结合二级抗体（ThermoFisher-Pierce）在1:2000至1:5000的温度下将斑点培养1-2小时，以检测大多数抗体（抗阿尔菲抗体为1:1000）(Lystad等人，2014年))在含有3%BSA的0.01%1X PBS-Tween中，使用Clarity Western ECL基板（BioRad）进行开发，并使用BioRad-VersaDoc成像系统进行检测。使用QuantityOne软件（Biorad）或ImageJ分析条带强度，并将其标准化为负载对照。

原位杂交：

用异氟醚对小鼠进行深度麻醉并斩首。取下大脑并将其切成两半，然后在−20°C异丙烷中冷冻，并将其嵌入Tissue-Tek（Torrance，CA）最佳切割温度（OCT）嵌入干冰培养基中。使用徕卡CM 1950低温恒温器切割20μm切片，并每隔200μm将其解冻到未经处理的Fisher Superfrost plus载玻片上。在需要之前，将载玻片储存在−80°C的温度下。在进行探测之前，将切片在室温下干燥30分钟，并转移到1X PBS中的4%多聚甲醛（PFA）中。在1X PBS中清洗一次载玻片5分钟，然后在70%乙醇中脱水5分钟，并在4°C的100%乙醇中储存，直到使用。为了创建杂交探针，设计了一个45碱基的寡核苷酸探针来补充Wdfy3公司mRNA（GenBank登录号。NM_172882). 用α放射性标记150 ng的寡核苷酸-[32P] -根据制造商的说明，使用Roche末端转移酶3′末端标记试剂盒进行dATP。使用酚氯异戊醇提取标记探针，并通过illustra Microspin-G25柱离心去除未合并的放射性核苷酸（伊利诺伊州芝加哥GE Healthcare）。用液体闪烁计数器测量放射性。探针在含有50%甲酰胺、4X SSC和10%硫酸右旋糖酐的最小杂交缓冲液中稀释。在使用探针之前，将切片风干15分钟。在42°C的加湿室中进行一夜杂交。首先在60°C下清洗载玻片30分钟，然后在室温下使用1X SSC和0.1X SSC清洗5分钟。将载玻片在70%和95%乙醇中短暂脱水，风干，并暴露于薄膜中2周。

免疫组织化学

用异氟醚对小鼠进行深度麻醉（通过多次脚趾捏证实），并用0.9%生理盐水经心灌注2分钟，然后用4%多聚甲醛（PFA）灌注3分钟。将大脑取出并在4%PFA中固定4小时，然后在1X PB中的30%蔗糖中孵育48–72小时。将大脑在干冰粉中进行snap冷冻，然后在OCT包埋介质中进行冷冻保护，并在−80°C下保存。使用Leica CM 1950低温恒温器在30μm处对组织进行切片，并在4°C下储存在含有0.02%叠氮化钠作为防腐剂的磷酸盐缓冲液中。整个前脑的代表性切片，间隔240μm，用抗亨廷顿蛋白和GFAP的抗体染色。简单地说，在含有0.02%Triton-X100的PBS中清洗切片，然后在80°C下pH 9.0的柠檬酸钠中提取抗原30分钟。再洗三次后，内源性过氧化物酶被1%的过氧化氢阻断，再次洗三次。切片在0.4%Triton-X中封闭1小时（对于EM48染色，封闭液也含有3%的BSA和2%的NGS），然后在初级抗体中培养过夜，最多培养3天。切片在室温下在生物素化的第二抗体中孵育1小时或过夜，并使用Vectastain ABC试剂盒（Vector labs）扩增信号。仅用于S830染色(Sathasivam等人，2010年)之后进行额外的10分钟酪胺扩增步骤（Perkin Elmer），然后进行冲洗和第二次ABC治疗。在含有0.00001%H的磷酸盐缓冲液中使用二氨基联苯胺（DAB）（10 mg/25 mL）检测信号2O（运行）2。在DAB反应后，将切片安装在玻璃载玻片上并进行空气干燥，用硫宁复染，用升序的乙醇脱水，用二甲苯清除，然后用Permount安装介质覆盖玻片（Fisher）。

体视学

连续切割的冠状脑切片（每240μm）用于所有体积、神经元和亨廷顿蛋白聚集分析。在切片过程中，通过指定“集合1”作为包含前连合初始交叉部分的代表集合，跨大脑进行组织匹配。对于每个免疫染色，随机选择一个介于1和8之间的数字，并使用该设定数字对所有大脑中的表位进行染色。为了评估Htt表位EM48的HD103Q纹状体积累，右半球的分析从胼胝体膝的前端开始（耳间4.98 mm/bregma 1.18 mm，Franklin和Paxinos 2001），并延伸至CA3的前部出现（耳间2.86 mm/brega−0.94 mm，Fracklin和Baxinos 2000）这些头枕边界导致每个大脑有8-10个切片，间隔240微米。新纹状体被定义为位于头枕面内，背侧以胼胝体为界，背外侧以外囊为界，内侧以侧脑室为界。在腹外侧，新纹状体通过前连合和/或内囊，继续在腹外侧以弧为界，由claustrum、背侧内虹膜核、外侧纹状体条、外侧伏隔壳层（或在腹侧，前连合后肢的间质核）、，以及侧脑室的腹尖。为了评估Htt表位S830的BACHD皮质堆积，纹状体的解剖界限与上述相同，并对左背外侧皮质进行了额外分析。所分析的皮层区域的范围在胼胝体背侧，呈腹外侧弧形延伸至次级体感皮层，以从外囊外侧边缘到组织边缘的水平追踪为界。使用立体研究软件（MBF Bioscience）从纹状体或皮层获得无偏体视学计数。光学解剖器法用于无偏见随机选择大脑皮层或纹状体一定体积的连续切片中的剖面（神经元或Htt-阳性聚集物）计数。根据初步研究，选择的计数参数包括300×300网格、50×50计数框和30μm固定组织厚度。在所有小鼠中，所有小鼠尼塞尔阳性神经元计数的冈德森误差系数（CE）平均为0.02。

直接转换

多西环素反应合成簇miR-9/9*和miR-124的慢病毒制剂(Yoo等人，2011年)以及EF1α启动子下游克隆的转录因子被用于转导这些细胞，如先前报道的那样，以产生类似于人类中棘神经元的细胞(Richner等人，2015年;Victor等人，2014年;Victor等人，2018年). 感染的人成纤维细胞在15%FBS DMEM培养基中用多西环素维持5天，然后重新涂布在涂层盖玻片上。然后在补充有丙戊酸（1 mM）、二丁酰cAMP（200μM）、BDNF（10 ng/mL）、NT-3（10 ng/mL）、RA（1μM）和RevitaCell（100x）的神经介质（ScienceCell）或Neurobasic−B27plus（Invitrogen）中用适当的抗生素选择细胞。每两天补充一次多西环素，每4天更换一次培养基。ALFY的敲除是通过在microRNA-介导的重编程起始点将shRNAs转导到人类成纤维细胞中实现的。简言之，将设计用于人类ALFY或非特异性靶点（对照shRNA）的单链寡核苷酸退火成发夹并连接到PLKO.1 puro shRNA载体中((Stewart等人，2003年)Addgene载体#8453），该载体在内部进行了修饰，以携带抗囊虫素而非嘌呤霉素，从而不会干扰携带miR-9/9*和miR-124合成簇的载体。在重新编程的第19天，通过免疫荧光分析细胞。用4%多聚甲醛在室温（RT）下固定细胞20分钟，然后用0.2%Triton X-100渗透10分钟。用1%的山羊血清进行封闭，然后在4°C下培养一级抗体过夜。将与Alexa-488或−594结合的二级抗体应用于RT 1小时。使用Leica SP5X白光激光共焦系统和Leica Application Suite（LAS）Advanced Fluorescence 2.7.3.9723拍摄图像。通过对DAPI信号上携带内含物（MW8或MAB5492阳性）的细胞数量进行计数，对直接转化的神经元进行染色定量。LC3B用ImageJ颗粒分析仪工具定量，并在总DAPI阳性计数上取平均值。抗体通过成纤维细胞染色作为阴性对照进行验证，显示出低背景。

量化和统计分析

所有图像均使用Adobe Photoshop CS5和Adobe Illustrator CS5制作。使用Statview（科学计算）、Matlab或R对行为数据、体视学获得的计数和体积（使用MicroBrightfield StereoInvestigator获得）、punta（ImageJ）和Western blot带强度（使用ImageJ获得）进行统计分析。使用GPower3.1、，其方差是在试点研究或之前公布的数据中确定的。适当的图例中提供了统计方法和完整的统计信息。在95%的概率水平上接受显著性。如图所示，行为数据表示为平均+/-SEM或SD。n值在各自的图形图例中定义，但简要如下：图1，n代表小鼠数量；图2，n表示大脑的数量；图3，n代表小鼠数量；和图4，n表示单元数。

数据和代码可用性

这项研究没有生成任何独特的数据集或代码

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集锦

清除突变体亨廷顿蛋白需要自噬衔接蛋白Alfy/WDFY3体内.（84 c）

阿尔菲缺乏加速HD小鼠的聚集、神经元应激和发病。（85摄氏度）

减少Alfy会增加患者衍生MSN的聚集，但不会增加细胞死亡。（83美分）

影响蛋白质聚集的基因修饰可能改变疾病发病年龄。（84摄氏度）

补充材料

1

单击此处查看。（57M，pdf格式）

2

单击此处查看。（48K，docx）

致谢

作者谨感谢Robert Burke博士和Christoph Kellendonk博士及其实验室成员的技术指导和支持，以及Dritan Agalliu博士、Robert Burge博士、Tyler Cutforth博士、Lisa Ellerby博士、Lloyd Greene博士、Christoph Kllendonnk博士和山本实验室成员的有益讨论。特别感谢凯瑟琳·艾博特（Katharine Abbot）和威廉·杰克逊·洛夫乔伊（William Jackson Lovejoy）的贡献，以及吉莉安·贝茨（Gillian Bates）博士和小松（Masaaki Komatsu）博士使用他们实验室产生的抗体。这项工作得到了HDF（LMF，KRC，AY）、NINDS R01 NS063973（JRB，EE，CWJ，AY，）、NIRDS R01 NS 077111（JMD，LMF，AY。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿将经过编辑、排版和校对，然后才能以最终形式出版。请注意，在制作过程中可能会发现错误，这可能会影响内容，所有适用于该杂志的法律免责声明都适用。

利益声明

作者声明没有相互竞争的利益。

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