成像动态和选择性低复杂度域交互控制基因转录

摘要

图形摘要

从轮毂到相分离：激活发生在广泛的TF浓度。体内LCD依赖性转录激活发生在在广泛的TF浓度范围内（100 nM至100μM）形成的轮毂，以及时间刻度（<1s tominutes）。在内源性浓度下，TF-LCD形成未经历明显阶段的本地基因组位点的反式激活中心分离。TF LCD过度表达后，在合成TF结合位点阵列。

序列特异性DNA结合转录因子（TF）是卓越的参与者在真核基因调控中。从人类TF的最早研究中，人们认识到调节蛋白如Sp1包含结构良好的DNA结合域（DBD）以及参与特定TF-TF的功能关键的交易激活域直接基因转录的相互作用(1——三). 无数原子DBD的结构提供了对TF-DNA相互作用的具体理解。在相反，许多事务激活域包含低复杂度序列域（LCD）坚持内在无序构象，不符合常规结构决定。TF-LCD中的突变不仅破坏转录，而且与癌症和神经退行性疾病有关(4,5). 然而TF-LCD执行特定交易激活功能的机制仍然是谜。鉴于TF-TF的动态性质，说明液晶显示器在体内的工作方式基因调控所需的相互作用也是一个同样具有挑战性的问题。

几项体外研究表明，从FET蛋白中纯化的LCD家族（FUS、EWS和TAF15）可以经历可逆水凝胶形成或液-液高浓度和低温下的相分离(6——8). 此外，RNA聚合酶II（RNA Pol II）的C末端结构域本身是一个液晶显示器，可以相分离(9)并被纳入FET磷酸化调节方式的液晶水凝胶(10). FET-LCD也被报道在活细胞中发生相分离过度表达时(7,11).

然而，体内生理条件和用于体外或过表达研究的那些。温度、蛋白质浓度、，纯度和微环境都可能对液晶显示器的性能产生重大影响。那里对于液晶显示器是进行交叉β聚合还是与伙伴互动时保持无序构象(6——8,11——17). 从阐明TF如何在体内工作的角度来看亟待解决的机制问题涉及到治理的动力学和时间尺度允许TF在快速细胞过程中发挥作用的LCD-LCD相互作用。同源LCD-LCD相互作用的选择性是另一个重要但却鲜为人知的问题体内正常TF功能所需的特征。迄今为止，选择性LCD-LCD识别还没有在体内直接证明，更不用说在机械水平。在本研究中，我们结合了各种高分辨率成像包括荧光相关光谱（FCS）的策略(18,19)，荧光光漂白后的恢复(20),点阵光片显微镜(21),三维DNA荧光原位杂交(22)、和活细胞单粒子跟踪（SPT）(23,24)-探讨TF-LCD在目标基因组位点的动态行为生理条件。

合成LacO阵列介导LCD交互中心的形成

我们首先使用合成的Lac建立了概念验证实验操作员（LacO）阵列（约50000个LacO重复）整合到人类基因组中U2OS电池(25)表示各种增强黄色荧光蛋白（EYFP）标记的TF-LCD与Lac阻遏物（LacI）融合(图1A). 探测电位序列我们研究了两类不同的液晶显示器：富QGYS液晶显示器FET系列液晶显示器和低酪氨酸的Sp1富含QGTS的液晶显示器(表S1)（Q Gln；G，Gly；Y，泰尔；S、 序列号；T、 Thr）。

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图1。

LacO阵列可以在活细胞中调节LCD集线器的形成包括广泛的LCD自我交互，并招募RNA Pol II。

(A类)LacO阵列示意图(n个≈阵列1重复50000次，n个≈15000次阵列重复2） 当EYFP-LCD-LacI短暂出现时，U20S基因组中的液晶集线器成核表达。或者，EYFP-LacI表示为对照。NLS，核定位信号。(B)共焦荧光和亮场含有LacO的U20S细胞的图像，其中LacO阵列1（以圆圈突出显示）受EYFP标记的LCD-LacI或LacI约束。LCD-LacI-bound，但非LacI-bound，LacO阵列在亮场图像中可见。(C类和D类)EYFP-labeled（C）或mCherry-labeled（D）TAF15的副本号LCD-LacI（红色）或LacI分子（蓝色）结合到LacO阵列1（C）或2（D）作为TF平均核浓度的函数。测量浓度通过荧光强度比较。每个点代表一个单元格。(E类)LacO阵列1的平均FRAP曲线受mCherry-labeled TAF15 LCD-LacI（红色）或Lac（蓝色）。误差条代表SD。a.u.，任意单位；N、，分析的细胞数。(F类)（上图）含LacO的U20S线。（下图）共焦荧光图像显示Halo-RPB1（用200 nM Halo配体JF500标记，绿色）在LacO富集数组2由mCherry-EWS LCD-LacI绑定（红色）。(G公司)（左）平均值LacO阵列2的Halo-RPB1图像由mCherry标记的LacI、EWS LCD-LacI和，FUS LCD-LacI或TAF15 LCD-Lac(N个=55、69、81或143）。（右）Halo-RPB1在LacO阵列中心的荧光强度减去核Halo-RPB1背景后的平均图像（见补充方法).**表示与LacI情况相比在统计学上显著增加(P（P）<0.01，两个样本t吨测试）。错误条表示引导的SD(45).

正如预期的那样，LacO阵列招募了大量EYFP-LCD-LacI分子通过靶向DNA结合，在原子核。LCD-LacI形成而非LacI的LacO-相关集线器可见于亮场显微镜(图1B)，建议LCD-LacI集线器的折射率和质量密度与周围的核环境。

我们发现TAF15-LacI和Sp1-LacI都能产生更明亮和与LacI相比，LacO相关的LCD集线器更大。为了量化这种影响，我们使用了两种正交法测量活细胞中的蛋白质浓度。具体来说，我们对细胞内蛋白，并将结果与标准浓度曲线进行比较用相同方法校准的纯化荧光标签（EYFP或mCherry）(图S1). 接下来，我们估计使用in-hub平均蛋白计算每个hub中的绝对蛋白拷贝数浓度(图S2A)在单细胞图像中测量轮毂尺寸(图S2B). 这两个独立的浓度测量一致表明，LCD-LacI拷贝数在LacO-相关中心随TF核浓度增加的速度远快于单独使用LacI，达到比数字大几个数量级的水平可用于直接LacO-LacI结合的LacO重复序列(图1C和图S2,C类和D类)，表示可能合作LacO阵列上的多价相互作用由广泛的LCD提供自我互动。类似地，更小的LacO阵列包含更少的（~15000）LacO重复类似的核LCD自相互作用(图1D和图S2,E类和F类).

此外，LCD-LacI而非LacI单独可以形成数百个较小的穿孔一旦核内浓度达到一定值阈值(图1B和​和2A，2安培、和图S2,G公司和H（H）). LCD可以形成在某些情况下，即使没有融合到DBD，如LacI，核内点状突起(图3A，底部）。这些结果表明LCD-LCD相互作用可以促进过度表达时LCD中枢的自组装没有DNA的帮助(7,11).

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图2。

LCD中枢的形成涉及选择性的蛋白质-蛋白质相互作用，这可以被1,6-HD干扰，具有序列依赖性灵敏度。

(A类)U2OS细胞共聚焦荧光图像共存mCherry-LCD和EYFP-LCD-LacI。拉科阵列周围的区域被放大。

(B)mCherry-LCD（红色）富集的定量在LacO阵列1上与各种EYFP标记的LCD-LacI融合蛋白结合（绿色），计算为阵列处的峰值mCherry荧光强度除以紧邻阵列的平均强度(图S5A). 空，mCherry未与任何LCD熔合。1以上阵列中的mCherry富集表明LCD-LCD交互。*表示大于1的统计显著差异(P（P）<0.05，一个样本t吨测试）。NS、，上述差异不显著。误差条代表SE(C类)FUS和Sp1 LCD集线器之前（0秒）和之后（29秒）的荧光图像添加10%1,6-HD。

(D类)FUS或Sp1 LCD形成的核穿孔数添加不同浓度的1,6-HD后随时间存活。错误条形代表SE。

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图3。

集线器形成过程中涉及的LCD-LCD交互是高度动态的。

(A类)同时拍摄双色SPT电影的快照成像EYFP标记（绿色）EWS LCD-LacI（顶部，形成LacO-相关LCD集线器）或EWS LCD（底部，形成不附属于LacO阵列）和U2OS中的Halo标签EWS LCD（标有2 nM PA-JF646，红色）含有LacO阵列1的细胞。一条白色虚线勾勒出细胞核的轮廓。我们对EYFP通道（绿色）中的集线器进行了成像，并跟踪了单个Halo EWSPA-JF646通道中采集时间为500 ms的LCD分子（红色）。(B)LCD（红色）在与LacO阵列相关的LCD集线器或不隶属于的自聚合LCD集线器数组（绿色）*P（P）<0.05，两个样本t吨测试。误差条代表SE。

此外，LCD-LacI在LacO阵列上的FRAP动力学也是与LacI显著不同(图。1E级). 因为扩散对FRAP动力学的贡献可以忽略不计(图S3,A类和B)，这种差异可以归因于解离速率的变化。具体来说，当我们用反应主导模型(26)，我们发现将TAF15或FUS LCD与LacI融合可使游离减少60%以上LacI的速率常数(图。第3章,C类到F类). 这一结果表明当本地TF浓度增加时，TF LCD集线器由LCD-LCD交互驱动通过多价接触稳定TF与其同源基因组位点的结合包括用于连接染色质的DBD和TF蛋白中的一个或多个LCD它可以与不同的伙伴蛋白形成多次短暂的相互作用。

LCD集线器与RNA Pol II相互作用

在证明了同型液晶显示器的自相互作用之后，我们接下来进行了研究异型LCD-LCD相互作用在轮毂形成中的潜在作用。首先，我们通过使用含有LacO的U2OS细胞系，我们在其中替换了内源性RPB1（主要和RNA Pol II的催化亚单位，具有抗α-amanitin卤标记RPB1型(27). 我们随后标记了细胞荧光HaloTag配体和可视化RNA Pol II在体内的分布。我们发现mCherry-FET-LacI表达介导RNA Pol II的显著富集与单独使用LacI记录的背景水平相比，在LacO相关中心(图1、F和G，以及图S4,A类到C类). 此外，自组装液晶显示器LacI与LacO阵列无关的中心也丰富了RNA Pol II(图S4D)，建议LCD集线器在没有DNA帮助的情况下，可能与RNA Pol II相互作用。While期间综述RNA Pol II在LCD水凝胶中的体外掺入(10)这些实验更进一步建议LCD集线器的形成可以促进将军的招募体内转录机制是实现转录激活的关键一步。

LCD-LCD交互是序列特定的，对己二醇破坏

接下来，我们探讨了不同基因之间相互作用的序列特异性LCD的等级。为此，我们在含LacO的细胞。缺少DBD的mCherry-LCD仅在阵列中得到丰富当它可以与与LacI融合的共存LCD交互时(图2A和图S5A). 值得注意的是，该数组可以在广泛的表达水平上丰富mCherry-LCD。EWS-LacI-bound LacO免疫荧光检测到，阵列还丰富了内源性EWSR1(图S5B). 因此，mCherry-LCD在阵列上的富集很可能是由于特定的LCD-LCD相互作用而不是潜在的非特异性过度表达伪影。使用此双色成像分析，我们确认了所有受试LCD的同型自交联（来自FET系列和Sp1）。有趣的是，尽管所有三个FET LCD都相互作用他们当中没有一个人与Sp1 LCD交互(图2，A和B），表明LCD交互显示强烈的序列特异性可能是潜在的基本特征基因表达的组合TF调节。

为了更好地理解LCD-LCD相互作用的本质，我们对细胞进行了处理与1,6-己二醇（1,6-HD），一种已知能溶解各种细胞内无膜隔室和FUS水凝胶的体外研究破坏疏水相互作用(28——30). 我们观察到当接触10%时，FUS和Sp1 LCD集线器在30秒内快速拆卸1,6-高清。与LacO相关的LCD诱导集线器缩小到与仅受LacI约束的阵列，而所有核点与LacO无关消失了(图2C和电影1). 我们还发现2,5-己二醇（2,5-HD），一种疏水性较低的1,6-HD衍生物，几乎不熔化FUS水凝胶的体外研究(28)，中断LCD活细胞中的集线器效率较低(图S5,C类和D类). 这种相关性己二醇的疏水性和LCD轮毂的熔化表明这些脂肪族醇可能通过破坏关键疏水性直接影响LCD-LCD相互作用联络。这些体内结果也反映了使用这些药物进行的体外水凝胶研究相同的中断代理(28).

Sp1 LCD集线器的中断速度明显快于带有2或5%1,6-HD的FUS LCD集线器(图2D).因此，尽管分子间作用力的组合可能有助于LCD集线器我们的结果表明疏水相互作用可能更多对干扰敏感，在Sp1 LCD自我交互中发挥更大的作用与FUS LCD相比，与稀疏含有疏水残基的Sp1 LCD一致穿插在Q重复之间(31). 这个1,6-HD揭示的LCD-LCD相互作用的差序依赖性处理可能与同型和异型LCD的选择性有关上述观察到的相互作用。

LCD-LCD交互高度动态

为了研究LCD对之间蛋白质相互作用的动力学，我们在含LacO的U2OS细胞中共表达EYFP-LCD-LacI和Halo-LCD对Halo-LCD进行SPT，以测量LCD-LCD相互作用的停留时间（RT）在LacO相关中心内(图3A，顶部）。对于所有测试的液晶显示器，自我交互产生的RT在11至33秒(图3B). 当EYFP-LCD和Halo-LCD来自FET家族在高水平上共存，它们自发形成中枢与阵列无关，类似核内点状突起(图3A，底部）。这些非阵列集线器通过以下方式绑定Halo-LCD具有更短RT（7至10 s）的同种异型相互作用。正如预期的那样未能与FUS LCD交互的Sp1 LCD在非阵列FUS LCD集线器(图3B). 事实上在与基因组DNA无关的自聚集中心中，许多LCD的RT是与LacO阵列形成的集线器相比，TF-DNA要短得多维持TF-LCD局部高浓度的相互作用有助于稳定LCD-LCD相互作用，反之亦然。总之，这些发现揭示了LCD-LCD和TF-DNA相互作用的快速、可逆和相互依赖性以及他们倾向于形成可能稳定的地方高集中中心多组分复合物例如，转录前起始复合物，a交易激活的先决条件。

EWS/FLI1在内源性GGAA微卫星上形成中心

揭示了LCD-LCD的序列特异性和动态性质通过在活细胞中使用合成LacO阵列进行相互作用，我们接下来测试了LCD天然GGAA微卫星（>20个GGAA重复序列）在尤因肉瘤细胞系A673(32——35). 这些癌细胞携带染色体易位t（11；22）（q24；q12），产生融合癌基因，EWS/FLI1，编码由EWSR1的反激活LCD和FLI1针对GGAA序列的DBD(图4A).

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图4。

结合DNA FISH和EWS/FLI1-Halo成像显示内源性EWS/FLI 1在GGAA微型卫星上形成中心。

（A） A673基因组成核中GGAA微卫星示意图内源性卤代标记EWS/FLI1的中心。

（B） EWS/FLI1和β-肌动蛋白的Western blot（正常化对照）克隆EWS/FLI1-Halo敲除（KI）、WT和克隆EWS/FLI1敲除（KO）A673线。（C）z（z）-内生的投影三维图像A673细胞核中的EWS/FLI1-Halo（用200 nM Halo配体JF549染色）在点阵光片显微镜上拍摄。（D） 共聚焦荧光图像靶向GGAA微卫星邻接物的3D DNA FISHCAV1型基因（增强型Cy5标记，红色）和内源性EWS/FLI1-Halo（JF549标记，绿色）。放大视图描绘了一个特定区域周围的区域CAV1型轨迹。EWS/FLI1-该位置的晕富集为可见，但隐藏在高背景中。

（E） 五个GGAA微卫星相邻基因的平均双色图像位点(CAV1、FCGRT、ABHD6、KDSR、，和罗马尼亚1797年)和两个不含GGAA微卫星的基因位点（Non-GGAA位点1瞄准ADGRA3公司和基因座2靶向REEP5（参考5）).右栏显示EWS/FLI1-Halo的平均曲面图。

为了可视化内源性表达的EWS/FLI1的行为，我们融合了一个使用CRISPR-Cas9介导的A673细胞基因组编辑将HaloTag导入其DBD(图4、A和B，以及图S6A) (36). 这种敲门策略让我们得以想象荧光标记的正常表达水平的内源性EWS/FLI1(图4B)这一点至关重要，因为液晶显示器往往过度表达后自我聚集并表现异常。确保我们确认，卤代标记不会破坏EWS/FLI1的交易激活功能EWS/FLI1-Halo激活含有GGAA的荧光素酶报告子结构微卫星驱动启动子(33)作为与野生型（WT）EWS/FLI1一样高效(图S6C). 更重要的是，使用金标准肿瘤转化试验(37)，我们确认EWS/FLI1-Halo敲除A673细胞形成软琼脂中的菌落很像WT A673细胞，尽管效率较低(图S6,D类和E类).

接下来，我们进行了高分辨率点阵光片显微镜检查，发现EWS/FLI1在原子核(图4C和电影2). 检测到的数量核内枢纽的数量级与人类基因组中EWS/FLI1-bound GGAA微卫星（~6000）的估计染色质免疫沉淀测序及生物信息学分析(38). 检查空间关系在EWS/FLI1中心和GGAA微卫星之间，我们进行了同步共聚焦GGAA附近EWS/FLI1-Halo和3D DNA FISH靶向基因的成像受EWS/FLI1调控的微卫星(图。4D（四维）)，包括CAV1、FCGRT、ABHD6、KDSR、，和基亚纳1797(33,39). 尽管检测到EWS/FLI1富集在这些基因的许多单基因座上，核内的拥挤分布EWS/FLI1集线器使得很难在单个集线器上清楚地显示EWS/FLI富集目标位点。通过记录每个基因约1000个位点的图像该比率显著提高，以揭示GGAA重复序列的特定EWS/FLI1富集，而在非GGAA基因位点没有发现富集(图4E). 这些结果表明，EWS/FLI1在内源性GGAA微卫星DNA元件。

EWS LCD-LCD动态交互调节EWS/FLI1集线器的形成

我们之前显示，由于LCD-LCD相互作用，LCD-LacI复制随着TF浓度的增加，LacO相关中心的数量增加得更快比仅拉西岛高出一个数量级LacO阵列上可用TF结合位点的数量(图1、C和D，以及图S2,C类到F类). 使用建立的方法早些时候，我们估计了内源性卤代标记物的核内浓度A673细胞中的EWS/FLI1约为200 nM，每个轮毂的EWS/FLI1拷贝数中值在GGAA微型卫星上为24(图S7,A类和B). 据报道大多数EWS/FLI1结合的微卫星包含11到19个GGAA基序，中间值为大约15(38). 因为FLI1的DBD占据两个连续的GGAA重复(33),通过直接招募到微卫星的EWS/FLI1分子的中位数DNA-蛋白质相互作用估计为8。事实上GGAA相关中心中EWS/FLI1分子的数量明显大于与GGAA重复序列的直接结合可以适应的情况表明合成的LacO阵列，这些天然基因组元件也可以有效地成核EWS LCD-LCD交互以形成本地高浓度TF中心。此外，当瞬时表达EWS/FLI1-Halo或Halo标记LCD缺失突变体（FLI1DBD）在U2OS细胞中，我们再次观察到作为TF的函数，GGAA附属枢纽的增长速度远快于FLI1 DBD浓度(图S7,C类和D类)，提供了强有力的证据LCD-LCD相互作用发生在GGAA附属的EWS/FLI1枢纽。

我们之前观察到LCD交互中心的形成速度减慢LCD-LacI从LacO阵列中向下解离(图1E和图。S3F系列). 如果在EWS/FLI1集线器形成过程中也涉及LCD-LCD交互在GGAA微型卫星上，我们预计GGAA附属中心内EWS/FLI1的RT将比轮毂外部EWS/FLI1的长度更长。我们对EWS/FLI1-Halo敲入进行了染色带有两个荧光配体的A673细胞(40,41)：高浓度JF549染色可显示细胞核中的EWS/FLI1枢纽，而低浓度PA-JF646染色可实时跟踪单个EWS/FLI1分子(图5A和电影3). SPT显示平均RTGGAA附属枢纽内外的EWS/FLI1分别为90秒和16秒(图5B和图S8,A类和B). EWS/FLI1绑定到的事实GGAA重复时间显著延长，这表明EWS LCD-LCDGGAA附属中心的形成涉及互动。这是非常LCD-LCD相互作用和DBD与GGAA重复的结合很可能协同工作以稳定轮毂形成，就像我们在LacO阵列上观察到的LCD-LacI一样。

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图5。

GGAA微卫星上发生动态LCD-LCD相互作用，稳定EWS/FLI1绑定并驱动其事务激活功能。

（A） SPT电影成像内源性EWS/FLI1-Halo标记的快照带有两个Halo配体，JF549（200 nM）和PA-JF646（20 nM）。我们想象了EWS/FLI1-JF549通道中的Halo集线器（绿色）和跟踪单个EWS/FLI1-PA-JF646通道中轮毂内外的Halo分子（红色）。

（B） EWS/FLI1在枢纽中的停留时间比其SPT确定的枢纽外停留时间(**P（P）<0.01，两个样本t吨测试）。误差条代表SE（C）EWS LCD在受EWS LCD-LacI约束的LacO阵列1上得到了丰富，但预警系统（YS₂₉)LCD未被招募到阵列中预警系统（YS₂₉)液晶液晶液晶显示器。然而，EWS（YF₂₉)LCD是EWS招募到阵列（YF₂₉)LCD-拉西。（D） （顶部）示意图EWS/FLI1KO A673细胞中瞬时表达的蛋白质：卤标记EWS/FLI 1，EWS（YS）/FLI1或FLI1 DBD。（底部）EWS/FLI1及其变体的停留时间根据SPT的决定，在轮毂内外进行捆绑*P（P）<0.05，两个样本t吨测试。误差条代表SE（E）SPT电影的快照同时成像SNAP_（f）-已标记EWS/FLI1（200 nM JF549标记，绿色）和带Halo标签的EWS或EWS（YS）LCD（20 nMEWS/FLI1 KO A673细胞中标记的PA-JF646，红色）。单个LCD-Halo分子使用（A）中描述的策略进行跟踪。（F） EWS停留时间根据SPT的确定，EWS/FLI1集线器的绑定长度比EWS（YS）LCD的绑定长度长(*P（P）<0.05，两个样本t吨测试）。误差条代表SE。（G）荧光素酶分析显示EWS/FLI1但不是EWS（YS）/FLI1或FLI1 DBD激活GGAA微卫星驱动的报告者(**P（P）<0.01，两个样本t吨测试）。误差条代表SE。（H）RT-qPCR显示GGAA下调EWS/FLI1 KO后A673细胞中的微卫星相关EWS/FLI靶基因。外源性（Exo）EWS/FLI1的稳定表达，但不表达突变体EWS（YS）/FLI1拯救了EWS/FLI1 KO A673细胞的表达缺陷。对于每个目标基因，mRNA水平使用五个不同的不变基因进行标准化(图S10A)和图为相对于WT A673线中mRNA水平的折叠变化（设置为1）*P（P）<0.05，两个样本t吨测试。NS，无统计学意义。误差条表示SD。

确认本机设置中的集线器形成取决于EWSLCD，我们确定了LCD中的突变如何影响EWS/FLI1的RT。我们开始了通过替换不同的数字(米=第3、7、10、17或29页）EWS LCD中的酪氨酸（Y）（EWSR1的残基47至266）与丝氨酸（S），然后测试突变液晶显示器的自交联能力_米)]使用早期建立的LacO阵列分析。如前所示，当我们共存时EYFP-EWS-LacI和mCherry-EWS，mCherry信号在LacO阵列处变得丰富由于EWS LCD自我交互。值得注意的是，当我们在两次融合中替换WT-EWS时蛋白质与EWS（YS_米)，mCherry在阵列中逐渐富集随着Y-to-S突变数量的增加而减少(图S9A)然后消失了预警系统（YS₂₉)所有酪氨酸都被替换(图5C). 同样，我们发现EWS（YS₂₉)不与WT EWS交互(图S9,B和C类). 相比之下，a用苯丙氨酸（F）替换所有29个酪氨酸的突变型[EWS（YF₂₉)]保持与自身和WT EWS的枢纽形成活动(图5C和图S9D)，暗示着芳香氨基酸和疏水性接触是EWS LCD-LCD的主要驱动因素互动。构象紊乱、脯氨酸残基和酸性氨基酸EWS LCD可能在保持这些关键疏水残基暴露方面发挥作用向有偿付能力和潜在约束力的合作伙伴提供，而不会被隔离在崩溃的状态(42).

接下来，我们探讨了破坏LCD集线器形成的突变对EWS/FLI1的RT。检测A673细胞中EWS/FLI1变异体的行为对内源性EWS/FLI1的干扰，我们产生了EWS/FLI1敲除A673系使用CRISPR-Cas9介导的基因组编辑(图。4B类和图S6B)并验证了EWS/FLI1-Halo在基因敲除系表现出与内源性基因相似的结合动力学EWS/FLI1光晕(图5、B和D，以及图S8C). 然后我们短暂表达类似水平的FLI1 DBD-Halo或Halo标记的37-残留Y-to-S突变体[EWS（YS）/FLI1]。这两个突变体在细胞核中仍然显示出一些枢纽，但这些中心已大大减少。SPT透露与野生型相比，突变体显著减少（51-65%）EWS/FLI1，而其外部子站RT基本保持不变(图5D). 这些结果共同证实了LCD-LCD相互作用推动了GGAA微卫星EWS中心的形成。

测量发生的蛋白质相互作用的动力学在EWS LCD集线器中，我们短暂地表达了SNAP_（f）-标记EWS/FLI1和EWS/FLI1敲除序列中的卤代标记EWS，并标记这两种融合蛋白使用具有不同发射光谱的荧光配体(40,41). 鉴于EWS/FLI1-捕捉_（f）通过蛋白-DNA在GGAA微卫星上形成中心结合，EWS LCD-Halo，不与DNA相互作用，仅与EWS/FLI1集线器结合通过蛋白质相互作用。我们可视化了EWS/FLI1中心，同时跟踪绑定到集线器的单个EWS LCD分子(图5E). SPT显示了EWS LCD的平均RTEWS/FLI1集线器为16秒，这表明LCD-LCD交互高度动态(图5F). 正如所料，突变体EWS（YS）LCD在EWS/FLI1集线器上的RT（~7秒）明显较短，与它减少了与EWS LCD的交互。

EWS LCD-LCD相互作用对转录和转化至关重要EWS/FLI1的功能

最后，我们测试了LCD-LCD交互是否影响EWS/FLI1功能。我们发现，尽管EWS/FLI1在荧光素酶分析中的GGAA微卫星，突变EWS（YS）/FLI1和FLI1 DBD不是(图5G). 我们进一步设计了EWS/FLI1敲除A673线稳定表达EWS/FLI或EWS（YS）/FLI1并执行逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测GGAA微卫星相关EWS/FLI1靶基因的表达水平。作为预期，我们发现EWS/FLI1的表达，而不是EWS（YS）/FLI1的表达挽救了基因敲除系中的基因表达缺陷，表明EWS LCD-LCD交易激活需要交互(图。5小时和图。S10安). 此外，敲除株系稳定表达EWS/FLI1，但不表达EWS（YS）/FLI1在软琼脂样WT A673细胞中形成菌落(图S10B). 这表明EWS致癌转化需要LCD-LCD相互作用。与一起使用先前发表的间充质干细胞RT-qPCR和RNA测序数据显示EWS LCD在诱导GGAA表达中的重要作用微卫星相关基因(43)，我们的结果表明，EWS LCD依赖中心的形成对于EWS/FLI1激活这些靶基因的转录并驱动致癌基因尤因肉瘤的表达程序。

讨论

DNA结合因子是真核基因表达的关键调节因子。早期对TF的研究揭示了其结构良好的DBD并确定了其功能转录所需的关键激活域（AD）。后来它变成了很明显，许多反式激活序列包含内在无序液晶，但它们如何调节交易激活仍不清楚。尽管液晶显示器及其一般的非结构化性质，AD必须与特定的结合伴侣激活转录。然而，如果不是这样的话，这也是一个挑战无法直接测量AD对选择性LCD介导的目标识别活泼地。转录控制机制的另外两个关键方面也仍然存在基本上是未知的：驱动蛋白质-蛋白质交易的性质是什么基因激活，以及这些关键的相互作用在生活中的稳定性或动态性细胞？

我们通过使用单分子成像来解决这些问题可视化活细胞中的LCD-LCD相互作用。我们的研究结果表明，TF-TF相互作用非常短暂，RTs为5到20秒，很少超过1min.这些研究使我们提出，交易激活域的功能是形成高TF浓度的短暂局部区域或“枢纽”（有时也称为集群）通过动态、多价和特定于序列的LCD-LCD交互。未来的一项关键努力将是解锁选择性LCD-LCD相互作用的生化和结构基础。这样的选择性对于实现复杂的组合逻辑转录调控。

活细胞单分子成像的最新进展不仅打开了体内转录研究的新前沿有机会更深入地了解LCD的性质和行为及其倾向于基本上保持固有无序肽序列。由现场部署TF-LCD相互作用的高分辨率单分子成像细胞，我们的研究为开创性的体外研究提供了强有力的补充提供了LCD交互的第一条线索(10). 重要的是，如果可以比较水凝胶和细胞内LCD集线器的形成，FET-LCD功能的许多方面体外未发现的细胞在活细胞中得到证实。例如LCD对突变、己二醇破坏以及与RNA Pol II相互作用的影响在体内观察到的结果通常与在体外试验的基础。此外，单分子活细胞成像显示LCD驱动交互的几个新方面。最值得注意的是快速的动态LCD相互作用形成瞬态局部时的序列特异性推动交易激活的高集中中心(图6). 我们还对依赖LCD的中心的形成感兴趣与同源基因组DNA无关的核质。这些LCD相互作用驱动的点，显示与RNA Pol II相互作用的能力，对1,6-HD的敏感性和快速动态（恢复时间为7到10秒）可能提供在未来的研究中有机会进一步探索治理机制LCD-LCD介导的枢纽形成和交易激活。

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图6。

体内功能性LCD-LCD相互作用模型：从枢纽到阶段分离。

(A类)动态和序列特异性LCD-LCD相互作用驱动活细胞中的轮毂形成。(B)依赖LCD在广泛的TF浓度范围内形成的枢纽中发生交易激活。在内源性浓度下，TF-LCD在本地形成交易激活中心基因组位点没有明显的相分离。TF LCD上过度表达，在合成TF结合位点观察到相分离数组。

为了分析活细胞中LCD-LCD相互作用的行为，我们利用各种成像平台的优势，并开发了两种不同的体内成像平台基于细胞的分析：一种涉及大型合成TF结合位点（LacO）阵列和另一种靶向人类内源性GGAA微卫星调控元件基因组。当结合使用时，这两种分析提供了强大的互补性用于探测实时细胞中TF-LCD交互特性的平台上下文。高度重复的LacO结合位点可以作为有用的基于细胞的能够在体内形成局部高浓度集线器核的检测系统通过LacO-LacI介导的结合感兴趣的蛋白质结构域或LCD。这些阵列可以通过高信噪比的荧光成像容易地检测到并允许灵活地探测LCD的各种交互特性，同时为水凝胶等各种体外检测提供了一种方便的替代方法聚合和液滴形成用于研究凝胶化和相分离内在无序蛋白质，两个过程可能与每个过程耦合其他在某些生理环境下(44).

我们的研究并不是为了解决LCD驱动的相分离隔间，但在某些过度表达条件下我们检测到似乎是液-液相分离的东西（即球形以及折射率的局部变化）。虽然我们可以检测到明显的液-液相分离和LCD的过度表达，我们没有获得内源性形成的TF枢纽（即EWS/FLI1）相分离的证据表达水平。然而，TF LCD中心的交易激活在内源性在没有可检测的相分离的情况下，天然染色体位点的TF水平。考虑到LCD-LCD相互作用的瞬态和我们对TF的直接测量细胞核和中枢内的浓度，我们推测LCD依赖在广泛的TF浓度范围内形成的枢纽中可能发生交易激活（100 nM至100 mM）和时间尺度-从非常简短的特定和非特异性LCD-LCD和TF-DNA结合事件（0.1至1秒）由特定的多价交互驱动的稳定中心（分钟）。两者都是枢纽内液晶显示器的组成和多样性及其相互作用的特异性可以影响其操作浓度范围和相分离和/或聚合物形成。关于快速绑定的新见解TF-LCD的动力学和功能重要性（即依赖LCD的致癌性EWS/FLI1）的潜力表明，了解这些机制也可能有助于我们有能力制定策略，在以下背景下调节基因表达疾病。考虑到TF显示的瞬态相互作用以及疾病中的基因失调（即尤因肉瘤中的EWS/FLI1），我们的这些发现为开发用于筛查的单分子成像平台提供了潜力靶向基因调控途径的药物。特别是，我们认为-高通量筛选基因表达抑制剂或激活剂高分辨率单细胞和单分子成像可以为在体外和基于细胞的小分子筛。使用新型化学物质，天然产品或肽模拟库，甚至可能最终以液晶显示器是调节蛋白质相互作用和中枢的关键驱动因素与基因激活和潜在的许多其他生物分子有关的形成疾病中的相互作用。最后，尽管我们只检查了一小部分TF-LCD的子集，我们已经揭示了关于快速驱动LCD-LCD交互的动力学和轮毂机制可能适用于其他调节蛋白类和生物分子相互作用在多种情况下发生单元类型的。

材料和方法总结

通过RT-qPCR测定LacO阵列中LacO重复序列的数量。未来作战系统并对荧光标记的TF进行荧光强度测量在活细胞中。通过将结果与纯化荧光标记、中心TF核浓度及其拷贝数确定。FRAP和SPT用于测量各种TF及其靶基因座，并研究LCD-LCD相互作用影响TF-DNA相互作用动力学。SPT也用于测定LCD-LCD交互动力学。使用双色共焦荧光成像检查不同类别LCD之间以及LCD集线器和RNA Pol之间的相互作用二、。

CRISPR-Cas9介导的基因组编辑用于标记内源性在A673细胞中使用HaloTag或敲除蛋白质的EWS/FLI1，允许EWS/FLI1的荧光成像或功能研究。荧光素酶和软琼脂菌落形成分析用于验证EWS/FLI1-Halo的功能。格子用光片显微镜观察内源性EWS/FLI1-光晕。同时共聚焦成像EWS/FLI1-Halo和3D DNA FISH用于检查内源性EWS/FLI1中心之间的空间关系和GGAA微卫星。荧光素酶、RT-qPCR和软琼脂集落形成分析用于检测Y-to-S突变对反式激活和EWS/FLI1的转换函数。所有材料和方法在补充材料.

补充材料

致谢

脚注

参考和注释