创伤后急性滑膜炎先于骨关节炎的发生和发展

摘要

介绍

骨关节炎（OA）是美国最常见的关节炎疾病，也是导致残疾的主要原因¹膝关节骨性关节炎占疾病总负担的80%以上²并且影响到至少19%的45岁及以上的美国成年人^三OA是一种以软骨丢失、软骨下骨增厚、滑膜炎症（滑膜炎）和半月板变性为特征的全关节疾病^4,5，大多数可用的OA研究集中于软骨降解。最近，OA研究的进展开始认识到滑膜和软骨下骨在OA的发生和发展中起着重要作用。例如，磁共振成像通常可以早期检测滑膜肥大和骨髓损伤，这两者都可能先于软骨损伤⁶此外，一项荟萃分析研究报告称，在观察到的OA患者中，超声分别检测到51.5%和41.5%的膝关节渗出和滑膜肥大⁷然而，尚不清楚关节的哪个部位最先发生病理变化，以及这些变化如何导致OA的发生和发展。

在OA的发展过程中，一个里程碑式的事件是关节软骨的逐渐丧失。关节软骨的两个主要结构成分是胶原蛋白和聚集蛋白聚糖，它们被软骨降解酶如基质金属蛋白酶（MMPs）和具有血小板反应蛋白1型基序的去整合素样和金属肽酶（ADAMTs）靶向⁸例如，Adamts4和Adamts5都对aggrecan降解负责⁹MMP13是软骨细胞肥大的重要标志物，是一种有效的酶，可靶向软骨基质，尤其是II型胶原蛋白进行降解¹⁰此外，OA还与多种其他因子的异常上调有关，包括runt相关转录因子2（Runx2）、白介素6（IL-6）、白细胞介素1β（IL-1β）和神经生长因子（NGF）。其中，Runx2在软骨细胞分化中起着重要作用^11,12软骨细胞中Runx2的抑制可以部分修复DMM诱导的成年小鼠OA样缺陷¹³Col10a1是肥大软骨细胞的最特异标记物，在骨关节炎软骨中表现突出¹⁴炎症滑膜中大量表达促炎细胞因子，如IL-1、IL-6、TNFα和Ccl2，被认为对OA进展有重要作用¹⁵据报道，NGF通过增加痛觉感受器敏感性或促进感觉神经生长来调节疼痛¹⁶，滑膜NGF增加是膝关节骨性关节炎的一个特征^17,18此外，促炎性IL-1β和TNFα可以刺激滑膜成纤维细胞释放NGF，NGF也可以调节TNF的释放¹⁹.

在本研究中，我们对DMM小鼠模型进行了纵向分析，以确定OA发病过程中的病理和分子事件。我们发现，早在手术后1周就可以观察到滑膜炎的出现，这先于软骨降解、软骨下骨硬化和骨赘形成，以及疼痛敏感性显著增加和纳米压痕模量值降低。我们的基因表达谱分析结果还表明，在骨性关节炎发病早期，滑膜和关节软骨中均诱导了促炎细胞因子、聚集酶、基质金属蛋白酶和NGF，并且滑膜中的变化比软骨中的变化更为显著。总之，我们的数据表明，滑膜炎症是整个关节OA综合病理变化的主要事件，表明滑膜细胞可以作为OA早期干预的靶点。

材料和方法

结果

手术诱导OA进展过程中的组织病理学变化

我们进行苏木精和伊红染色来分析DMM OA模型中的滑膜炎。DMM手术一周后，膝关节内侧明显可见滑膜炎，滑膜增生和关节囊肥大（图​（图1）。1). DMM手术后4周，胫骨内侧软骨降解和膝关节内侧滑膜血管侵犯已经很明显（图​（图1）。1). 我们还进行了Alcian蓝/苏木精和橙色G染色，证实DMM手术4周后胫骨内侧软骨降解和软骨下骨硬化（图​（图2A）。2A） ●●●●。值得注意的是，我们的数据显示，在DMM手术后第4周，胫骨内侧出现软骨降解和软骨下骨硬化，而胫骨外侧出现软骨下骨丢失（图​（图2B）。2B） ●●●●。因此，我们的研究结果表明滑膜炎可能是手术诱导OA发病过程中的第一个事件，滑膜炎最早发生在手术后一周，随后滑膜血管侵犯以及胫骨关节软骨磨损和裂开。重要的是，所有这些病理变化都随着时间的推移而加重^第个和12^第个术后一周，软骨降解、滑膜增生和软骨下硬化比4周时更严重^第个周（图​（图22A） ●●●●。

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图1

在手术诱导OA的发病机制中，滑膜炎先于软骨降解和血管生成。如图所示，在手术后1、2、4、8或12周的不同时间点采集膝关节。苏木精-伊红染色结果显示，DMM手术组术后1周出现滑膜炎（黄色箭头），DMM术后4周出现软骨降解（黑色箭头）和血管生成（黑箭头）。比例尺，50μm。n=5。

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图2

DMM手术导致软骨降解和软骨下骨硬化的纵向组织学分析。（A） 如图所示，对在不同时间点采集的膝关节冠状切片进行阿尔西安蓝/苏木精和橙色G染色。黑色箭头，软骨退化。绿色箭头，软骨下骨硬化。比例尺，50μm。n=5。（B） 术后4周采集的关节冠状切片的Alcian蓝/苏木精橙G染色。黑色箭头，软骨退化。白色箭头，胫骨内侧软骨下骨质硬化。红色箭头，胫骨外侧软骨下骨丢失。五十、 胫骨外侧；M、 胫骨内侧。比例尺，200μm。n=5。

DMM致OA膝关节的放射学变化

为了评估DMM手术引起的异位骨形成，我们对膝关节进行了μCT扫描和分析。三维重建数据显示，术后4周、8周和12周的假手术组关节表面光滑，关节间隙保存良好。在接受DMM手术的组中，DMM手术后4周膝关节开始出现轻微骨质生长。参考组织学染色（图​（图2），2)，我们认为这种骨生长是由内侧半月板钙化所致。DMM手术后8周和12周的μCT数据显示，随着时间的推移，膝关节骨赘的数量和体积显著增加（图​（图3）。三). 此外，在12周的时间点，成簇的骨赘占据了关节间隙，显著缩小了关节间隙（图​（图3）。三). 由于滑膜炎和软骨降解在手术后4周的时间点已经很明显，我们的结果表明，DMM手术在第4周左右诱导半月板钙化，并在以后的时间点导致显著的骨赘形成，这是比滑膜炎和关节软骨降解较晚的事件。此外，我们的数据表明，骨关节炎关节的骨质变化受到关节内其他病理变化的刺激，包括滑膜炎和软骨破坏。

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图3

手术诱导OA发病机制中骨赘形成的纵向μCT分析。DMM术后8周骨赘生物（黄色箭头）生长明显，关节间隙减少（白色箭头），术后12周表型加重。五十、 横向；M、 内侧。比例尺，1 mm。n=7。

OA诱导基质蛋白和蛋白酶水平的变化

我们发现DMM手术后8周组织学改变明显¹³为了追踪软骨基质蛋白的早期变化，我们在手术后4周的时间点采集右膝关节进行免疫组织化学（IHC）分析。由于MMP13和ColX是肥大软骨细胞最重要的标志物，我们在DMM手术后4周进行IHC分析这两个标志物的表达。我们的免疫染色结果显示MMP13在胫骨内侧软骨的中浅区的表达增加和扩大（图​（图4A），4A） 以及DMM手术4周后胫骨内侧和股骨软骨中ColX表达上调（图​（图44B）,提示软骨细胞肥大和软骨变性发生在关节前，表现出明显的组织学改变。

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图4

OA进展期间内侧关节软骨中MMP13和ColX的诱导。DMM术后4周膝关节切片MMP13（A）和ColX（B）的免疫组织化学研究。红色箭头，正IHC信号。值得注意的是，在假手术组的胫骨外侧和内侧以及DMM组的胫外侧，MMP13在关节软骨中的表达较弱，并且主要局限于深部和软骨下骨附近。然而，在DMM组，MMP13在胫骨内侧软骨中的表达增加，并扩展到中层和浅层。比例尺，50μm.***p<0.001。****p＜0.0001。单向方差分析，然后是Tukey的多重比较后测试n=5。

DMM术后第四周胫骨内侧软骨模量值下降

力学性能是软骨功能的直接指标。先前的一项研究报告称，小鼠软骨的纳米压痕模量是创伤后骨关节炎发生和发展的敏感指标²⁷在我们的研究中，假手术组和DMM组在DMM手术后2周的时间点，胫骨内侧和外侧的模量值没有显著差异。然而，我们发现DMM手术4周后胫骨内侧纳米压痕模量值显著下降，并且在DMM手术8周后的时间点，模量值的损失加剧（图​（图5）。5). 值得注意的是，术后4周，假手术组和DMM组的胫骨外侧纳米压痕模量值没有显著差异。随着OA进展，胫骨外侧在手术后8周显示纳米压痕模量值显著降低（降低68.5%）。因此，我们的数据表明，胫骨内侧（即手术侧）的纳米压痕模量值的变化早于胫骨外侧（即半月板的非手术侧）。

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图5

OA发病过程中胫骨软骨纳米压痕模量的长期变化。按照纳米压痕试验的要求，在不同的时间点采集膝关节。测量胫骨内侧（A）和外侧（B）。*p<0.05。**p＜0.01。单向方差分析，然后进行Bonferroni的多重比较后检验。n=4。

OA疼痛相关行为的纵向变化

骨关节炎（OA）的特征性症状之一是疼痛，这会促使患者寻求医疗护理，并导致功能受限和生活质量下降。为了测量小鼠OA相关疼痛，我们进行了热板试验和自发活动分析。热板试验的数据表明，从DMM手术后8周的时间点开始，DMM手术小鼠的反应潜伏期明显低于假手术组小鼠（图​（图6A）。6A） ●●●●。同样，术后4周，假手术组和DMM组的自发活动分析结果没有显著差异，但DMM组自术后8周的时间点起，垂直和水平运动均显著减少，表明OA疼痛随着OA进展而加重（图​（图6B6B和​和66C） ●●●●。

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图6

DMM手术引起疼痛敏感性的纵向行为测试。(A） 热板测试结果显示，DMM手术自术后8周起潜伏期减少，表明出现了热痛觉过敏。（B和C）自DMM手术后8周以来，以垂直光束交叉（B）和水平光束交叉测量（C）显示的自发性饲养活动减少。*p<0.05。**p＜0.01。采用Bonferroni的多重比较后测试进行单向方差分析。数值为平均值±标准偏差。n=7。

OA相关基因mRNA表达的时空分析

为了测量OA相关基因的表达变化，我们在手术后三天就从滑膜和胫骨软骨中分离出总RNA。在滑膜中，促炎细胞因子IL1b、IL6、TNFα，和Ccl2，与假手术组相比，DMM组显著增加（图​（图7A-D）。7A-D）。在胫骨软骨中，只有IL6（IL6）和Ccl2公司并且增长幅度适中（图​（图7B7B和​和7D），7D） 远低于滑膜（图​（图7B7B和​和7D）。7D） ●●●●。此外，促炎细胞因子的表达IL1b级和肿瘤坏死因子α（图​（图7A7A和​和7C）7C） 与假手术组相比，胫骨软骨无显著差异（图​（图7A7A和​和7C）。7C） ●●●●。NGF通过增加痛觉感受器敏感性或促进感觉神经生长而与炎症疼痛相关，在DMM组的滑膜和软骨中显著增加（图​（图7E）。7E） ●●●●。此外，我们发现百万像素13由于DMM手术，滑膜和胫骨软骨显著增加（图​（图7K）。7K） 。此外，Runx2是一种重要的转录因子，在调节OA形成过程中软骨细胞肥大和基质降解的重要基因方面起着关键作用，在DMM手术后三天，滑膜和胫骨软骨中的Runx2显著增加（图​（图7F）。7F） ●●●●。总之，我们的数据显示，早在手术后三天，滑膜和软骨中就诱导了OA相关基因，并且滑膜中的诱导作用比软骨中的诱导更为显著，这表明滑膜的病理变化是控制OA进展的关键事件。

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图7

滑膜OA相关因子的早期诱导。DMM手术后3天，测量滑膜和关节软骨中炎性细胞因子（IL-1β、IL-6、TNFα和Ccl2）、NGF、Runx2和细胞外基质降解酶（Adamts4、Adamts5、Adamts 7、Adamtes12、Mmp13、Mmp3和Mmp9）的mRNA表达水平。*p<0.05。**p＜0.01。未配对学生的t检验。数值为平均值±标准偏差。n=3。

讨论

骨性关节炎是成年人中最常见的关节紊乱和致残的主要原因²⁸它影响了大量人口。然而，目前OA的分子病因尚不明确，因此没有治愈方法。小鼠模型为OA治疗的基础研究和临床实践提供了一块独特的垫脚石²⁹DMM是目前最常用的小鼠OA诱导手术模型，该模型通过横断内侧半月板胫韧带进行，导致半月板轻度不稳定。它的可靠性、可重复性、与人类OA的表型相似性以及几个疼痛终点的有效性，包括使用标准止痛药逆转疼痛，使该模型成为研究OA病理生理学的理想模型。软骨破坏是OA的一个特征和主要表现型。此外，众所周知，OA不仅是软骨稳态障碍，而且是一种全关节疾病，涉及关节组织的所有结构，包括软骨下骨和滑膜⁴.

力学性能是软骨功能的直接指标。此外，机械变化代表了成分和结构变化的综合响应^27,30小鼠软骨的纳米压痕模量是创伤后骨关节炎发生和发展的敏感指标²⁷纳米压痕模量的降低可能是由于蛋白质水解活性的提高²⁷在本研究中，我们观察到，与假手术组相比，DMM手术后4周，小鼠胫骨内侧的纳米压痕模量降低，同时伴有组织学OA征象，在手术后4星期可以检测到。此外，我们测试了膝关节的胫骨外侧，发现与假手术组相比，术后8周DMM组的纳米压痕模量下降，这晚于胫骨内侧。我们的数据表明，胫骨内侧髁软骨是DMM相关创伤的更易感部位。然而，外侧髁突软骨在随后的时间点发生了退化，说明了OA的整体性质。

滑膜炎现在被认为是OA早期和晚期的特征，尽管OA的炎症程度明显低于RA³¹在本研究中，与假手术组相比，DMM手术组术后一周的H&E染色显示膝关节滑膜明显炎症，其早于术后4周观察到的软骨降解（通过组织学染色显示）和术后8周骨赘出现（通过μCT扫描显示）。此外，我们的研究显示，促炎细胞因子的显著诱导包括IL1b级（18.99倍），IL6（IL6）（15.99倍），肿瘤坏死因子α（1.54倍），Ccl2公司DMM组在DMM手术后第三天即在滑膜上进行（10.17次）。具体而言，包括IL1、IL6和CCL2在内的这些促炎细胞因子由炎症滑膜产生并释放到滑液中，可能在启动软骨降解和促进OA进展中发挥重要作用。总之，我们的数据表明滑膜炎是OA发展的早期事件。

据报道，NGF通过增加痛觉感受器敏感性或促进感觉神经生长来调节炎症疼痛¹⁶一项研究报告称，滑膜NGF增加是膝关节OA的一个特征，可能与症状有关¹⁷另一方面，促炎性IL-1β和TNFα可以刺激滑膜成纤维细胞释放NGF，NGF也可以调节TNF的释放¹⁹.正如我们发现的IL1b、TNFα和Ngf公司在DMM手术后的滑膜中，我们的结果可能表明促炎细胞因子和NGF在OA发病机制的启动和疼痛相关行为改变的发展中存在关联。事实上，我们观察到DMM组在手术八周后疼痛敏感性显著增加。总之，我们的结果表明滑膜中的分子和病理变化，包括细胞因子和炎症、肥大滑膜组织的增强表达，促进了滑膜中NGF的表达，进而诱导感觉神经生长，导致疼痛相关行为的病理改变.

软骨降解酶如Adamts4和MMP13在OA软骨损伤中起着关键作用。多项研究表明，滑膜巨噬细胞通过增加促炎细胞因子的表达，在积极调节这些蛋白酶的产生方面具有基本作用。例如，滑膜巨噬细胞产生的TNFα和/或IL-1β可以驱动亚当斯4滑膜成纤维细胞³²此外，OA培养滑膜细胞中巨噬细胞的选择性耗竭导致几种成纤维细胞产生的细胞因子和基质金属蛋白酶的下调³³在我们的研究中，我们发现两者都显著增加亚当斯4和百万像素13早在DMM手术后3天在小鼠滑膜中。结合细胞因子诱导的数据，我们的结果表明亚当斯4和百万像素13可能被滑膜巨噬细胞产生的促炎细胞因子上调。此外，我们发现Runx2是一种转录因子，在调节软骨细胞肥大和基质降解重要基因方面发挥关键作用，在DMM手术后三天显著增加。因为Runx2激活百万像素13通过结合位于人类近端的OSE2位点表达百万像素13软骨细胞中的启动子³⁴，我们得出结论：13毫米Runx2在滑膜和胫骨软骨中的诱导也可能有助于表达。总之，我们的结果揭示了一条综合途径，滑膜变化通过该途径在早期阶段诱导软骨降解，通过产生增加的细胞因子和Runx2促进软骨分解代谢酶的表达，启动软骨降解。

如上所述，RT-PCR数据显示，早在DMM手术后三天，与假手术组相比，滑膜和胫骨软骨中的促炎细胞因子、聚集酶和基质金属蛋白酶显著增加。然而，这些因素在滑膜中的增加程度远大于胫骨软骨。人们认为滑膜可以影响胫骨软骨，滑膜对软骨细胞的影响在OA的病理生理学中起着关键作用^35-37这主要由细胞因子和生长因子（如IL-1、IL-6和TNF）的释放触发³⁸这些因子由滑膜产生，并通过滑液扩散到软骨中，可能导致软骨细胞凋亡增加³⁷此外，一项研究表明滑膜巨噬细胞的激活在软骨损伤中起着关键作用，这表明滑膜炎可能是OA发展的关键因素³³.

该项目的目的是找出膝关节的哪个部位是OA发病的主要原因。在本研究中，在DMM手术后4周，可以观察到Alcian蓝/苏木精橙G染色显示的组织学变化，包括细胞外基质的降解和软骨下硬化；此外，苏木精-伊红染色显示滑膜炎症，最早可在DMM手术后1周观察到。骨赘是OA的另一个重要特征，DMM术后8周通过μCT扫描可以观察到骨赘。然而，早在术后3天，就可以在膝关节滑膜中检测到一些分子变化，如促炎相关细胞因子和细胞外基质降解酶的增加。因此，这些发现清楚地表明滑膜炎在OA发病和发展中的重要作用。行为结果表明，DMM手术使小鼠在诱导后8周的OA发育过程中产生更大的膝关节疼痛，这晚于组织学和分子变化。

总之，我们的结果表明，发生在软骨降解之前的滑膜炎症是OA发生和发展的早期事件。此外，OA发病机制中的炎症和破坏性反应在很大程度上依赖于滑膜细胞，滑膜细胞产生IL-1β和TNF-α等促炎细胞因子，因此对关节的其他部位具有综合作用，并有助于软骨降解、滑膜增生、软骨下硬化、，和OA疼痛。

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