持续性血脑屏障破坏诱导大鼠体感皮层癫痫灶

摘要

介绍

血脑屏障（BBB）是一种复杂的结构，旨在通过限制大量亲水分子、蛋白质和细胞元素进入大脑来维持恒定的神经细胞外环境。它由排列在脑微血管内的内皮细胞组成，这些微血管通过紧密连接相互连接，并被周细胞和星形胶质细胞足突包围(帕德里奇，1998年;Soreq等人，2002年). 已知几种常见的脑病理学，如中风、外伤、脑肿瘤和癫痫与血脑屏障破坏有关（有关综述，请参阅Ballabh等人，2004年;Neuwelt，2004年). 然而，尽管在某些情况下记录了长时间的异常BBB渗透率(Skoog等人，1998年;Tomkins等人，2001年)目前尚不清楚这种通透性增加是由疾病引起的，还是其本身对疾病的发病机制起作用。

本研究旨在探讨局灶性BBB开放在皮层神经元功能障碍发展中的潜在作用。我们通过局部应用低浓度胆汁盐二氢胆酸或脱氧胆酸，建立了大鼠体感皮层局灶性血脑屏障破坏模型。这些胆汁盐是根据先前的研究结果选择的，这些研究表明它们具有打开脑毛细血管紧密连接的功效(Greenwood等人，1991年)和神经束膜(Todd等人，1997年). 重要的是，在高浓度下（>3 m米)这些胆汁盐显示出对细胞膜的清洁作用，在低浓度下，BBB会发生细微的改变，在电子显微镜研究中没有细胞损伤的证据(Greenwood等人，1991年). 这项研究表明，局灶性持续性血脑屏障破坏导致血清蛋白外渗到大脑细胞外空间，星形胶质细胞早期激活，随后仅限于治疗皮层的持续神经元超同步。我们的数据提示了局灶性癫痫发病机制的新机制。

材料和方法

所有实验程序都得到了柏林和比尔沙瓦动物伦理委员会的批准。

体内动物准备。用硫喷妥钠（40 mg/kg体重）对成年雄性Wistar大鼠（180-250 gm）进行深度麻醉，并将其置于立体定向框架内。对皮肤进行消毒，并形成一个15毫米的矢状切口。在体感皮层上钻一个直径为4mm的骨窗（尾侧3mm，角侧5mm）。打开硬脑膜，用人工脑脊液（aCSF）灌注下层大脑30-60分钟。aCSF的成分为（单位：m）米)：129氯化钠，21氯化钠_三，1.25 NaH₂人事军官₄，1.8硫酸镁₄，1.6氯化钙₂3 KCl和10葡萄糖。在接受治疗的大鼠中，向aCSF（2和1 m）中添加破裂剂脱氢胆酸（DHC）或脱氧胆酸（DOC）米）。在对照实验中，将脑脊液应用于同一只大鼠的对侧半球或半手术大鼠的右半球。在一些实验中，大脑灌注了一种适合血清电解质水平的脑脊液溶液（由10只大鼠的临床化学实验室测定）（单位：m）米)：140氯化钠，0.8硫酸镁₄，1.3氯化钙₂和5.7 KCl（标准）。白蛋白以0.04-0.4 m的浓度加入血清米（相当于血清白蛋白的10-100%，渗透压=300-310 mOsmol/l）。灌注后，仔细关闭骨窗，缝合皮肤。本研究仅包括手术结束时在手术显微镜下观察到的皮质表面无明显损伤或皮质血管出血的大鼠。

BBB完整性评估。为评估BBB完整性，大鼠腹腔注射白蛋白结合染料Evans蓝（5 ml 2%溶液，0.9%NaCl，Sigma，St.Louis，MO）。注射后一两个小时，麻醉大鼠被斩首，大脑很快被切除。通过两种方法对脑实质中的伊文思蓝-白蛋白复合物进行定量。（1） 制备冠状切片（约0.5 mm厚），并在4%多聚甲醛溶液中孵育24小时，然后在30%蔗糖（0.1米磷酸盐缓冲液）24小时。然后在低温恒温器上切割50微米切片。使用Mathlab 6.5软件，通过读取数字化低功率场皮层成像中的颜色强度（10×；德国Oberkochen蔡司显微镜；580 nm波长），测量荧光蛋白-Evans蓝复合物的组织浓度。为了验证局部灌注时白蛋白对皮层的渗透，应用了相同的程序，但Evans蓝（0.1 m米)添加到含白蛋白的aCSF中。（2） 在第二种方法中，将治疗或对照的新皮质切片从下面的大脑中切开，溶解在0.1米含有1%十二烷基硫酸钠（Carl Roth GmbH，Karlsruhe，Germany）的磷酸盐缓冲溶液（10μl/mg组织），均质并离心（12000×克；5分钟），使用Eppendorf Scientific（纽约州韦斯特伯里）离心机（5417R）沉淀混杂的细胞碎片。使用Eppedorf生物光度计在595 nm波长下分光光度法测量上清液中的白蛋白-Evans蓝络合物浓度。

组织学。在组织学实验中，大鼠脑在BBB开放后通过经心灌注改良Lillie固定剂进行固定(Dreier等人，2000年). 灌注后，将大脑置于4°C的相同固定剂中过夜。然后从头骨中取出大脑，解剖，用96%的酒精处理过夜，然后按照常规程序进行石蜡包埋。用甲酚紫、苏木精、曙红和钒酸品红-甲苯胺蓝法对8至10微米冠状切片进行染色，以检测神经元损伤(维克托夫等人，2000年). 在10μm石蜡切片上进行免疫细胞化学。切片在4°C下与一级抗体孵育过夜。小胶质细胞用FITC-Griffonia simplicifolia isolectin-B4（GFS-IB4；1:20；Sigma）染色，CD40用大鼠抗鼠单克隆抗体（1:100；加利福尼亚州圣地亚哥PharMingen）染色。在室温下应用生物素化的第二抗体2小时，然后进行标准ABC-DAB开发，从而实现信号检测(Bechmann等人，2000年;Gimsa等人，2001年).

电生理记录。在所有电生理实验中，用二甲醚对大鼠进行深度麻醉并斩首。大脑很快被切除，用振动棒从体感皮层制备冠状切片（400μm厚）（英国拉夫堡坎普登仪器公司）。切片保存在加湿、碳化的（5%CO）中₂和95%O₂)36±1°C的气体环境，并在标准接口室中灌注一种CSF。孵育至少1小时后进行电生理记录(巴甫洛夫斯基等人，2003年). 使用填充154 M的细胞外玻璃微电极（～3 MΩ）记录场电位米氯化钠。如前所述，使用锋利的微电极进行细胞内记录(Fleidervish等人，1996年). 使用放置在白质和灰质边缘的双极刺激电极，用短脉冲（100微秒）刺激切片。

药物应用。药物是通过添加到沐浴液中来使用的。NMDA、AMPA-KA或GABA受体被50μ米2-氨基-5-磷酸（APV），10μ米6-氰基-7-硝基喹啉-2，3-二酮（CNQX）或5μ米荷包牡丹碱。所有药物均来自Sigma-Aldrich（德国Deisenhofen）。

数据采集和分析。信号被放大（SEC-10L；NPI Electronics，Tamm，Germany），以2 kHz的频率过滤，显示在示波器上，在线数字化（CED-1401；Cambridge Electronics-Design，Bridge，UK），并存储用于离线分析。数据以平均值±SEM表示。通过ANOVA确定治疗切片和对照切片之间的差异，而使用相关变量的Wilcoxon符号秩非参数检验来检验药物的效果。所有统计检验均使用SPSS 10.1 for Windows进行。第页以<0.05为统计显著性水平。

结果

局灶性皮层BBB破坏

为了研究持续局灶性BBB损伤的后果，我们建立了大鼠体感皮层内侧（躯干）区域BBB单侧开放的模型。BBB损伤是由暴露的皮层直接灌注含有DHC的aCSF引起的(n个=19只动物）或DOC(n个=27）(Greenwood等人，1991年). 注入伊文思蓝染料，该染料能快速与血清白蛋白结合，证实在灌注区域的所有皮层层都存在BBB开放(图1a、 b条). 在大多数情况下，Evans blue局限于骨窗下的皮质区域，尽管在少数情况下，更广泛的区域显示BBB破坏可能是由胆汁盐扩散引起的。显微镜下分析组织切片和脑匀浆中的伊文思蓝荧光，以确定白蛋白从毛细血管向脑实质的外渗(图1c-e公司). 定量分析证实，相对于同一半球的未处理区域或在类似骨窗下灌注aCSF的假手术对侧皮质，经处理的皮质染色显著增加(图1e（电子）) (n个=5只动物）。胆汁盐灌注60分钟后，BBB明显开放(n个=5只动物），治疗后6天仍然明显，但不是16天(图1b、 （f）) (n个=6）。为了进一步排除胆盐的直接神经毒性，我们从保留的皮质切片中记录在体外在存在类似胆汁盐浓度的情况下。在3 m冲洗期间，从4层II和4层V常规尖峰神经元获得细胞内记录30-60 min米DHC公司。观察到稳定的静息电位（-73.3±1.4）、输入电阻（aCSF为37.8±4.2 MΩ，DHC为38.1±4.6 MΩ）、阈上和阈上刺激的放电特性以及细胞外刺激的诱发突触反应(图2). 细胞外记录进一步显示，在大范围胆汁盐浓度下，即使神经元暴露于较高浓度（4-6 m），诱发的神经元活动也没有变化米)胆汁盐的含量高于本研究中用于打开BBB的胆汁盐(图2b、 d日DOC结果未显示）(n个=11只动物15片）。在较高浓度下（>10 m米)胆汁盐引起诱发反应振幅降低，但从未诱发癫痫样活动。由于DHC和DOC对BBB开放或皮层电生理反应的影响没有发现差异，因此在研究的剩余部分将两种实验程序的数据合并。

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图1。

胆汁盐诱导长期BBB开放。a、 b条大鼠腹腔注射白蛋白结合染料伊文思蓝；图片显示大脑1小时(一)和7天(b条)局部皮质灌注DHC后。在这两个时间间隔内，Evans蓝-白蛋白复合物渗出到治疗区域内的薄壁组织，表明存在开放性BBB。c、 d日在荧光下，在处理过的皮层中可以看到伊文斯蓝-白蛋白复合物的微观外渗（红色），但在手术对侧窗的皮层中看不到。e、，左侧内侧（假手术）、右侧（未治疗）和右侧内侧（治疗）躯体感觉皮层切片的定量图像分析(n个＝来自每个区域的50个切片）在处理的区域中显示出增强的染色。f、，对照组和治疗组组织中伊文思蓝白蛋白含量的光度分析。在治疗后1小时和6天测量增强吸光度。^*第页< 0.05;^**第页<0.001（与对照值相比）。

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图2。

胆汁盐不会引起神经元毒性或癫痫样活动体外试验。a、，在aCSF（对照）下和在3m下40分钟，V层神经元对注入电流脉冲的反应的细胞内记录米DHC公司。b、，来自同一神经元的同时细胞外（顶部迹线）和细胞内（底部迹线）记录一，以响应强度增加的白质刺激。c、 I-V型DHC水洗前后的曲线。输入电阻没有变化。日期：，定量分析不同刺激强度和DHC浓度下七个切片的场电位积分。将响应归一化为每个切片的控制值。

BBB受损皮层的电生理活动

为了测试BBB中断的长期影响，我们记录了盐敷后不同时间间隔（2小时至49天）102个新皮质切片（41只动物）的电生理活动。在对照新皮质薄片中，短暂刺激白质可诱发典型的快速（<50毫秒）突触反应。这种反应代表了平均的快速兴奋性和抑制性突触后电位序列，它表征了大脑皮层对皮层内刺激的反应在体外切片制备(Connors等人，1982年). 计算早期诱发电位的振幅和积分（刺激后<50毫秒）表明，在治疗和非手术切片中，随着刺激强度的增加，振幅和积分呈线性增加(n个分别为32片和19片）。在处理过的切片中，反应强度曲线的最大斜率显著增大(第页<0.05）比假手术大鼠切片(图3d日)与峰值时间减少相关（DOC处理的切片为1.10±0.27 msec，假手术组为2.33 msec；第页<0.01），表明局部兴奋性增加。从BBB开放后的第四天起，早期诱发反应后出现阵发性全或单长时程（100-500毫秒）场电位(图3b条). 在接受治疗的大鼠93个切片中的64个（68.8%的切片；36只动物中的33个）观察到这种异常活动，并且总是局限于接受治疗的皮层区域。相比之下，在19个假手术大鼠切片中仅在2个切片中观察到发作事件（10.5%的切片；6只动物中的一只；Pearsonχ²;第页< 0.001). 细胞外电极和细胞内电极的同步记录显示，在治疗皮层的扩展区域同步产生阵发性反应(图3c). 在所有刺激强度下，治疗切片的晚期发作反应积分（刺激伪影后50-500毫秒）显著大于低强度刺激（<5×我_门槛) (图3e（电子）). 在同一垂直轴的所有皮层层（即皮层柱，数据未显示）中同步诱发阵发性活动，尽管它可以通过刺激相邻的未处理皮层柱触发并沿处理区域（3-5mm）传播，但它从未传播到健康皮层(图3一). 在13只接受治疗的大鼠中，有4只在切片中记录到了自发的发作间期样活动，但在非手术大鼠中从未记录到这种活动（见下文和图5e（电子）).

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图3。

BBB破坏皮层的电生理反应。a、，在BBB处理的以及未处理的手术和假手术动物皮层区域的切片上进行电生理记录。在血脑屏障处理区，白质刺激引起的典型电位（St₁)显示了一个早期、短持续时间的潜在事件，然后是一个延迟时间可变的晚期、长持续时间事件。刺激治疗区域外的白质（St₂)通常诱发的延迟性发作活动仅限于治疗区域。b、，治疗4天后，首次在切片中记录发作事件。缩放是指一和b条.c、，对三个连续的细胞外刺激（0.1 Hz）的重叠轨迹反应；细胞外（底部）和细胞内记录（顶部）显示突触阵发性反应是同步诱发的。电极间距为～300μm。d、 e（电子），早期的积分(d日刺激伪影后<50msec，将每个切片的值标准化为最大响应）和延迟(e（电子），50-500 msec）在增加刺激强度（标准化为阈值强度：我_门槛).T型，已处理；S公司，假手术；N个，非操作。

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图5。

阵发性活动与GABA介导的抑制有关：a、，同时显示细胞内（顶部迹线）和细胞外记录（Fp，底部迹线）对细胞外刺激的响应。与静息电位相关的不同膜电压下显示了对连续刺激的反应(V（V）_第页=-70毫伏）。b、，同时从同一切片的未处理和处理的体感皮层进行细胞外记录。叠加痕迹显示在aCSF（CON）和添加荷包牡丹碱（BIC）后40分钟。注意切片处理区域记录的场电位中的增强负偏转。c、，灌注含荷包牡丹碱的aCSF期间，自发发作间期样癫痫样活动的切片记录。注意最初的抑制，随后出现频率和自发活动幅度增加。日期：，荷包牡丹碱灌注期间的细胞外记录与发作活动的持续时间和振幅（20′）的最初减少有关，随后出现大场电位（40′）。e、，荷包牡丹碱作用下早期和晚期诱发反应积分的定量分析(n个= 4; 见结果）。^*第页<0.05（与对照值相比）。

癫痫活动的神经传递

为了进一步研究发作事件背后的递质系统，我们将处理过的切片暴露于主要突触受体的拮抗剂。AMPA-KA介导受体的阻断剂，CNQX（10μ米)，显著降低了早期非阵发性和晚期阵发性反应的振幅（灌注20min内分别降低至对照值的51%和20%；第页< 0.05) (图4a、 b条). NMDA拮抗剂APV（50μ米)，将阵发性反应的振幅可逆地降低到其原始值的35%(图4c、 d日). 然而，这种效果并不完全，因为在大多数切片中，即使在与拮抗剂灌注60分钟后，通过增加刺激强度或成对刺激（数据未显示），仍然可以诱发小的阵发性事件。与CNQX不同，APV对早期诱发反应没有影响，强调了每种反应的不同性质。

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图4。

AMPA-KA或NMDA受体拮抗剂阻断了阵发性反应。a、 b条在aCSF（CON）下显示阵发性活动的切片上灌注30μ米阻断AMPA-KA受体。通过测量最大反应的积分，显示了晚期发作事件（中间轨迹和黑色条）的消失和早期电位（白色条）的显著降低。这种影响是部分可逆的。c、 d日，NMDA受体被APV阻断（30μ米). 虽然早期PSP没有受到影响，但晚期发作活动明显减少。这种效应是完全可逆的。^*第页<0.05（与对照值相比）。

在BBB处理的皮层中的几个细胞内和细胞外双重记录中，群体的阵发性活动表现为去极化电位，在棘波阈值以下出现明显逆转(图5一)，表明GABA介导的Cl参与^-皮层超同步电位。事实上，在灌注液中添加GABA-A拮抗剂荷包牡丹碱，如预期的那样，产生了大的、持续时间长的场电位(Gutnick等人，1982年). 重要的是，在同一切片的处理区和非处理区同时记录显示，荷包牡丹碱（5μ米)在治疗区域更明显(图5b条). 这一结果表明，GABA介导的抑制能有效抑制增强的兴奋性传递。荷包牡丹碱的作用进一步支持了GABA介导的抑制作用参与癫痫样活动。两者都是自发的(图5c)和诱发活动(图5d、 电子)最初通过向aCSF中添加荷包牡丹碱而被抑制。图5e（电子）显示了晚期发作事件下面积的定量分析，显示在添加荷包牡丹碱10分钟后，所有切片的平均值均减少至其原始值的47%(n个= 4). 随着灌注时间的增加（对应于荷包牡丹碱浓度的增加），阵发性反应被高振幅、长时程电位所取代(图5b、 d日).

癫痫灶形成的机制

我们假设BBB开放后皮质功能障碍是由于大脑暴露于血清成分所致。为了排除这是特定胆盐效应的可能性，用大鼠血清直接灌注大鼠皮层。治疗一周后67%的切片(n个=18片；四只动物）表现出阵发性活动。类似结果（77%；n个= 13; 四只动物）在皮质暴露于变性血清（在70°C下孵育1小时）或0.4、0.2或0.1 m米aCSF中的白蛋白（分别为血清白蛋白水平的100、50和25%）。将白蛋白浓度降至血清水平的10%导致25人中的4人（16%；n个=5只动物）测试切片，与假手术对照组无显著差异(图6b条). 通过显微镜检查用含有aCSF的白蛋白伊文思蓝处理的皮质切片，验证了白蛋白对皮质的渗透性(图6c). 含有血清电解质水平的溶液（aSERUM）显示所有治疗切片的反应正常(图6a、 b条). 为了测试脑细胞外间隙白蛋白浓度增加可能打开血脑屏障的可能性，我们测量了局部灌注含aCSF的白蛋白（0.1 m）后Evans蓝白蛋白进入脑的渗透性米)解决方案。除一只动物外，所有动物的伊文斯蓝-白蛋白复合物对大脑的外显率均无明显增加(n个=6）局部灌注含白蛋白（0.1 m米)通过显微照片的定量分析和定量荧光法评估检测到的溶液。因此，我们可以排除白蛋白对血脑屏障通透性的直接影响(图6c，天).

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图6。

BBB诱导癫痫样活动的机制。a、，用aCSF（假手术）、胆汁盐（BS）、血清、变性血清（D-血清）、具有血清浓度的电解质溶液（血清）和增加浓度的血清白蛋白（白蛋白）灌注体感皮层。显示治疗后7天细胞外记录的典型痕迹。b、，量化所有切片中晚期诱发反应的平均积分（白色条）和观察到阵发性活动的切片百分比（灰色条）。记录白蛋白浓度（100%代表血清水平）。n个指在每个实验条件下检查的切片数。c、，局部灌注白蛋白-Evans蓝溶液导致白蛋白渗入同侧（治疗）大脑半球皮层。在另一个实验中，腹腔注射Evans蓝后，与白蛋白处理的半球相比，DOC处理的半球中荧光白蛋白的外渗更为显著。白色条表示平均颜色强度值(n个=每个实验20个部分）。日期：，非治疗（对照）、非手术、白蛋白和DOC治疗的大脑中Evans蓝白蛋白脑浓度的光度定量。注意，只有DOC处理导致染料渗透性显著增加。插图，双侧颅窗手术后的大脑和腹腔注射伊文思蓝。右半球灌注白蛋白，左半球灌注DOC。^*第页< 0.05;^**第页< 0.01.

因为我们的数据表明，最丰富的血清蛋白白蛋白会诱发癫痫，所以我们研究了白蛋白对细胞外和细胞内活性的直接影响。皮质切片灌注在体外白蛋白作用2小时后，诱发活动没有明显变化。在0.1 m的情况下进行长达1小时的细胞内记录米血清白蛋白显示稳定的静息电位（-74.9±1.2 mV；n个=8）输入电阻无变化（45.5±10.5 vs 45.7±10.2 MΩ；第页>0.1）、放电特性或诱发突触电位(n个= 8). 因此，我们的数据表明，BBB开放后的癫痫发生与转录翻译水平调节的缓慢过程有关，由脑细胞外液中蛋白质浓度增加触发（见讨论）。

我们进一步使用组织学染色检测胆汁盐或白蛋白治疗后细胞元素的渗透和/或细胞丢失。在任何一种治疗（1-2天，n个= 6; 4-6天，n个= 4; 9-14天n个= 3). 对嗜酸损伤神经元敏感的标准苏木精或钒酸品红苯胺蓝法(Victorov等人，2000年)-主要在治疗后48小时出现轻微脑水肿，但未发现正常皮层结构的任何损失或神经元损伤的证据(图7a、 b条). 此外，在治疗区域未检测到细胞数量减少或红细胞或白细胞渗透(图7e（电子）). 通过使用针对CD40和GFS-IB4的抗体进行免疫染色，在接受治疗的大脑皮层中未检测到与未接受治疗的对侧半球显著不同的炎症细胞。相反，从治疗后第1天起，DHC和蛋白处理的皮质中都观察到显著增强的GFAP染色，提示星形胶质细胞活化。治疗后2天和14天，GFAP细胞计数显著增加（分别占所有计数细胞的11和6.02%，而对侧非治疗区为2.05%；第页< 0.05) (图7b、 c（c）). 这些数据表明，打开血脑屏障导致蛋白质渗透到大脑细胞外空间，随后出现快速星形细胞反应和延迟癫痫发生（见讨论）。

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图7。

局部皮质灌注DHC或白蛋白可引起星形胶质细胞活化，且无神经元丢失。a、 b条治疗24小时后的组织切片显示治疗半球有轻微的细胞外水肿，而皮质结构则正常。箭头指向治疗后暴露的皮层区域。条形图表示组织学切片2和14d的细胞计数(n个＝6个），与对侧未处理区域相比的百分比。c、 d日用白蛋白灌注48小时后的冠状切片，低倍镜下显示正常的皮质结构。黑匣子代表放大后观察到的皮层区域d、e、，在大倍率下观察到正常的皮层结构。注意，典型的皮质毛细血管显示血细胞局限于血管腔。f、，相比之下，创伤性皮质损伤24小时后，在皮质组织中观察到血细胞外渗（有关方法细节，请参阅Eyupoglu等人，2003年).g、 小时与未经处理的对侧皮层相比，经白蛋白处理的皮层中GFAP染色的星形胶质细胞数量显著增加。条形图表示第2天和第14天组织切片中计数的GFAP阳性细胞（占对侧半球的百分比）(n个=6个）。

讨论

我们的数据表明：（1）持续的血脑屏障破坏导致以癫痫样发作性超同步活动为特征的迟发性皮层功能障碍；（2） 异常发作活动是焦点，仅限于治疗区域；（3） AMPA-KA以及NMDA和GABA受体参与了在BBB破坏的皮层中观察到的癫痫样活动的产生；（4）皮层暴露于低水平血清白蛋白足以诱导星形胶质细胞的早期和部分可逆活化，继而出现迟发性和持久性癫痫样活动。

丰富的临床和病理数据表明，在各种神经状况下BBB的破坏可能是疾病过程的基础或促成因素。此外，后天性癫痫的大多数甚至所有常见病因（如创伤、神经外科、感染和肿瘤；纳谢夫，1996年)经常与BBB开放相关（有关审查，请参阅Ballabh等人，2004年). 然而，到目前为止，还没有关于血脑屏障破坏是否、程度或持续时间先于人类患者获得性癫痫的发生的数据。之前已经提出了对BBB失调在不同癫痫中可能扮演的角色的担忧(1999年1月)在超微结构研究的基础上。在这些研究中，他们观察到，与对照组相比，人类癫痫组织中的微粒细胞增多，内皮细胞中线粒体数量减少，基底膜增厚，紧密连接异常(Kasantikul等人，1983年;康福德和奥尔登多夫，1986年). 在我们的研究中，我们发现在BBB开放后4-49天的大多数皮质切片中存在发作间期样癫痫样放电，包括部分切片中的自发癫痫样放电。这表明BBB功能障碍可能引发皮层重组和局灶性癫痫。尽管其他人之前曾报道过（Zappulla等人。，1985年,b条)局部或颈动脉内胆汁盐应用可诱导立即癫痫样活动体内这些研究使用了100倍高浓度的盐，由于它们的去污作用，这些盐已被证明会直接损伤细胞膜(Greenwood等人，1991年). 为了消除和控制这种影响，我们使用了相当低的胆汁盐浓度（<3 m米)打开BBB，对皮层结构或电生理反应（包括被动膜特性、放电特性和维持的皮层切片中的突触反应）没有同时影响在体外(图2). 我们发现，局部应用血清、变性血清或含蛋白溶液也会诱发癫痫，这证实了我们的假设，即癫痫的发生并非胆汁盐的特异反应，而是大脑细胞外空间暴露于血清蛋白所致。

血脑屏障开放后的皮层反应通常是延迟的，表现为多相的，持续时间延长（100-500毫秒），性质上是发作性的。在低刺激强度下，它们以完整尺寸出现，当刺激强度增加时，它们的振幅降低或被阻断(图3e（电子）). 因此，BBB治疗区记录的发作事件与慢性癫痫动物模型皮质切片中描述的发作事件相似（例如，慢性损伤的皮质：Prince and Tseng，1993年;Jacobs等人，1996年; 化学引燃：Barkai等人，1994年; 或毛果芸香碱治疗：Sanabria等人，2002年). 治疗后皮层癫痫样活动的一个重要特征是GABA介导的抑制作用显著。细胞内记录通常显示出与细胞外发作事件同步的去极化抑制性突触后电位（具有～60 mV的逆转电位）。细胞外记录进一步表明，抑制性传播参与了发作性事件，因为这些事件的振幅和持续时间减少，并且在自发时，低浓度GABA-A受体拮抗剂的出现频率降低。用高浓度GABA-A受体拮抗剂处理的皮层中谷氨酸能兴奋增强表明，抑制传递足以部分抑制兴奋增强。这些发现与之前对慢性损伤皮层的解剖学研究一致，这些研究表明树突轴对称性突触增加(拉特利奇，1978年)生理学研究表明，V层锥体神经元的抑制性突触电流增加(Prince等人，1997年). 相反，最近对慢性损伤皮层的定量研究表明，AMPA-KA受体介导的兴奋和GABA-a受体介介导的抑制之间的比率增加(李和普林斯，2002年). 需要进一步研究来阐明BBB治疗的皮层中兴奋性和抑制性受体以及突触连接的这些变化，并将这些变化与其他癫痫模型进行比较。

从治疗后第4天开始观察BBB中断后的皮层功能障碍。虽然这种延迟与之前使用豚鼠部分失聪皮层局灶性癫痫模型的研究结果一致(霍夫曼等人，1994年)在异常活动发生前1-2周，这种延迟与最近关于猫孤立皮层的报道有所不同，后者是在创伤模型中损伤后几小时内观察到癫痫样活动(Topolnik等人，2003年). 尽管这可能反映了方法上的差异或物种特异性，但更可能的是，急性发作活动和创伤后几天或几周出现的发作活动有两种不同的机制。后者可能与基因表达和局部回路重组的变化有关。这一观点得到了两种动物轴突萌芽和突触变化的解剖学数据的支持(Purpura和Houdailan，1961年)和人类(Castejon等人，2002年)癫痫皮层。此外，临床数据表明，早期和迟发性癫痫在特征和抗癫痫药物反应方面存在差异(赫尔曼，2002年). 值得注意的是，导致延迟性癫痫发作的不同侮辱（例如中风、外伤、脑感染）都与BBB开放有关。由于缺乏一种有效的方法来关闭BBB，因此很难设计一种实验方案来检测其他因素（神经元损伤、断流和/或失神经）对皮层重组的影响。然而，本研究表明，BBB本身的破坏可能导致皮层功能障碍，在BBB恢复正常后，这种功能障碍会持续存在。

大脑细胞外液和血液成分之间的许多重要差异可以在启动皮层重组时考虑。然而，我们的实验表明，尽管BBB的破坏与Evans蓝白蛋白渗透到细胞外空间有关，但并没有导致可检测到的炎症反应或红细胞积聚。白蛋白在癫痫发生中的作用也得到了实验的支持，实验表明血清白蛋白足以以剂量依赖的方式诱导局灶性癫痫样活动。由于变性血清在诱导皮层功能障碍方面同样有效，因此白蛋白的作用很可能归因于脑细胞外空间中蛋白质浓度的增加。

细胞外空间蛋白水平升高导致癫痫活动延迟的机制尚不清楚。脑片暴露于胆汁盐或白蛋白并没有触发癫痫活动，这表明BBB开放诱导的重组不是由反复发作触发的。这也得到了应力诱导血脑屏障开放期间脑电图记录的支持(沙尔马，2004年)根据我们自己的观察（J.P.Dreier和A.Friedman，未发表的数据）。此外，严重的细胞损伤或死亡也不能解释癫痫的发生(图7)尽管此前已有研究表明血管源性水肿可能与受损神经元胞浆中血清蛋白的积聚有关(Loberg等人，1994年)然后是细胞色素释放和DNA断裂(Matz等人，2001年). 虽然没有发现细胞丢失，但我们在这里显示的强化GFAP染色仅限于BBB破坏的皮层。培养物中星形胶质细胞的激活(Perillan等人，1999年)或在冷冻损伤诱导的发育不良大鼠新皮质中(Bordey等人，2001年)与内向整流钾降低有关⁺电流。有趣的是，在人类癫痫灶中，星形胶质细胞被GFAP强烈染色，并表达增加的钠⁺至K⁺电导比与人或大鼠非癫痫皮质的比较(Bordey and Sontheimer，1998年). 星形细胞功能的这种变化可能会导致急性期和急性期的过度兴奋(Janigro等人，1997年)和慢性(Heinemann等人，2000年)癫痫组织。重要的是，BBB治疗24小时后，大脑皮层中的星形胶质细胞激活显著，而癫痫活动尚未记录。这与最近研究显示反应性星形胶质细胞与受损的K相一致⁺流体冲击伤后2d大鼠海马缓冲区的变化(D'Ambrosio等人，1999年). 未来的研究需要探索星形胶质细胞的早期激活和功能障碍在癫痫发生中的作用。

总之，本研究首次证明，由于BBB的破坏，内源性血清衍生成分进入神经网络，从而诱导癫痫样活动。此外，我们的数据表明，血清白蛋白足以诱发迟发性癫痫灶，并强调血脑屏障作为部分性癫痫防治研究的新靶点的重要性。

脚注

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