可视化小鼠细胞形态和克隆关系的非侵入性遗传/药理学策略

摘要

介绍

现在有大量关于神经系统发育和功能的数据。然而，许多单个神经元类型的作用仍然缺乏了解，很大程度上是因为难以将其生理、解剖和分子特性关联起来。由于缺乏对许多神经元细胞类型进行分类的高选择性分子标记，这一问题变得更加复杂。

目前，最通用的神经元分类方法是基于形态学，目前有多种方法可用于此目的。揭示神经元形态的经典方法包括高尔基染色、diI示踪和单细胞注射神经生物素或HRP。最近对细胞注射方法的改进包括在注射前使用荧光染色或逆行示踪剂来可视化神经元亚群(Tauchi和Masland，1985年;Rodieck和Watanabe，1993年)以及通过粒子轰击稀疏传递亲脂染料(Gan等人，2000年). 第二类方法使用基因编码的组织化学或荧光报告子，主要是β-半乳糖苷酶、胎盘碱性磷酸酶（AP）或绿色荧光蛋白（GFP）及其衍生物。稀疏细胞亚群中的表达受复制不全病毒的低效感染的影响(Slack和Miller，1996年)或通过使用粒子轰击或电穿孔的DNA传递(Lo等人，1994年;Haas等人，2001年). 这些方法特别适合切片或外植体培养，因为它们需要进入组织进行病毒感染或DNA递送。最近对这类基于基因的方法的一个重要补充是，在Thy-1启动子的控制下携带GFP或其衍生物的转基因细胞系通常在不同的神经元亚群中表现出稀疏的表达，这类方法不需要组织通路进行细胞标记(Feng等人，2000年).

标记单个细胞也是谱系追踪所需的核心方法，谱系追踪是发育神经生物学中长期关注的应用。对于谱系追踪，理想情况下，标记应该传递到单个细胞或在单个细胞内激活，然后在对该细胞的所有子代进行少量或无任何修改或稀释的情况下传递。微量注射荧光标记或其他惰性标记在早期胚胎谱系研究中取得了巨大成功爪蟾和其他非胎盘动物(2002年车道和床单). 然而，这种方法只能在细胞较小且难以接近的发育后期难以使用，而且在胎盘动物中是不切实际的。另一种选择是，植入遗传标记细胞，如经典的鸡-鹌鹑嵌合体系统(伯恩斯和勒杜阿林，2001年)，已成功用于鸟类胚胎的谱系分析，但这种方法在胎盘动物中很困难(Wichterle等人，2001年). 在哺乳动物和鸟类的实验中，通过整合复制不全的逆转录病毒来标记有丝分裂活跃的祖细胞是当前CNS谱系分析的选择方法(Cepko等人，1998年;Noctor等人，2001年;里德和沃尔什，2002年). 然而，要在哺乳动物大脑中使用，病毒注射需要手术进入心室区，这是一个技术上具有挑战性的问题，尤其是在妊娠早期(McCarthy等人，2001年).

目前，有三种非侵入性方法可用于哺乳动物的谱系追踪。其中两项涉及对高度嵌合体动物的分析，这些动物要么是在胚泡期通过胚胎干细胞注射产生的(Kuan等人，1997年)或通过对杂合女性X染色体失活的差异标记斑块进行评分(Tan等人，1995年). 这两种方法在标记细胞与未标记细胞的比率以及标记事件的时间方面都缺乏灵活性。第三种方法使用表达β-半乳糖苷酶（lacZ）基因的转基因小鼠，该基因在由神经元特异性烯醇化酶启动子驱动的编码区（“laacZ”）内具有内部重复(尼古拉斯等人，1996年). 罕见的基因内重组事件消除了重复，恢复了野生型lacZ编码序列，并允许在以后对克隆相关细胞进行组织化学可视化。该系统已用于分析神经和非神经谱系(埃洛伊·特里奎特和尼古拉斯，2002年)但受重组频率低（胚胎第11天至第12天分析时，大约每20只小鼠发生一次重组事件）、实验者无法控制重组事件的时间以及β-半乳糖苷酶对神经元形态的定义普遍较差等因素的限制。

在本文中，我们描述了一种遗传和药理学相结合的方法，该方法（1）不需要手术或机械接触靶细胞，（2）对神经元形态进行高质量的定义，并对远处的过程进行良好的可视化，（3）使用简单、可靠和快速的方案产生持久的染色，（4）基于基因靶向或转基因启动子的特异性，靶向预先确定的细胞亚群进行标记，并且（5）允许对标记细胞谱系的遗传事件的时间和效率进行药理学控制。当细胞在发育后期或成年期被标记时，可以在单个动物中分析数百个标记细胞的形态，这表明该方法可以用于基因改变小鼠的常规表型分析。

材料和方法

雌激素受体敲除小鼠通过标准程序生成R26 Cre-estrogen受体（ER）敲除小鼠系，并保持纯合状态。lacZ/胎盘碱性磷酸酶（ZAP）报告鼠是Corine Lobe和Andras Nagy（多伦多大学）赠送的礼物。该品系必须保持在杂合状态，因为ZAP纯合子是不能存活的。按照标准程序进行杂交和基因分型。将4-羟氨苄（4HT）（西格玛，圣路易斯，密苏里州）以10 mg/ml的浓度溶解在乙醇中，并在−80°C下储存在等分样品中。通过旋转将等分样品在5 vol葵花籽油中乳化几分钟，然后在speed-vac中蒸发乙醇（Savant，Holbrook，NY）。注射为腹腔注射，剂量如图中所示。

组织加工收集新鲜或心脏灌注后的组织。为了进行视网膜组织学检查，用乙醚麻醉成年小鼠，并摘除其眼睛。所有培养均在室温下进行，除非另有说明。在含有2%多聚甲醛、0.5%戊二醛、2 m的PBS中预先将整个眼球固定15 min米氯化镁₂通过摘除角膜和晶状体打开眼睛，并用一系列四个侧面切口将其压平，视网膜被切开并放置在两个小的圆形塑料网之间。在室温下，将视网膜固定在同一固定剂中1小时，并在PBS中用2 m冲洗两次米氯化镁₂，转移至PBS，不含MgCl₂，并在65°C的水浴中加热1小时，以灭活内源性AP活性。AP染色在0.1米三分之一米氯化钠，50米米氯化镁₂pH 9.5，0.34μg/ml硝基蓝四唑（NBT）和0.175μg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP）（印第安纳波利斯州伯林格曼海姆），在室温下轻轻搅拌1小时至过夜。染色后，将组织在PBS、0.1%吐温20中清洗三次20分钟，然后用4%多聚甲醛在PBS中固定过夜。在成像之前，样品通过乙醇系列脱水，然后用2:1苯甲酸苄酯（BB）/苯甲醇（BA）清除。对于出生后的大脑组织学，用氯胺酮-甲苯噻嗪麻醉小鼠并灌注上述固定剂，然后解剖大脑，将其嵌入PBS中3%的低熔点琼脂糖中，用2 m米氯化镁₂，并在厚度为250–300μm的振捣器上切片。此后，按照视网膜平面支架的描述对切片进行处理。将整个胚胎、胚胎头部或解剖的胚胎大脑固定并进行完整的热处理，然后振动切片进行染色和分析。除胚胎在PBS中孵育外，E13之前的整个胚胎的染色都是类似的米氯化镁₂，0.5%吐温20过夜，用PBS清洗数次，2 m米氯化镁₂，然后在无底物的AP染色缓冲液中清洗两次，然后在完全染色溶液中培养。

组织在固定和热灭活后，染色前，或染色和固定后可以保存数月，质量没有明显损失。然而，在BB/BA中进行组织清除后，NBT/BCIP沉淀会在几天内溶解。

显微镜和图像分析使用蔡司Axiophot显微镜，使用黑白Axiocam CCD，使用或不使用CRI滤色片组，对清除的组织进行成像。对于组织的连续切片，Ludl级Z驱动适用于显微镜。图像采集和Z焦点控制由Openlab软件（Improvision）控制。使用Objectimage（NIHimage的增强版本）和D.K.Hartline（夏威夷大学贝基神经生物学实验室）编写的Treetrace程序进行追踪和三维重建。

结果

细胞标记方法的原理

标记系统由两个遗传成分组成（图。​（图11A类). 第一种是融合到突变的雌激素受体配体结合域（CreER）的Cre重组酶，它选择性地结合雌激素类似物4-羟基三苯氧胺（4HT），在没有4HT的情况下不起作用(Feil等人，1996年). 我们将CreER编码区定位于Rosa26位点(弗里德里希和索里亚诺，1991年)获得CreER重组酶的普遍或几乎普遍表达（图。​（图11B类). 我们已经推导出两行鼠标，它们在转换CreER消息的效率方面有所不同。在一行中，CreER编码区的起始蛋氨酸密码子处于最佳翻译起始上下文（GCCACC自动液位计T） 在第二行中，它所处的环境远不是最佳的（CCCTTT自动液位计T） ●●●●。这里报告的实验使用了第一条线，以下称为R26CreER。

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图1。

敲除小鼠的一般策略和产生。A类R26CreER概述；ZAP标签策略。CreER融合蛋白广泛表达于Rosa26位点。在全身暴露于4HT后，激活的CreER催化ZAP报告基因座的loxP位点之间的重组，允许下游AP编码区的转录。重组效率取决于4HT的释放量。ER-LBD公司雌激素受体配体结合域突变识别4HT；沙特阿拉伯，剪接受体；停止，三串联polyA添加位点。B类，R26CreER敲除小鼠的一代。顶部，Rosa26基因座地图，显示Xba公司I站点(X（X）)用于插入CreER-PGK-neo盒式磁带生态RV限制位置(R（右）)用于基因分型，以及Rosa26基因的外显子1-3。Southern杂交探针显示为黑色条敲入型和野生型等位基因杂交带的预期大小分别为3和11kb。底部，所示基因型小鼠DNA的Southern blots。C类，R26CreER/+成人视网膜的平面安装；NBT/BCIP染色的ZAP/+小鼠。顶部，未注射对照；底部，在P7、P8和P9三次腹膜内注射250μg 4HT后。

第二个遗传成分被称为ZAP，是一种普遍表达的Cre-sensitive报告基因，由Lobe等人（1999）（图。​（图11A类). ZAP报告子包含一个巨细胞病毒增强子/β-肌动蛋白启动子，该启动子驱动lacZ编码区，随后是三个转录终止位点。lacZ编码区和终止信号的两侧是loxP位点。AP编码区位于loxP侧翼序列的紧邻远端，但除非上游盒被Cre重组酶去除，否则不表达。由5-溴-4-氯-3-吲哚-β测定-d日-吡喃半乳糖苷（Xgal）染色，Lobe等人（1999）开发的小鼠系中的Rosa26基因座和ZAP转基因在整个发育过程中在CNS中普遍或几乎普遍表达，尽管不同区域的表达水平有所不同(赞布罗维茨等人，1997年;Lobe等人，1999年)（未显示数据）。

R26CreER的全身暴露；4HT的ZAP小鼠可缓解CreER融合蛋白的细胞质隔离，使其转移到细胞核，并不可逆转地激活部分细胞中的AP表达。上一个体内针对CreER的研究旨在开发高效的基因重排时间控制，结果显示系统性4HT暴露导致重组效率低下，令人失望(Feil等人，1996年;Brocard等人，1997年;Danielian等人，1998年). 在本申请中，低效重组是可取的，并且很容易实现，无毒水平为4HT。图​图11C类说明了出生后早期腹腔内4HT暴露的影响：～1个月后，数百个AP+细胞均匀分布在视网膜上，而在未暴露于4HT的对照视网膜中没有AP+细胞。

成人和胚胎视网膜和大脑的细胞标记

在本申请中，我们选择AP作为报告者，因为它的质膜定位（通过糖基磷脂酰肌醇锚定）和强大的组织化学染色。图​图22说明了R26CreER/+中视网膜扁平支架中的细胞类型范围和形态学定义；出生后暴露于4HT的ZAP/+小鼠。方便的是，NBT/BCIP沉淀物的高稳定性允许人们首先在平板上观察相同的细胞，然后在视网膜切割成条状后在横截面上观察。图​图22B类–H（H）显示了包含AP+光感受器、双极细胞和无长突细胞的垂直截面。图​图22我–问图中显示了星暴无长突细胞和神经节细胞的连续切片，以及它们乔木的数字化重建。基于该方法的小鼠视网膜形态学分类的初步目录表明，细胞标记与它们的丰度大致成比例，并且通过与其他哺乳动物视网膜的比较判断，所有主要分类都在标记的细胞中表示出来(马士兰，2001年)（T.Badea和J.Nathans，未发表的观察结果）。这一观察结果以及下文所述的大脑观察结果表明，R26CreER和ZAP的结合标记了多种神经元细胞类型，似乎对细胞活力没有有害影响。

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图2。

视网膜细胞的形态学。成人视网膜CreER/+；染色前1周接受3mg 4HT的ZAP/+小鼠(A–H)或0.8 mg 4HT（P20）(I–Q公司). 这些剂量的4HT产生相对较低密度的AP+细胞，适合表征单个细胞的形态。用NBT/BCIP对视网膜整体进行染色，并用Nomarsky光学系统收集图像以显示视网膜细胞层。A类，视网膜平面安装。B–H之间，厚度为～500μm的垂直截面。感光层位于顶部.B–D，以圆锥体为中心的三个焦平面(正确的带有大蒂的感光器）、杆(左边小球体光感受器）和窄场无长突细胞(底部).E类，圆锥体；F、 G公司锥形双极电池；H（H）星暴无长突细胞。I–Q公司、平板图像和计算机图像重建。我，显示神经节细胞的视网膜平架图像（10×）(垂直箭头)星暴无长突细胞(水平箭头)和宽视野无长突细胞(箭头45°）。穆勒胶质细胞、双极性细胞和窄视野无长突细胞也可见于该病灶平面。在扁平支架中，大多数丰富且高度致密的细胞要么横穿视网膜的全层（米勒胶质细胞），要么局限于感光层（视杆和视锥细胞）。J型，星暴无长突细胞的图像（40×），如所示我及其重建图像(K（K）). 该细胞的轴突分布在厚度为～4μm的窄平面上。左旋-右旋，通过神经节细胞的连续焦平面我及其重建图像(问).

成人R26CreER/+中还获得了不同细胞类型的均匀分布样本；全身4HT暴露后的ZAP/+大脑（图。​（图3）。三). 分布在整个大脑中的较大、染色强烈、致密的细胞似乎是胶质细胞；在这些神经元中，很容易看到较小的分支精细的神经元（图。​（图3三B类). 我们通常在300μm的振动切片中观察成人大脑，如图所示​图3。三这些部分足够薄，使得它们提供良好的光学清晰度（当在苯甲酸苄酯/苄醇中平衡时），但它们具有足够的厚度，使得对于许多神经元来说，大多数或所有的树突杆位于单个部分内，从而便于从光学切片进行细胞形态的三维重建。AP标记细胞过程似乎效率很高；例如，单个锥体细胞轴突可以被追踪数毫米，仅在截面上终止。CA1神经元、皮质锥体细胞和三个小脑颗粒细胞的示例如图所示​图3三,C类–H（H）,我–N个、和O（运行）–问分别是。

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图3。

成年CNS神经元的形态学。成人R26CreER/+的大脑；ZAP/+小鼠，在P21接受单次腹腔注射0.8 mg 4HT。A、，脑矢状面切片（300μm）。大多数标记强烈的细胞是胶质细胞。B类，穿过皮层的截面（300μm）(顶部)和海马(中心)显示标记的锥体神经元(水平箭头)和CA1神经元(垂直箭头).C–H型，通过CA1神经元的连续焦平面B类.I–M公司、通过锥体神经元的连续焦平面及其重建图像(N个).O–Q公司，三个小脑颗粒细胞。细胞体和致密树突树可见于下半部分每个面板的；轴突的特征性T形分支形成平行纤维，可见于上半部每个面板的。在C类–问，连续焦平面的间隔为5μm。

接下来，我们询问这种方法是否适用于胚胎神经元，尤其是4HT暴露和动物死亡之间的几天时间是否足以使AP蛋白在树突和轴突的整个表面上大量积累。图​图44显示了来自R26CreER/+的E18大脑；在E12暴露于母体注射600μg 4HT的ZAP/+小鼠。细胞体、树突和长纤维束的AP染色明显。重要的是，AP+细胞相对稀疏的分布使得重叠或交叉指状纤维束清晰可见（图。​（图44A类–D类)从而提供了对单个大脑中主要神经束的方便测量。相比之下，通过对一般轴突标记物（如神经丝）的免疫染色，通常很难清楚区分重叠的束。在皮层中，未成熟的锥体细胞几乎没有基底树突，顶端树突的树枝状结构也很少（图。​（图44E类)，与图中所示的成熟锥体细胞形态相反​图3三我–N个在E18视网膜内，标记细胞呈放射状排列，几乎没有切向迁移（图。​（图44F类,G公司)与之前的逆转录病毒标记和X灭活研究一致(特纳等人，1990年;Reese等人，1995年). R26CreER/+也可以观察到神经元突起的完整AP标记；暴露于E8单次母体注射25μg 4HT的E12期ZAP/+胚胎（数据未显示）。例如，在这些胚胎中，单个AP+脊髓和颅感觉轴突沿着其全长被强烈标记。

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图4。

E18脑和视网膜神经元的形态学。R26CreER/R26CreER纯合子雌性与ZAP/+雄性交配，并在妊娠第12天注射600μg 4HT。胚胎在E18收获。副矢状面(A–C)和冠状的(D、 E类)两个R26CreER/+的截面；ZAP/+室友。B、 C类，连续高倍放大的纹状体显示纤维束(B类)和来自纹状体神经元的单个轴突(C类).E类，锥体神经元形态简单，顶端树突不分枝，基底树突稀少；可见轴突下降至皮层下区域。F、 G公司，视网膜内标记细胞的柱状排列。每个垂直细胞簇内的细胞可能是克隆相关的。

标记克隆的生产

对于谱系追踪，标记的祖细胞应足够稀疏，以便在发育后期每个AP+簇中的所有细胞都有较高的克隆相关概率。为了确定用于谱系分析的4HT的最佳浓度，我们在妊娠第8天为怀孕雌性每克体重注射0.5、1或4μg 4HT（相当于25克小鼠的12.5、25和100μg 4HT），并检查其成年后代大脑和视网膜中标记细胞的模式。

图​图55A类显示R26CreER/+的三个成人视网膜；ZAP/+小鼠暴露子宫内至4μg/gm 4HT（视网膜a–c)1μg/gm 4HT暴露小鼠的一个视网膜（视网膜d日). 视网膜中存在几个大的AP+细胞簇a–c视网膜中存在一小群AP+细胞d日总的来说，暴露于4μg/gm 4HT的窝友的六个视网膜中有六个视网膜的每个视网膜都有多个AP+细胞簇；暴露于1μg/gm 4HT的同窝出生的8个视网膜中，有3个每个视网膜只有一个AP+细胞簇，其余5个视网膜没有AP+细胞；暴露于0.5μg/gm 4HT的窝友的8个视网膜中，有0个视网膜标记了AP+细胞。在E18视网膜中，妊娠中期4HT暴露的类似剂量依赖性控制着AP+放射细胞簇的数量（数据未显示）。陡峭的4HT剂量-反应关系很可能反映了四种Cre单体催化位点特异性DNA裂解和交换反应的需要(郭等人，1997). 因此，如果Cre单体的核浓度随4HT浓度线性变化，则复合效率应与4HT的四次方浓度成正比。这种非线性的剂量-反应关系应该会显著缩短单次4HT注射后重组酶作用的时间进程。

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图5。

视网膜中有遗传标记的克隆。R26CreER/R26CreER雌性与ZAP/+杂合子雄性交配，并在妊娠第8天注射1μg/gm 4HT或4μg/g 4HT。妊娠被带到足月，子代的视网膜在成年时被分析，并被视为平坦的坐骑(A–E、J–M)或厚度为～500μm的垂直切片(F–I型).A类，视网膜a–c来自4μg/gm 4HT注射；视网膜d日来自1μg/gm 4HT注射。视网膜一有神经元/胶质细胞和血管克隆，视网膜b条和d日只有神经元/胶质细胞克隆和视网膜c（c）只有血管克隆。B、 C类，视网膜血管的逐步放大视图c（c）.D类，视网膜的高倍视图b条位于视网膜远端标记细胞体的一侧；长树突状突起标记良好，并延伸至整个视网膜。E类，视网膜中单个克隆的高倍视图d日横向延伸最大的纤维可能来源于宽视野无长突细胞。垂直剖面图(F–I型)和平面安装(J–M)视网膜中的克隆d日在连续的焦平面上显示。两种不同的水平单元心轴表示为水平箭头在里面H（H）和M（M）和进入视神经的神经节细胞轴突垂直箭头在里面H（H）和J型.F–I型同时也表明，在这个克隆中，标记的细胞体紧密聚集在一起，所占的横截面积远小于扁平支架中细胞突起所占的面积。

鉴于其缺乏，1μg/gm 4HT组中的每个AP+细胞簇很可能代表一个克隆。有趣的是，视网膜中的所有AP+细胞c（c）是视网膜内血管系统中的内皮细胞（图。​（图55A类–C类). 视网膜中可见AP+内皮细胞和神经元a。AP+内皮细胞局限于视网膜内血管树的几个大楔形区域，与克隆起源一致，随后标记细胞的迁移受限。血管树上AP+和AP-细胞的交替模式表明存在少量局部内皮祖细胞，其后代在视网膜内血管生成期间广泛混合。视网膜内b条在宽视野无长突细胞的树突状突起中观察到强烈的AP标记，这些标记有效地扩散到视网膜的整个表面（图。​（图55D类).

视网膜中的单个AP+细胞簇d日，在平面安装中都可以看到（图。​（图55E类,J型–M（M）)和横截面（图。​（图55F类–我)有一个紧密的放射状细胞团，跨越视网膜的整个厚度，在外丛状层有几个水平的细胞突起（图。​（图55H（H）,M（M）,水平箭头)窄视野和宽视野无长突细胞树突（图。​（图55K（K）,L（左）)以及投射到视神经的10-20个神经节细胞轴突（图。​（图55H（H）,J型,垂直箭头). 如图所示，簇内相邻细胞的紧密并置阻碍了单个细胞形态的识别，这一限制可能通过从半薄或超薄切片进行连续重建来克服。

成人大脑的类似分析显示，在E8暴露于1μg/gm 4HT的小鼠中出现罕见的细胞簇（图。​（图6）；6); 用4μg/gm 4HT观察到标记细胞密度较高（数据未显示）。在连续的矢状窦旁切片中，可以看到一簇皮质细胞占据了延伸的内侧弧（图。​（图66A类)皮质下和皮质内纤维都从中发出（图。​（图66B类). 这个半球没有其他皮质细胞被标记。纹状体内低密度存在单一形态的中间神经元（图。​（图66A类,D类). 这种广泛分布的纹状体中间神经元来源于一种或几种前体的可能性与最近的逆转录病毒谱系研究一致(里德和沃尔什，2002年). 有趣的是，耳蜗背核被大量标记，而邻近的脑干和小脑结构则没有标记（图。​（图66A类,E类,F类)表明该结构具有独特的前身。

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图6。

胚胎克隆体在成人大脑中可视化。来自R26CreER/+的成人大脑；ZAP/+小鼠在E8暴露于母体注射1μg/gm 4HT的环境中，如图图例所示​图5。5.A类，连续250μm矢状旁切片，从内侧排列(左上角)到侧面(右下角). 在皮层中，单个相邻的染色细胞簇由箭头并以更高的放大率显示在B类.来自该克隆的一组纤维向下延伸至外囊(B类,向上箭头); 第二组纤维靶向皮层邻近区域(B类,向下箭头). 在克隆边缘，单个中间神经元可以从大量标记细胞中分离出来(C类). 纹状体(A类,向左箭头)具有单一的标记中间神经元形态学类别，在高倍镜下显示D类高倍镜下对纹状体的检查显示，每个标记细胞除了有许多厚的树突状突起外，还有一个单一的薄轴突，它要么从切面向外延伸，要么在几十到几百微米外终止于细乔木的光环中。这种形态学将这些细胞识别为神经元而非胶质细胞。丘脑的密集标记(A类,向右箭头)主要来源于神经突；很少见到标记的细胞体。耳蜗背核内可见染色致密的纤维和胞体(A类,垂直箭头)，以递增的放大倍数显示E类和F类.

为了系统地确定4HT注射时间对AP+细胞簇大小和标记的细胞类型的影响，并评估实验中动物之间的变异程度，CreER/+；在第7天、第8天、第9天、第10天、第11天或第13天，将ZAP/+胚胎暴露于母体单次注射200μg 4HT的环境中，并在E14或E18对胚胎进行分析。图​图77表明：（1）妊娠后期逐渐注射4HT会导致每簇AP+细胞数量相应减少，（2）妊娠后期注射恒定剂量的4HT（200μg）会使每脑产生更多AP+簇，可能是因为较大的胚胎为Cre介导的重组提供了相应数量的靶细胞。我们注意到，为了确定4HT暴露时间对细胞簇大小和组成的影响，大量标记的簇是有用的；对于需要稀有且广泛分离的簇的谱系追踪应用，需要较低的4HT剂量。

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图7。

4HT注射时间对标记克隆的组成和大小的影响。如图所示进行了配合​图5，5，除了一些子代对于frizzled3或frizzed4的敲除等位基因是额外杂合的外，这两个基因似乎都不影响杂合状态下的发育(Wang等人，2001年,2002).A–C，第7天母体注射200μg 4HT后E18胚胎的冠状切片(A类), 11 (B类)，或13(C类)妊娠期。在A类，来自前连合的半球间纤维(底部)和胼胝体(顶部)可以在右半球。在右侧头部。D–F型，第10天母体注射200μg 4HT后，来自E18胚胎的AP+皮质细胞簇(D类), 11 (E类)，或13(F类)妊娠期。将此与图进行比较​图4，4图中显示，一个E18胚胎在妊娠第12天被母亲注射400μg 4HT。G、 H（H），第8天母体注射200μg 4HT后E14胚胎的冠状切片(G公司)或9(H（H）).I–L，孕13天母体注射200μg 4HT的成人大脑水平切片；皮质的高倍视野(J型)，嗅球(K（K）)和小脑(L（左）).L（左）在其中一个标记严重的区域中，来自AP+小脑颗粒细胞的大量紧密相连的平行纤维。将此与图进行比较​图3，三图中显示了一只在P21上注射800μg 4HT的小鼠的成年大脑。

假设Cre介导的重组是一个随机事件，在每个细胞中独立发生，图中一个半球没有标记细胞​图77A类表明另一半球的标记细胞是由一个祖细胞或至多几个祖细胞中的Cre介导的重组产生的。图​图77A类还显示了来自前连合和胼胝体的AP+半球间纤维，表明对长轴突的有效标记。如图所示​图77A类–H（H）随着4HT注射时间的延长，单个AP+簇内的平均细胞数逐渐减少。这可以通过比较E7注射4HT后E18的全脑冠状切片来看出（图。​（图77A类)，E11（图。​（图77B类)和E13（图。​（图77C类); 在E10注射4HT后，E18的大脑皮层（图。​（图77D类)，E11（图。​（图77E类)和E13（图。​（图77F类); 或E8注射4HT后E14的全脑冠状切片（图。​（图77G公司)和E9（图。​（图77H（H）). 在皮质内，细胞簇内的位置符合皮质前体放射状迁移的经典模式（图。​（图77B类,D类) (Rakic，1972年).

同窝胚胎之间的比较显示，在妊娠第10天暴露于200μg 4HT后，AP+细胞的总体模式和密度几乎相同。这些数据表明，通过母体注射传递4HT会导致同窝胚胎中均匀或几乎均匀的药物暴露。早期，AP+细胞的模式显示出较大的动物间差异，可能是由于统计波动，反映了早期胚胎中200μg 4HT暴露产生的少量标记前体。

通过比较图可以看出成人大脑中标记细胞类型与4HT注射时间的关系​图3三和​和77我–L（左）如上所述，出生后第21天注射4HT（P）（图。​（图3）三)结果在胶质细胞和神经元上进行了广泛的标记，基本上没有AP+细胞的聚集，这与预期的主要有丝分裂后的人群一样。相比之下，在皮层和纹状体神经发生高度附近的E13处注射4HT(拜耳和奥特曼，1995年)在整个前脑和中脑，标记的神经元要比胶质细胞多得多，并且这些标记的细胞分布均匀（图。​（图77J型). 在小脑中，E13处的4HT暴露会产生大簇标记细胞，根据其平行于小脑表面平面的轴突树枝状结构的独特模式判断，其中大多数是颗粒细胞（图。​（图77L（左）). 一些叶片没有标记，而其他叶片标记较重（图。​（图77我)认为每个簇中的标记细胞可能来自一个祖细胞或最多几个祖细胞中Cre介导的重组。E13暴露4HT后的标记模式与胚胎晚期和出生后早期小脑前体细胞的增殖一致(拜耳和奥特曼，1995年).

在出生后早期注射4HT后，对成人视网膜进行了与上述类似的分析。在E10、P4、P6、P7、P9、P10、P11、P12、P13、P14、P15或P16单次注射80μg 4HT，显示标记细胞类型从注射时间更早的神经节细胞、无长突细胞和锥体光感受器逐渐转移到注射时间较晚的杆状细胞、双极细胞和米勒胶质细胞（数据未显示），与这些不同细胞类型的已知出生日期相似的模式(Polley等人，1989年). 这些观察结果以及上述对成人大脑的分析表明，通过明智地选择注射时间，有可能选择性地进行浓缩，以标记特定的细胞类型。目前没有证据表明Cre介导的重组效率在有丝分裂细胞和有丝分裂后细胞中存在差异。在这方面，CreER/ZAP标记方法不同于逆转录病毒标记，在这种情况下，积极分裂的前体通过逆转录病毒整合机制和在心室或视网膜下空间注射病毒后选择性暴露于病毒颗粒来选择性标记。

讨论

在本文中，我们描述了一种遗传-药理学联合方法，用于在发育和成年期间获得神经元和非神经元细胞的持久Golgi-like染色。存在类似的方法果蝇属并在研究神经发育和功能方面发挥了巨大作用(Marin等人，2002年). 我们注意到，广泛表达的CreER作为一种通用工具，用于对小鼠体细胞进行广泛和大致同步的遗传修饰，已由独立的Guo等人（2002年）,Hayashi和McMahon（2002）、和Zirlinger等人（2002年）在本研究中，我们专注于开发用于高分辨率形态学分析的CreER技术。该系统对于在CNS谱系追踪实验中识别细胞以及对遗传或环境扰动的表型表征特别有用。特别是，在没有4HT的情况下观察到的AP+细胞的极低频率应该有助于对具有少量标记事件的动物进行谱系分析，因为可以有把握地假设标记细胞簇来自单个标记的祖细胞。

CreER的主要实验优点；ZAP标记方法是通过选择性表达CreER报告子，AP标记可针对特定细胞类型。例如，在胆碱乙酰转移酶或酪氨酸羟化酶启动子的控制下，CreER的表达可分别影响胆碱能或多巴胺能神经元的选择性可视化。类似地，在神经元特异性启动子的控制下，CreER的表达可影响神经元而非胶质细胞的选择性可视化。在这里介绍的实验中，我们选择通过用R26CreER标记尽可能广泛的细胞类型来证明该方法。

该方法的一个简单扩展是使用非AP的细胞标签，例如GFP或其衍生物(Novak等人，2000年). 更重要的是，我们可以衍生出类似于ZAP的小鼠系，其中AP（或GFP）报告子后面是一个内部核糖体进入位点，即编码一种能够改变表达细胞的发育或功能的蛋白质的cDNA。通过生成一组稀疏的AP+或GFP+神经元，它们在发育过程中的特定时间表达特定的感兴趣蛋白，可以在单个实验中揭示其在整个中枢神经系统不同发育环境中表达的细胞自主形态学效应。

作为一种组织化学标记物，AP具有许多对大规模形态学分析有利的属性。NBT/BCIP反应简单快速，能有效地染色相对较厚的组织切片，并产生沉淀，在数月内保持不变。高信噪比和对小而远的过程的有效标记允许使用厚组织切片，这极大地促进了纤维束的追踪和大型复杂树突树的三维重建。使用光稳定组织化学反应可以通过传统显微镜收集数据集，避免了共焦显微镜下荧光标记的光漂白问题。AP组织化学与电子显微镜显示兼容(Gustinich等人，1997年)用辣根过氧化物酶对细胞类型特异性标记进行免疫染色。最后，AP+细胞也可以通过常规抗AP免疫染色进行可视化（数据未显示）。AP组织化学的一个局限性是其空间分辨率不等于细胞内填充方法（GFP、Lucifer黄或高尔基染色）或diI标记的质膜的空间分辨率，很可能是由于AP反应产物的细胞外沉积。

按照目前的设想，CreER；ZAP标记方法有几个局限性。首先，单次接触4HT后CreER作用的时间过程可能会延长1–2天，从而限制标记事件的时间分辨率(Brocard等人，1997年;郭等，2002;Hayashi和McMahon，2002年)尽管如此，如上所述，非线性4HT剂量-反应曲线应该会使Cre活性的时间窗口变尖。其次，CreER介导的重组在某些细胞类型中可能比在其他细胞类型中更有效，从而使标记细胞的数量产生偏差。第三，与基因报告物的病毒或颗粒传递一样，在基因激活开始的时间和足够的AP的积累和运输之间存在一定的几天延迟，以可视化远端过程。第四，目前的遗传系统使用两个独立的分离位点。为了在其他遗传改变的背景下标记细胞，可以方便地使用一个携带CreER和ZAP盒的基因座。第五，在靶向选定的细胞类型时，该方法受到目前可用的启动子特异性范围的限制。在这方面，Thy-1-GFP转基因小鼠表现出的神经元表达模式的多样性(Feng等人，2000年)表明不同启动子或启动子元件组合的经验取样可以解决这一限制。因此，我们预计在未来几年内，神经科学界将能够获得越来越多样化和特定的一组特性良好的CreER表达小鼠系，用于细胞选择性标记和修饰。

脚注

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