苔藓纤维是小脑皮层最丰富的输入，在复杂的躯体结构中携带多种形式的感觉运动和周围信息(Shambes等人，1978年;奥斯卡森，1979年;鲍尔和伍尔斯顿，1983年;Brodal和Bjaalie，1997年). 它们刺激颗粒细胞，颗粒细胞的轴突上升到分子层并分叉一次，形成平行的纤维（见图。). 平行纤维延伸5 mm，形成一到两个接触的同时兴奋性突触（大鼠的值：哈维和纳珀，1988年,1991;Napper and Harvey，1988年a,b条)具有数百个浦肯野细胞的平面树突树，平行纤维与之正交。每个浦肯野细胞接收大约170000个并行光纤输入。这些突触具有谷氨酸能，传递可能涉及突触后AMPA(Perkel等人，1990年;Llano等人，1991年)和代谢型谷氨酸受体（mGluR）(Batchelor等人，1994年;Takechi等人，1998年)受体，但令人惊讶的是，功能性NMDA受体只存在于突触的突触前一侧(Casado等人，2000年,2002). 据报道，这些突触的释放概率特别低（<5%；Dittman等人，2000年). 尽管有大量关于涉及这些突触的复合反应的信息，但了解小脑功能的某些方面需要对单一反应进行详细研究。特别是，学习可以改变哪些突触属性的问题很难用复合反应来研究，因为重要的是个体与平均行为的偏差。
切片方向。该图显示了本研究中记录的细胞对的典型方向。体细胞位于表面附近，树突下降到伪横向切片的浦肯野细胞被全细胞钳制。连接束内的颗粒细胞以松散细胞附着模式记录。切片的厚度（450μm）超过了分子层和颗粒细胞层的组合深度（220+180μm；哈维和纳珀，1988年)确保平行光纤(PF公司)记录的颗粒细胞之间(总承包商)和浦肯野细胞(个人计算机)没有在切片的底面切割。
平行纤维在浦肯野细胞上的分化被认为是小脑协调多个身体部位的基础(Thach等人，1992年). 平行纤维和浦肯野细胞的显著排列意味着沿着平行纤维“束”的许多浦肯野电池将共享其输入的大部分。这一事实引发了基于平行纤维束激活的小脑功能理论(布雷滕贝格和阿特伍德，1958年;埃克尔斯，1973年). 然而，尽管浦肯野细胞在束流中的活动很容易被证明在体外(Vranesic等人，1994年),体内事实证明，观察结果更具争议性(鲍尔和伍尔斯顿，1983年;Garwicz和Andersson，1992年;科恩和亚罗姆，1998年)，和相隔约100μm以上的浦肯野细胞没有显示出共同输入所预期的活性相关性(贝尔和格林，1969年;埃布纳和布洛德尔，1981年). 此外，浦肯野细胞有明确的感受野和感受方式(鲍尔和伍尔斯顿，1983年;Fushiki和Barmack，1997年;Ekerot和Jorntell，2001年)这可能反映了下层苔藓纤维的起源(Shambes等人，1978年)而不是平行光纤可能产生的漫反射、广义响应。这些观察结果的通常解释是颗粒细胞“上升轴突”(利纳斯，1982年)在Purkinje细胞树突平面上运行，可能在Purkingje细胞上形成强大的多接触突触连接。然而，这些突触没有记录。由于这些原因，我们开始在单突触水平上描述颗粒细胞→浦肯野细胞的连接。
这项工作已初步呈现(Isope和Barbour，2000年,2001).
材料和方法
切片准备。采用以下程序将对脆弱的成人小脑组织的缺氧、缺血性、机械性和兴奋性毒性损伤降至最低。它们符合国家和国家卫生研究院关于动物实验的指导方针。成年雄性Wistar大鼠（2–3个月龄，250–450 gm）用氯胺酮/甲苯噻嗪（分别为75和10 mg/kg）腹腔内麻醉。如果需要确保达到手术麻醉平面，则给予额外（一半）剂量（完全消除对伤害性刺激的足底撤回反射）。通常也通过腹腔注射佐剂硫酸阿托品（0.2 mg/kg）。放置热电偶以监测鼓室温度。快速放置气管导管，在不使用肌松药的情况下对大鼠进行通气（14 ml呼吸机冲程×72次呼吸/min）。呼气末正压（3 cm H2O） 在打开胸腔准备心脏灌注时使用。需要保持一定的警惕性，以确保在胸部切除术期间气道保持专利。用两个冷的、起泡的（95%O2/5%一氧化碳2)制定了解决方案。所含第一种溶液（150 ml）（单位：m米)：115 NaCl，26 NaHCO三，3氯化钾，0.8氯化钙2，8氯化镁2，1.25 NaH2人事军官4，10d日-葡萄糖、1利多卡因-HCl、1氯胺酮-HCl。第二种溶液（100ml）是相同的，不同之处在于蔗糖（230m米)更换NaCl。灌注开始后，立即夹紧腹主动脉和/或下腔静脉，并用冰块塞住大鼠的头部。灌注期间，大鼠的鼓室温度将降至5-10°C。灌流后，将大鼠斩首，头部在冰上冷冻，同时解剖整个小脑。小心避免切割小脑或使其变形。将小脑冷却并在含有（单位：m）的溶液中切片米)：30氰尿酸，230蔗糖，26胆碱-HCO三，0.8氯化钙2，8氯化镁2，10d日-葡萄糖，30 NaOH，1.25 NaH2人事军官4，1利多卡因，1氯胺酮，0.05d日-APV、0.01加巴静、0.1苦毒毒素、0.005半硫酸士的宁。
然后制备与横向平面成20°的450μm切片（该角度使切片不对称，便于正确定向进行记录），并保存在起泡碳酸氢盐缓冲溶液（BBS）中，其中利多卡因-HCl（1 m米)，氯胺酮-HCl（1 m米)和氰尿酸钠（2 m米)已添加。请注意，此解决方案应尽量减少任何活动依赖性突触修改。切片后，将切片保持在32°C下0.5–1小时，然后冷却至室温。药物来自Sigma-Aldrich（法国圣昆廷-法拉维）或Tocris-Cookson（英国布里斯托尔）。
记录。为了便于记录，将切片放在腔室底部上方1.5 mm处，尼龙网覆盖并粘在两个同心不锈钢环上，以允许溶液在切片的上方和下方流动。所含实验沐浴液（单位：m米)：125氯化钠、3氯化钾、26氯化钠三，1.25 NaH2人事军官4，2氯化钙2，2氯化镁2，10d日-葡萄糖、0.1苦曲霉毒素和（有时）0.002加巴静。切片在32°C下过量（8 ml/min）；记录仅在至少30分钟后开始，以确保清洗储存溶液中的利多卡因和氰尿酸盐（数据未显示）。通过使用红光（670±40 nm）和视频对比度增强（滨松C2400-07相机和控制单元；滨松光电法国公司，法国马西），使用蔡司Axioskop[40×，0.75数值孔径（NA）水浸物镜和0.63 NA聚光镜对细胞进行可视化。通过使用Optopatch放大器（Cairn Research，Faversham，UK）和最佳串联电阻补偿（通常为4-8 MΩ的50-70%）或电容中和（视情况而定），获得电压灯和电流灯模式下的全电池插线灯记录。所含移液管溶液（单位：m米)：用KOH在300mOsm下将150 K葡萄糖酸盐、4 NaCl、10 HEPES、10 Mg ATP和13生物素pH调节至7.3。针对10 mV的结电位对记录进行了校正。
根据巴伯和伊索普（2000）稍加修改，刺激电压有时会被记录下来，并用于衡量激发失败和改善刺激-伪影减法。以1kHz过滤浦肯野细胞中的突触电流，以10kHz过滤其他信号；采样频率为20–50 kHz。尽管切片过程中采取了预防措施，切片质量也得到了显著改善（可以从成人小脑切片中的中间神经元和高尔基细胞中进行记录；在松散细胞贴附模式下测试的颗粒细胞中，90%以上是可兴奋的），但浦肯野细胞中的保持电流通常会随着时间的推移而增加。我们接受了−70 mV的内向电流不超过900 pA的记录，因为在泄漏发生期间对化合物EPSC的记录表明，它们的振幅不受影响。在泄漏从300±60 pA增加到880±30 pA的五个电池中，EPSC振幅增加1±17%，电荷转移减少12±6%。
对两个不同区域的颗粒细胞进行了测试。它们要么紧邻记录的浦肯野细胞，要么距离浦肯野胞体约300–500μm（沿平行纤维方向测量）。局部颗粒细胞最有可能通过其上升轴突与浦肯野细胞形成连接；下面将描述它们连接的属性。与给定Purkinje细胞接触的绝大多数颗粒细胞都是远端颗粒细胞，它们只能进行平行的纤维连接。颗粒细胞束中包含受刺激颗粒细胞，平行纤维与浦肯野细胞相交（见图。)之前通过细胞外刺激勾画出连接的束流，从而确保了这一点。在该光束的中间（±50μm）对颗粒细胞进行刺激。
在选定的区域内，随机测试颗粒细胞。只分析了动作电位能够被清楚区分和可靠激发的颗粒细胞。只保留突触后反应和突触前动作电位具有相同阈值的连接。刺激被调整为只是超阈值的，以便将刺激附近其他颗粒细胞或轴突的概率降至最低。在计算平均EPSCs时，我们将颗粒细胞激发成功的所有扫描平均起来。
组织学。切片固定在3.7%甲醛/PBS中，pH 6.8。约5分钟后，pH值碱化(Berod等人，1981年)使用4m使pH接近9米氢氧化钠。切片在该固定剂中于4°C下至少保存一夜。在0.4%Triton X-100/PBS基溶液中进行生物细胞素的揭示。内源过氧化物酶活性熄灭后（10%甲醇；1%氢2哦2)和淬火残余固定剂（50 m米全日空航空公司4Cl），用亲和素-过氧化物酶复合物（Vectastain ABC试剂盒；用0.5米NaCl-PBS），与2 mg/ml二氨基联苯胺预培养（在Tris缓冲液中），并与0.002%H反应2哦2.切片在H中通过洗涤进行澄清2O、 50%小时2O/50%DMSO、DMSO，然后在75%甘油/25%DMSO中放置至少1天，并在其中进行安装和观察；安装介质最好与浸油物镜配合使用。
在重建Purkinje细胞树突状树平面的实验中，肿胀（15±23%；n个固定和治疗期间，通过比较活切片和治疗切片中标志点之间的距离，校正了=30）个切片。将距离校正为未固定的组织。
分析。使用pClamp软件（版本6或8）采集数据。分析是在IGOR绘图和分析环境（Wavemetrics，Lake Oswego，OR）中使用自制的宏进行的。平均值用SD报告。在一些情况下，我们应用了下面描述的非参数“bootstrap”方法Efron和Tibshirani（1993）用于估计复杂参数的SE，特别是释放概率。（在他们的术语中，SE是样本参数的SD；当然，最广为人知的是样本平均值的SD。）简单地说，从最初分析的记录道中随机选择记录道，并进行替换，直到累积到相同的数量。然后简单地将原始分析重新应用于该复制数据集，并生成所需参数的“引导复制”。重复该程序50次可产生足够的重复，以估计参数重复的SE。尽管重复使用样本数据具有明显的循环性，但bootstrap方法的理论基础表明，所获得的SE与底层总体的SE非常接近。
结果
并行光纤连接
我们在从成年大鼠制备的伪横断切片中记录了32°C时单一颗粒细胞→浦肯野细胞的突触反应（图。). 通过体细胞贴片吸管将Purkinje细胞全细胞固定到−70 mV，并记录刺激颗粒细胞诱导的EPSC。结合松散细胞附着刺激和记录(巴伯和伊索普，2000年)应用于颗粒细胞。常规进行配对或三次脉冲刺激（间隔40毫秒）。
平行纤维突触连接的样本记录（图。A、 B类)显示了颗粒细胞动作电位，记录为容量电流，以及浦肯野细胞中的几个EPSC。共筛选出477个在该距离范围内的束上可兴奋颗粒细胞。其中，34人产生了可检测的反应。这些平行纤维突触反应的平均振幅为8.4±7.1 pA（图。C类). 平均振幅的分布偏向较大的值。
单一平行光纤→Purkinje细胞连接。A类，颗粒细胞动作电位以松散细胞贴附模式诱发和记录。刺激时间由三角形。已减去刺激伪影（请参见材料和方法）。B，Purkinje细胞中记录了几个EPSC(细线)加上平均EPSC(粗线条;n个= 116). 请注意较慢的时基。C类，所有检测到的EPSC的平均振幅柱状图(n个=34/477）粒细胞300–500μm，来自记录的Purkinje细胞。结果中报告了分布参数。
为了加快颗粒细胞的筛选，实验者确定了“通过眼睛”识别连接的颗粒细胞，并在有疑问的情况下进行离线平均。在这些条件下，检测到的连接的平均振幅通常大于2–3 pA。虽然可以提出异议，认为这种方法会受到人为错误的影响，但引入的可能误差似乎很小，因为50–100次被分类为不可检测的连接扫掠的离线平均值(n个＝13）没有解除任何进一步连接的掩码。对于几乎所有没有明显反应的记录，我们通过增加刺激强度来激发一系列动作电位。这最终会诱导颗粒细胞以几百赫兹的频率发出一系列动作电位（可能是通过引起部分膜破裂）。在少数情况下(n个=400+个明显不相连的颗粒细胞中的5个）该序列诱导了突触后电流。不幸的是，可能是由于颗粒细胞受损，很难重复应用这种刺激。我们不确定产生这些反应的机制。
为了估计给定大小的EPSC产生的EPSP的大小，我们对颗粒细胞层细胞外刺激的复合反应进行了连续的电流灯和电压灯记录（图。A类). 当用双指数波形拟合时，化合物EPSC的平均动力学值为τ上升=1.2±0.7毫秒和τ衰退=13.9±2.3毫秒(n个= 5). EPSP的相应值为τ上升=2.6±1.2毫秒和τ衰退=63±29毫秒。使用对不同刺激强度的反应来构建校准曲线，实际上是一个简单的比例关系，将EPSC峰值和EPSP振幅关联起来（图。B). 这使我们能够根据每个连接的EPSC估计突触重量，我们将其定义为峰值体细胞去极化。使用图的校准，我们推断，同时激活大约150个平均大小的平行纤维输入将从−70 mV激发Purkinje细胞（Purkinja细胞的阈值约为−60 mV，在矢状切片中测量，以保留更长的轴突长度）。这只占Purkinje单元并行光纤输入总数的一小部分（～0.1%）。
估计突触重量。A类、由颗粒细胞层相同细胞外刺激诱发的阈下复合EPSCs和EPSP。这两种突触反应平均为20次扫描。二者均采用双指数函数拟合（叠加）。对于所示的EPSP，τ在=0.93毫秒和τ远离的=62毫秒；对于EPSC，τ在=0.72毫秒和τ远离的=15毫秒。B，数据类似于A类（10个细胞中28次测定）绘制图，以获得从EPSC到EPSP峰值振幅的近似转换系数。限制通过原点的直线斜率为8.3μV/pA。
我们使用双指数拟合来量化整体EPSC动力学，一个用于上升阶段，另一个用于下降阶段。这些拟合被证明受到噪声的很大影响，并且对导出的时间常数的SE的自举估计表明它们相当不可靠。因此，我们将平均振幅低于5 pA的所有事件排除在动力学分析之外。对于这些较大的平行光纤EPSC，平均时间常数为τ在=1.0±0.7毫秒和τ远离的=11.1±5.7毫秒(n个= 24). 涉及这些动力学参数的曲线图将在下文中给出，以获取更大的数据集。
一些整体平行光纤EPSC似乎显示双指数衰减（数据未显示）。因为每个连接通常只涉及一个突触接触（或树突树上同一位置的两个），所以不同过滤EPSC的混合可能不是这个时间过程的解释。一种可能的解释是，这种突触非常近，第一个衰减指数表示电荷重新分配到树突和移液管中，第二个衰减指数反映电荷重新分布到更远端树突的恢复。
一般来说，虽然颗粒细胞兴奋的识别是安全的，但刺激伪影的减除并不总是足够好，无法精确对齐动作电位信号的峰值。因此，平均值包括动作电位计时中抖动的影响。这将导致EPSC上升阶段有所延长。在大多数情况下，EPSC的衰减相位太慢，以至于其（或振幅测量）不会受到动作电位时间抖动的显著影响。
释放概率
根据平行纤维→浦肯野细胞突触的成对脉冲易化分析，据报道，该突触释放部位的平均释放概率特别低(Dittman等人，2000年); 给出了5%的上限。对我们的成对记录的检查表明，总体释放概率相当高，与文献值明显矛盾，因此我们着手量化该参数。
我们的总体方法是比较振幅直方图，其中包含解放失败和成功的混合物，以及与响应失败具有相同分布的噪声测量值。为了最大限度地提高响应幅度测量的准确性，我们使用了基于模板的方法。每个连接的模板基于相应平均EPSC的双指数拟合。为了最小化自发EPSC测量的干扰，我们使用了一个相对较短的模板，该模板覆盖了EPSC的上升阶段和峰值，但仅覆盖了其衰减的一部分。测量阶段只需调整模板的振幅以适应每次扫描。模板拟合的样本轨迹如图所示A类模拟结果（未显示数据）表明，测量值对EPSC开始时的真实抖动相当不敏感（SD<0.5 msec）。噪声测量是通过对不包含诱发反应的部分记录道应用完全相同的程序来获得的。
单个EPSC的振幅测量方法。A类，使用最小二乘准则将平均EPSC的双指数拟合的截断版本缩放到每个单独的EPSC，从而生成每个扫描的自动振幅估计。基线和缩放模板叠加在EPSC上。B，振幅分布(浅色阴影直方图)对于相同的连接，根据中的振幅测量构建A类。对颗粒细胞未受刺激（或未激活）的轨迹段进行相同数量的相同测量，以估计传输故障的预期振幅分布。此噪声分布按比例缩放(重开放直方图)拟合振幅大于零（向右）的响应分布(阴影范围). 标度提供了失效概率的估计值，在这种情况下为0.36。
一旦获得了EPSC振幅和噪声直方图，就可以通过对噪声分布的一部分进行缩放（使用标准最小二乘法）来估计故障概率，以适应EPSC振幅分布的相应范围。我们选择将噪声和EPSC振幅分布缩放为大于零的值（按照惯例，EPSC具有负振幅）。图B显示了与图中相同连接的EPSC振幅A类以及噪声分布的缩放版本。
图A类显示了失效概率估计值相对于平均振幅的散点图。虽然最大连接的估计失效概率很低，但较小连接的失效概率估计值较高的趋势很明显。然而，我们知道，测量方法总是倾向于高估失效概率（因为噪声可能会导致小成功获得大于零的振幅），而对于小振幅，这个问题将更加严重。一个简单的模型（图。B)可以用来说明我们估计释放概率的方法的预期行为。我们假设EPSC振幅和噪声为高斯，并任意设置成功释放振幅的SD为其平均值的40%。这些假设不太可能准确，但很难获得更详细的信息。我们将噪声的SD设置为5.8 pA。噪声分布的平均SD为7.3 pA，但它们稍微不对称。因为直方图拟合使用了噪声分布的右侧，所以我们将每个噪声分布的一半反映为零，然后重新计算平均SD（即5.8 pA）。对于给定的失效概率，我们可以计算出用我们的方法估计的失效比例。图中绘制了预期估计值作为平均振幅的函数A类作为不同潜在失效比例的曲线族。测试了成功率变异系数的不同值（图。，参见图例），显示模型对此参数的低灵敏度。
平行纤维突触的失效概率估计分布。A类，将失效概率估计值绘制为平均振幅及其自举SE估计值的函数。平滑的曲线(固体线)是通过使用中所示的模型获得的关系B每个理论关系都是针对一个固定的潜在失效概率（标记）。B，中用于计算理论曲线的模型图解A类高斯噪声分布（SD为5.8 pA；噪音，显示为实线)卷积为高斯成功振幅分布[概率为0.9，振幅为11.11 pA，SD为4.44 pA；因此，变异系数（CV）为0.4]和故障（概率为0.1，振幅为0）。生成的分布组件被标记成功和失败(虚线曲线); 他们的总和是响应概率密度函数(实线)模拟实验确定的振幅分布。图中还显示了噪声分布的最佳缩放版本(估计的故障，由显示虚线). 它高估了真实失效概率的系数～2。成功CV的变化对估计振幅的整体形状几乎没有影响P（P）获得的关系。这个星罗棋布的和虚线曲线在里面A类CV分别为0.15和0.5。
显示真实故障概率估计值的曲线P（P）0.1的（失败）对数据给出了非常好的拟合。很明显，失效概率的窄范围（～0.1）可以解释我们的所有数据，因此没有证据表明存在低释放概率连接。
配对脉冲促进
在测试的40毫秒间隔内，并行光纤连接显示出适度的配对脉冲促进作用。使用类似于的方法Kim和Alger（2001）为了计算连接的平均成对脉冲比率，即将所有连接的平均振幅A1相加，然后除以所有平均振幅A2的总和，我们得到了1.36(n个=34个连接）。在另一系列录音中，我们使用了三重刺激。以相同方式计算的A3/A2比率为1.07(n个= 41).
我们检测了分子层和颗粒细胞层（间隔40毫秒）对细胞外刺激的复合反应的配对脉冲促进作用。令人惊讶的是，尽管颗粒细胞层的刺激产生了类似的促进作用（A2/A1，1.37±0.14；A3/A2，1.08±0.12；n个=8）与上文报道的单一连接相比，分子层中的刺激产生了更大的促进作用（A2/A1，1.70±0.19；A3/A2，1.30±0.09；n个= 8;对A1/A2之差<0.01；曼·惠特尼U型测试）。单一连接的配对脉冲比率与颗粒细胞层刺激引起的复合反应的相似性强烈表明，我们的样本单一连接具有代表性。
未检测到的连接
当选择颗粒细胞进行筛选时，我们通过先前的细胞外刺激确保了它们在连接记录的Purkinje细胞的束内的位置。在这种情况下，大多数平行纤维预计会与Purkinje细胞的树突树相交。我们通过一系列成对的全细胞记录证实了这一点，其中颗粒细胞和浦肯野细胞都被标记（图。; 在这些全细胞对中未检测到反应）。细胞体之间的间距为50-100μm，而粒细胞被实验者简单地猜测为在线。即使如此，在20对成功标记的对中，有17对平行纤维通过Purkinje细胞树突树的周长；也就是说，在与树枝晶平面的交叉点，平行纤维的左侧、右侧、上方和下方都有树枝晶。因为树枝晶树状结构中的平行纤维很难区分（因为树枝晶的阴影），这些标准通常适用于树突树两侧的平行纤维。
平行纤维和Purkinje细胞树突树典型交叉点的形态。图示为颗粒细胞(GC公司)和Purkinje细胞(个人计算机)在全细胞记录过程中，用生物细胞素填充一对（没有可检测的连接），然后进行标记。A类，躯体层面。Purkinje细胞树突树的平面向下延伸到左下角到右上角平面。B，靠近十字路口。平行光纤(PF公司)在它穿过树突树靠近其中部后不久就可以看到。平行光纤是两幅图像的增强蒙太奇，垂直间距为10μm。只有上升轴突的一小部分(AA公司)虽然连续调整焦距时可以很容易地跟踪，但仍会在图像中捕获。比例尺，50μm。
因此，我们确信，我们筛选的大多数颗粒细胞的平行纤维会与浦肯野细胞树突树相交。纳珀和哈维的仔细解剖工作(哈维和纳珀，1988年,1991;Napper and Harvey，1988年a,b条)提供了对这种情况下形成突触的概率的估计：54%。我们的结果显然与这一预测相矛盾：在477个（7%）经过筛选的颗粒细胞中，只有34个能检测到突触反应。我们认为有三个主要假设可以解释这种差异。第一，平行纤维中的动作电位往往无法到达远处的突触；第二，许多连接具有极低的释放概率，例如通过使用上述刺激协议仍然无法检测到；第三是一些突触很少或没有功能性突触后AMPA受体。我们在本节中测试前两种可能性。
平行光纤中动作电位不能可靠传播的可能性经常被提出。繁殖障碍的一个最受欢迎的部位是“T”，在T处，上升颗粒细胞轴突分叉为平行纤维的两半。在我们的实验中还需要解决的一个更普通的问题是，在切片表面附近切割轴突的颗粒细胞的比例。通过将松散的细胞附着记录与分子层暴露表面平行纤维的反色刺激相结合，我们能够排除这两种机制中任何一种的重要贡献。通常有可能（测试了14个颗粒细胞中的11个）证明平行纤维支持逆行传导的能力，此外，还可以证实逆行动作电位与体部诱发的顺行动作电位之间的碰撞。这表明，在我们的制备过程中，很少有颗粒细胞轴突被切断，大多数可以沿其长度传导逆行动作电位，并至少沿其部分长度传导正向动作电位。
通过对该方法的扩展，我们能够证明正向动作电位在分子层中非常接近刺激部位进行。如图所示通过增加刺激部位和颗粒细胞之间的间隔，我们记录了另外五个颗粒细胞，它们的逆行传导时间很长，从4到8毫秒不等，以便能够清楚地观察传导过程。所有这些细胞对顺行和逆行刺激的不应期约为1毫秒（图例中解释了松散细胞连接模式下记录的逆行动作电位的略微令人惊讶的形式）。然后，我们进行了一个碰撞实验，以确定顺行性刺激后多久，逆行动作电位仍会与顺行性动作电位发生碰撞。在每个单元格中，行为如图所示观察到；在逆行刺激成功之前，必须延迟一个传导时间加上一个不应期。我们的结论是，正向动作电位通常能够传播到暴露分子层平行纤维的切割端附近，超出我们预期记录的突触位置。
动作电位沿平行光纤的传播不会受到影响。A类在分子层刺激过程中，颗粒细胞胞体的松散细胞附着记录。该细胞中刺激与逆行动作电位（主要是传导）到达之间的潜伏期为5.3毫秒(顶部跟踪，来自左三角形到星号标记逆行作用潜力）。成对刺激显示不应期为～1毫秒。两个刺激之间的间隔为0.9毫秒(顶部跟踪，一个动作电位）和1.0毫秒(底部轨迹，两个动作电位）。B成对脉冲躯体刺激同样显示出0.9毫秒的正向不应期。两个刺激之间的间隔为0.8毫秒(顶部跟踪，一个动作电位）和0.9毫秒(底部轨迹，两个动作电位）。C类为了避免与正向动作电位（体细胞刺激）碰撞而导致的湮灭，必须在>6.3毫秒后引发反向动作电位（分子层刺激）。面板中两个刺激之间的间隔为6.3毫秒(顶部跟踪，无逆行动作电位）和6.4毫秒(底部轨迹，存在抗变色作用电位）。这一间隔表明，正向动作电位传导至逆行刺激部位，超出了Purkinje细胞的记录点。松散细胞附着动作电位信号的惊人形式（例如A类)对应于细胞内的动作电位，在上升期出现拐点。这是因为松散的细胞附着信号本质上是一种电容电流，与膜电位的一阶导数成正比(巴伯和伊索普，2000年); 因此，它对动作电位形状的变化非常敏感。这种拐点可能反映了轴突逆行动作电位的到达和体细胞侵袭之间的延迟。在体细胞中诱发的大多数正向动作电位部分被刺激伪影所掩盖（这些伪影没有被减去）。根据已知的励磁故障确定所有动作电位。
如果连接的释放概率很低(Dittman等人，2000年;Gasparini等人，2000年)，我们的刺激可能不允许在配对记录中检测到它们，并且这种联系可能没有促成复合反应。因此，我们通过平均对高频动作电位序列的反应，对这种极低概率连接的存在进行了额外的测试。这是通过使用颗粒细胞的全细胞记录来实现的，因为在松散细胞附着模式下所需的刺激通常会快速且不可逆地损坏颗粒细胞。记录了14个颗粒细胞→浦肯野细胞对，其解剖排列与图中所示相似（除了躯体更近）。每对受试者平均至少有100列150–250 Hz持续70毫秒的动作电位。我们平均了动作电位，没有对齐，在每个序列开始时与动作电位对齐，在动作电位～25毫秒时与序列对齐（大约在第五个动作电位处），或与最后一个动作电位对齐。在11个细胞中检测不到任何反应（图。A类). 14对中的两对明显相连（图。B)，在第一个动作电位（图。C类). 因此，这些连接似乎是上面已经分析过的那种典型的小型连接，尽管它们可能已经接近我们的标准协议的检测极限。不幸的是，在剩下的单元格中，声音有点大，我们无法确定是否有小的响应。然而，根据列车中的任何动作电位校准的最大平均响应幅度不大于3 pA。这些数据与由于释放概率极低而未检测到响应的大部分强连接相矛盾。
全细胞配对记录显示，没有强并行光纤连接，释放概率很低。在每个面板中顶部痕迹代表平均值(黑线)颗粒细胞中>100次高频动作电位爆发(灰色线条). 这个底部痕迹显示Purkinje细胞中记录的平均反应。A类，一对未显示可检测到的反应。平均值是在对列车第五动作电位进行校准后得出的(n个= 191).B，检测到响应的另一对。在面板中，对列车的第一动作电位进行校准后计算平均值(n个= 137).A类和B共享校准。C类，平均值的详细信息（扩展时间和当前刻度）B表明明显的反应开始(箭头)可以在第一次动作电位后约2毫秒观察到（时间由虚线垂直线).
近端颗粒细胞
小脑生理学中一个长期存在的争议涉及颗粒细胞提升轴突的作用。平行纤维，因为它们与浦肯野细胞树突状树的平面正交，通常与每一个浦肯野神经元进行零、一或两次突触接触。对于垂直上升穿过分子层的颗粒细胞轴突的短节段，情况更为混乱。因为这些可以平行于Purkinje细胞树突状平面，所以它们可能与给定的Purkinje细胞进行多次接触。这种可能性导致许多研究人员认为，上升轴突是从颗粒细胞到浦肯野细胞的重要输入，甚至是占主导地位的输入。然而，尚未对平行纤维突触和上行轴突突触进行详细比较。
我们试图从颗粒细胞中记录上行轴突连接。因为我们没有识别这种细胞的方法先验的而且突触特性的任何差异似乎都是细微的，我们开发了一种方法，可以确定后部哪些颗粒细胞最有可能形成上升的轴突连接，并汇集了多项实验的结果。在一次实验中，我们将对筛选出的每个颗粒细胞拍摄一段视频。标记Purkinje细胞。在固定和处理切片后，通过绘制树突与每个树突的交点，重建Purkinje细胞树突树的平面z（z）-并计算这些线段的“最佳拟合平面”。通过比较视频静态图像和重建的Purkinje细胞，我们可以确定每个记录的颗粒细胞相对于Purkinje细胞的位置。然后我们计算了每个颗粒细胞到Purkinje细胞树突平面的正交距离。当Purkinje细胞树突树的重要部分位于不同的平面上时（偶有观察到双树突树），计算到最近树突平面的距离。通过这种方式，我们可以通过检查突触特性作为与树突平面距离的函数来汇集许多实验的结果。我们假设这个平面上的颗粒细胞最有可能形成上升轴突突触。
图A类显示了一个重建的实验。在表面平面上指示了10个筛选的颗粒细胞的位置。检测到突触连接的大多数突触似乎聚集在树突平面周围。汇集了许多Purkinje细胞的结果表明，这不是一个意外（图。B). 在树枝状平面中观察到检测连接概率的显著峰值，达到～50%。连接的概率随着与树突平面的距离而迅速下降，超过20μm时，与来自远处（300–500μm）颗粒细胞的平行纤维连接的概率没有显著差异。
局部颗粒细胞构成一种特权输入，但强大的上行轴突连接是罕见的。A类，两个图像平面(顶部、切片表面；底部，表面以下10μm），显示标记的Purkinje细胞。树状树的最佳拟合平面和图像平面的交点由虚线。连接的颗粒细胞的重建位置由实心圆和不相连的颗粒细胞交叉.比例尺，50μm。B，表观连接率（可检测反应的数量/测试的颗粒细胞总数）是颗粒细胞体与Purkinje细胞树突平面距离的函数。除第一个和最后一个外，每个箱子代表30个被测颗粒细胞。第一个(最左边的)bin包含15个颗粒细胞，最后一个（针对300-500μm的颗粒细胞）包含477个。Purkinje单元附近的视在连接概率与平行光纤的视在联系概率之间的差异的重要性通过以下公式表示：星号(**对< 10−5; *对< 0.05; 费希尔精确测试）。这个虚线水平线表示存在解剖定义的突触的预期概率（0.54）（见结果）。C类，Purkinje细胞树突平面35μm内颗粒细胞连接的平均振幅直方图(灯线、阴影条). 注意两个假定的上行轴突连接的大反应。分布参数平均值=12.4 pA和SD=15.7 pA(n个=第28页，共166页）。未进行重建但颗粒细胞靠近Purkinje细胞的一系列连接的类似直方图被叠加(粗线条，开放式酒吧). 在这个样本中也很少有大的反应。分布参数平均值=12.4 pA，标准差=14.1 pA(n个= 40).
提升轴突形成的突触连接被认为在许多方面不同于平行纤维突触。首先，它们通常被认为通过在Purkinje细胞上进行多个突触接触而形成相对强大的联系。图C类显示了位于树突平面35μm范围内的颗粒细胞的振幅分布。总的来说，近端和远端颗粒细胞连接的EPSC振幅分布非常相似。只有两个近端颗粒细胞的振幅明显大于平行纤维连接的振幅（基于我们的小样本）。然而，即使是这两个大的连接，也不超过最大的平行纤维连接的两倍，这两个连接可能来自于进行多次接触的上升轴突。当我们试图从树突平面或树突平面附近的颗粒细胞中进行记录时，也得到了类似的分布，但无法进行重建（图。C类). 这表明，即使是中等规模的连接也相当罕见。
根据电子显微镜重建，平行纤维突触和上升轴突突触之间还有另外两个差异(Gundappa-Sulur等人，1999年). 与平行纤维形成的突触小泡相比，上升轴突的变异包含更多的突触囊泡。因此，上行轴突连接可能具有较高的释放概率和较低的配对脉冲促进作用。另一个差异是，上升轴突接触的棘的母树突比平行纤维的父树突薄，这被解释为表明上升轴突突触优先在棘小枝的末端形成。这可能会导致EPSCs从更远端的提升轴突突触中得到更大的过滤。事实上Roth和Hausser（2001）这表明，EPSC动力学只有非常细微的差异，因为突触位置沿着刺状小枝变化，所以这一建议并没有产生可以用我们的电子记录进行测试的预测。
尽管我们无法确定形成上行轴突连接的颗粒细胞，但任何这样的细胞都可能是在浦肯野细胞树突平面附近促成高连接概率的细胞之一。与纯平行纤维突触相比，这群在上升轴突连接中“丰富”的颗粒细胞的突触特性如何？图图中显示了上升轴突和平行纤维之间的连接特性随与树突平面的距离而不同。如果排除这两个强连接，则其余近端颗粒细胞连接的振幅在树突平面上没有更大的趋势。估计释放概率和成对脉冲促进作用与树突平面距离的关系图显示出类似的未检测趋势（图。)平均值与更多远端颗粒细胞的值非常接近。因此，大多数近端颗粒细胞连接似乎无法与平行纤维的连接区分开来。请注意，单个成对脉冲比的广泛分布至少部分是由于较小连接的振幅测量的低信噪比所致。
近端连接的连接特性类似于平行光纤连接。所示为连接振幅图(A类)，估计失效概率(B)、和成对脉冲比(C类)作为与Purkinje细胞树突平面距离的函数。虚线表示并行光纤连接的平均值实线是最合适的线条。两个大振幅连接(开放的圆圈)从振幅的回归计算中排除。注意，平均值P（P）（失败）估计(B)由虚线用于图中所示的并行光纤连接A类.
颗粒细胞→Purkinje细胞连接动力学特性总结
图总结了我们记录的连接的动力学分析。平均EPSCs用双指数函数拟合。由于拟合对噪声级的敏感性，图仅包含EPSC振幅超过5 pA的连接的动力学参数。通过积分（外推）双指数拟合，我们估计了EPSC电荷转移。这可能是对突触电荷的一个合理估计。首先，检查图形的EPSP动力学表明通过膜电导的电荷损失相对较慢。这种损失由膜时间常数决定，可以通过EPSP的衰变来估计。这显然太慢，无法影响EPSC和EPSP的响应峰值。与电压钳中EPSC电荷恢复速度相比，它也相当慢，这表明EPSC的整合将合理地指示突触总电荷(卡内维尔和约翰斯顿，1982年)与几项显示Purkinje细胞电致密性的研究一致(谢尔顿，1985年;Rapp等人，1994年;Roth和Hausser，2001年). 尽管有5 pA的振幅阈值，但所分析的EPSCs显示出广泛的突触电荷。
所有颗粒细胞→浦肯野细胞对的动力学特性。A类，双指数上升相位时间常数直方图适合振幅>5 pA的平均EPSC实心钢筋表示并行光纤连接。B，衰减时间常数的类似直方图。C类，双指数拟合用于估计每个连接的平均突触电荷转移（振幅>5pA）。
自然变化的突触电荷会导致EPSC振幅成比例变化。同样，对更多的远端突触进行更强的树突过滤，可能会比近端输入更容易减弱其躯体反应。为了比较电荷和滤波这两个因素的重要性，我们检查了它们与EPSC振幅的相关性。如果我们假设τ在≪τ远离的在EPSC波形的双指数拟合中，突触电荷(问)可以近似为问= τ远离的×A类，其中A类是振幅。接受这种近似，我们可以看到，对于固定电荷，振幅与1/τ成正比远离的为此，我们绘制了振幅与1/τ的关系图远离的在图中A类。只分析了平均EPSCs>5 pA的连接，并且排除了比最强的平行纤维连接更强的连接（因为多接触的上行轴突连接必然具有较大的突触电荷）。令人惊讶的是，振幅和1/τ之间根本没有相关性远离的(对> 0.5). 相反，一个非常显著的相关性(对<0.001）。B).
EPSC振幅与突触电荷相关，但与动力学无关。A类，平均EPSC振幅与EPSC双指数拟合的衰减时间常数倒数的关系图。小型和大型EPSC(开放的圆圈低于和高于虚线）不包括在回归计算中（见结果）。最佳拟合回归(实线)显示了95%的置信限(虚线曲线).B类似分析表明，EPSC电荷与振幅之间存在显著相关性。
讨论
平行纤维→浦肯野细胞连接突触重量的决定因素
目前在32°C下从成年大鼠切片中获得的平行纤维连接的记录证实了存在广泛的单一EPSC振幅(巴伯，1993年)并进一步表明，这些突触中有很大一部分非常微弱，无法产生可检测到的躯体反应。我们假设这种可变性反映了大鼠在生活中（运动）学习过程中获得的突触修饰。我们的数据揭示了这些修改的可能机制。
一般来说，我们的数据不支持突触前机制。动作电位传播似乎是可靠的。我们的释放概率估计值与总体释放概率一致，总体释放概率在较窄的升高值范围内（～0.9），这些值对于最强的连接是准确的。我们对小连接的释放概率的估计，尽管与潜在概率的类似值一致，但由于实验噪声，更不确定。然而，我们仍然可以得出结论，大于5 pA的连接的失效概率低于0.5。我们无法通过动作电位序列来证明极低概率连接的存在。应该注意的是，根据突触参数，如受体饱和度和多泡释放的存在，低失败概率的微小变化可能与反应幅度的显著变化有关。我们的数据质量不足以排除释放概率对确定突触重量分布的贡献，但我们的数据没有支持这一假设。
我们录音中明显的高释放概率很难与<5%的结论相一致(Dittman等人，2000年). 当然，5%的概率可以解释为对应于单个发布站点，而我们的概率是可能涉及多个发布站点的连接的总值。然而，有必要将大约45个释放点组合在一起，释放概率为5%，以达到总体90%；最近对停靠小泡数量的测定表明，该数字接近7–8(Xu-Friedman等人，2001年). 5%释放概率的估计值来自基于幼年动物数据的成对脉冲促进模型，在该模型中观察到的促进作用明显大于我们的单一连接。这可以被视为促进作用随着年龄的增长而降低（并且释放概率增加），但我们通过分子层刺激再现了强配对脉冲促进作用。我们怀疑，与颗粒细胞层刺激相比，分子层刺激引起的复合反应在某种程度上可能无法代表单一连接。分子层中的刺激激活了不太可能是生理性的密集纤维束(Wang等人，2000年). 几种机制可能有助于观察到的促进作用，包括纤维募集(Merrill等人，1978年)通过持续去极化或钾积累(Kocsis等人，1983年)，谷氨酸溢出(Barbour等人，1994年)和电压依赖的树枝状电导。
一些突触后机制可能有助于突触重量的扩散。令人惊讶的是，滤波程度（根据EPSC动力学估计）对EPSC振幅没有预测能力。这可以部分解释为树突位置突触反应的树突-体细胞衰减的适度变化（小于～2.5倍）(Roth和Hausser，2001年). 然而，完全没有任何相关性可能反映了代偿机制的运作，如海马锥体细胞的报道(马吉和库克，2000年).
不仅观察到广泛的突触电荷，而且突触电荷与EPSC振幅密切相关。可变突触电荷的一个明显来源是所涉及的突触接触次数：一次和两次接触频繁发生(哈维和纳珀，1988年;Napper and Harvey，1988年a,b条); 目前尚不清楚平行纤维和浦肯野细胞对之间的接触有多普遍。突触电荷广泛变化的另一个合理解释是突触后受体的数量或灵敏度不同。标记被认为在这些突触表达的AMPA受体亚单位（尤其是GluR2）(Tempia等人，1996年;豪瑟和罗斯，1997年)揭示了广泛的受体密度，相当一部分突触完全没有染色(赵等，1997). 这与我们的建议一致，即许多平行纤维→浦肯野细胞突触只产生微不足道或无电反应。
最后，Purkinje细胞具有几种电压依赖性电导(利纳斯和杉森，1980年;Crepel and Penit-Soria，1986年)这可能会形成突触反应。然而，除了证明突触诱导的简单棘波是在轴突丘中启动外(Stuart和Hausser，1994年)脊椎和树突中的钙通道可以根据突触输入打开(Takechi等人，1998年)电压激活电导参与突触反应的程度尚不清楚。
据推测，在给定的时间内，只有一小部分平行纤维处于活动状态(1969年，马尔;阿不思，1971年). 要做到这一点，一小部分平行纤维必须能够激发Purkinje细胞，这是可能的。目前的估计值（150）和在幼年动物中获得的估计值（30）之间的差异似乎是由幼年动物中较大的平均EPSC引起的（可能包括一些较大的上升轴突连接）年轻Purkinje细胞必须充电至阈值的电容要低得多：～300 pF，而成年人为1500 pF(Roth和Hausser，2001年). 我们得到的估计是近似值。它没有考虑到我们认为存在的大部分非常弱的连接，以及静息电位的变化（如果有的话；豪瑟和克拉克，1997年)或抑制作用。它还以同步并行光纤活动为前提。最后，最近有人建议Purkinje细胞的膜电阻要低得多体内将导致对这些细胞中突触整合的截然不同的观点(Jorntell和Ekerot，2002b).
上升轴突
上行轴突对浦肯野细胞输入的重要性一直是小脑研究领域长期争议的主题。总的来说，我们发现近端颗粒细胞诱导的EPSC与平行纤维介导的连接具有非常相似的特性，但有一个关键的区别：局部颗粒细胞产生可检测EPSC的可能性更高。因此，近端颗粒细胞构成Purkinje细胞的特权输入，这提供了一种机制，可以解释Purkinje细胞对其邻近苔藓纤维输入的敏感性。然而，颗粒细胞功效的总体差异似乎小于一些预测，其潜在机制出乎意料。如果我们计算树突平面35μm范围内的平均颗粒细胞功效，并将其与较远颗粒细胞的功效进行比较，我们得出近端颗粒细胞的效应系数为3.2。其中只有1.4倍是由EPSC振幅的差异引起的，而2.3倍是由产生可检测响应的较高概率引起的。之所以选择35μm的范围，是因为这对应于最近对苔藓纤维终端场范围（平行纤维方向）的估计(苏丹，2001年). 然而，很明显，一些苔藓纤维可能具有完全不同的端接模式(Shinoda等人，2000年).
尽管我们不知道我们记录了多少上升轴突连接，但我们对浦肯野细胞附近整个区域的颗粒细胞进行了采样。显然，强大的上行轴突连接并不常见。如果我们的样本中包含了许多上行轴突连接，它们似乎具有与平行纤维连接类似的特性。
